藏藥余甘子鞣質(zhì)部位對大鼠肝微粒體代謝酶P450活性的影響＊

崔雅萍，楊光輝，亓 旗，吳玲芳，陳文靜，梁文儀，李 師，張?zhí)m珍

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100102）

藏藥余甘子鞣質(zhì)部位對大鼠肝微粒體代謝酶P450活性的影響＊

崔雅萍，楊光輝，亓 旗，吳玲芳，陳文靜，梁文儀，李 師，張?zhí)m珍＊＊

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100102）

目的：考察藏藥余甘子鞣質(zhì)部位對大鼠肝微粒體代謝酶P450活性的影響。方法：采用“Cocktail”探針底物與大鼠肝微粒體體外溫孵法，通過HPLC同時(shí)測定6種探針?biāo)幬锇北巾?、氫溴酸右美沙芬、香豆素、非那西丁、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲的代謝消除率，評價(jià)余甘子鞣質(zhì)部位對P450酶中CYP3A4、CYP2D6、CYP2A6、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9 亞酶活性的影響。結(jié)果：余甘子鞣質(zhì)部位對P450酶影響較小，CYP3A4，CYP1A2的IC50值超過200 μg·mL-1，CYP2C9的IC50值超過500 μg·mL-1。結(jié)論：藏藥余甘子鞣質(zhì)部位對肝P450酶活性影響較弱。

余甘子鞣質(zhì)部位 大鼠肝微粒體 代謝酶P450 活性

余甘子（Phyllanthi Fructus）為大戟科植物余甘子Phyllanthus emblica L.的干燥成熟果實(shí)，系藏族習(xí)用藥材[1]。鞣質(zhì)及酚酸類成分為其主要成分，具有抗脂質(zhì)過氧化、抗腫瘤、抗癌、護(hù)肝益腎、抗病毒、抗菌等作用[2]。

藏藥主要以復(fù)方形式應(yīng)用，也作為輔助藥物與西藥同時(shí)服用。藏藥成分間的相互作用以及藏藥-西藥藥物相互作用報(bào)道較少。抑制或誘導(dǎo)P450酶都可能產(chǎn)生相應(yīng)的藥物-藥物相互作用，增加患者的治療風(fēng)險(xiǎn)。在臨床用藥過程中，藥物對P450酶抑制作用的危害遠(yuǎn)大于誘導(dǎo)作用，尤其是與部分治療窗狹窄的藥合用會(huì)導(dǎo)致中毒[3]。CYP450各亞型活性的變化會(huì)導(dǎo)致由相關(guān)亞型代謝的藥物血漿濃度過高或過低，從而影響臨床治療效果[4-7]。

本實(shí)驗(yàn)采用“Cocktail”探針?biāo)幬锓ǎY(jié)合HPLC技術(shù)進(jìn)行余甘子鞣質(zhì)部位大鼠肝微粒體體外溫孵研究，評價(jià)其對P450酶活性的影響，為研究余甘子鞣質(zhì)部位體內(nèi)成分代謝提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 1525型高效液相色譜儀（PAD檢測器；Empower軟件）；氮吹儀（EYELA MG -2200）；水浴鍋（科偉HH-4）；渦旋混合器（北京北德科學(xué)器材有限公司）。

1.2 試藥

甲醇（美國Fisher公司，色譜純）；蒸餾水（哇哈哈純凈水）；氨苯砜（批號：142160）、氫溴酸右美沙芬（批號：KGC1-4EJ3）、香豆素（批號：1001833416）、非那西?。ㄅ枺?7440）、氯唑沙宗（批號：481850）、甲苯磺丁脲（批號：301955）、五味子醇甲（批號：110857-201111）、酮康唑（批號：973125）、奎尼?。ㄅ枺?16807）、反苯環(huán)丙胺（批號：834733）、α-萘黃酮（批號：1001977041）、二乙基二硫代甲酸鈉（批號：100183505）、氟康唑（批號：433638）等原料藥；NADPNa2（批號：11012231001）、六磷酸葡萄糖（批號：B6146）、六磷酸葡萄糖脫氫酶批號（1001293755）、MgCl2（批號：2105-100）均購于北京拜爾迪醫(yī)藥技術(shù)有限公司；SD大鼠肝微粒體為實(shí)驗(yàn)室自制，蛋白含量為34.52 mg·mL-1。

余甘子藥材購自于西藏藏醫(yī)院，產(chǎn)地尼泊爾。經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)閻玉凝教授鑒定為大戟科葉下珠屬植物余甘子Phyllanthus emblica L.的干燥成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 “Cocktail”探針?biāo)幬锓ǖ慕?/p>

2.1.1 溶液的配置

取氨苯砜、氫溴酸右美沙芬、香豆素、非那西丁、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲適量于10 mL容量瓶中，甲醇定容，配成各探針濃度分別為10 mmol·L-1、4 mmol·L-1、4 mmol·L-1、10 mmol·L-1、10 mmol·L-1、4 mmol·L-1的混合探針溶液，作為儲備液備用。五味子醇甲（內(nèi)標(biāo)物）：取4.01 mg，10 mL容量瓶中甲醇定容。

NADPH再生系統(tǒng)：含2 mmol·L-1NADPNa2，20 mmol·L-1六磷酸葡萄糖，2 u·mL-1六磷酸葡萄糖脫氫酶，20 mmol·L-1MgCl2。

2.1.2 肝微粒體體外溫孵反應(yīng)

將混合探針儲備液適量稀釋200倍后，取100 μL于2 mLEP管中，氮?dú)獯蹈?，加入Tris-HCL緩沖液溶解的肝微粒體（2 mg·mL-1）100 μL，于37 ℃水浴中預(yù)溫孵5 min，加入100 μL NADPH再生系統(tǒng)啟動(dòng)反應(yīng)，反應(yīng)體系總體積為200 μL，包含SD大鼠肝微粒體蛋白1 mg·mL-1，NADPH 再生系統(tǒng)（1 mmol·L-1NADPNa2、10 mmol·L-1六磷酸葡萄糖、1 u·mL-1六磷酸葡萄糖脫氫酶、10 mmol·L-1MgCl2）以及6種混合探針底物：氨苯砜、氫溴酸右美沙芬、香豆素、非那西丁、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲（終濃度分別為: 25、10、10、25、25、10 μmol·mL-1），溫孵時(shí)間30 min。

2.1.3 樣品處理方法

溫孵30 min后在反應(yīng)體系中按1:3比例加入冰甲醇結(jié)束反應(yīng)，加入內(nèi)標(biāo)物（五味子醇甲0.4 mg·mL-1）50 μL，渦旋3 min，4 ℃，12 000 g·min-1離心20 min，取上清液，氮?dú)獯蹈桑?00 μL50%甲醇復(fù)溶，4 ℃，12 000 g·min-1離心20 min，20 μL進(jìn)HPLC分析。

2.1.4 色譜條件

Diamonsil C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），流速：1 mL·min-1，柱溫：35 ℃，流動(dòng)相：甲醇-0. 2%冰醋酸溶液，梯度洗脫，進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.5 專屬性考察

按照2.1.4 HPLC-UV條件，測定空白肝微粒體、空白肝微粒體中加入探針底物和內(nèi)標(biāo)物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白肝微粒體所含內(nèi)源性物質(zhì)不干擾探針?biāo)幬锖蛢?nèi)標(biāo)物的測定，7個(gè)被測成分峰形良好，符合測定要求。

2.1.6 肝微粒體溫孵體系酶濃度和溫孵時(shí)間的確定

控制肝微粒溫孵時(shí)間，以探針?biāo)幬锇北巾繛榈孜?，設(shè)置體系肝微粒體濃度分別為0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mg·mL-1考察肝微粒體濃度對代謝反應(yīng)的影響。結(jié)果如表1和圖2所示。

控制肝酶濃度，以探針?biāo)幬锇北巾繛榈孜?，設(shè)置溫孵時(shí)間分別為5、10、20、30、60、120 min考察溫孵時(shí)間對代謝反應(yīng)的影響。結(jié)果如表2和圖3所示。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，反應(yīng)體系中肝酶濃度達(dá)1 mg·mL-1、溫孵時(shí)間為30 min時(shí)，底物代謝趨于平緩，因而確定為實(shí)驗(yàn)條件。

2.1.7 方法學(xué)驗(yàn)證

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

采用倍半稀釋法，將探針?biāo)幬锏膬淙芤号渲瞥梢幌盗刑荻葷舛鹊摹癈ocktail”探針混合溶液：氨苯砜（6.25、10.00、16.70、25.00、50.00、100.00 μmol·L-1）；氫溴酸右美沙芬（2.5、4.0、6.7、10.0、20.0、40.0 μmol·L-1）；香豆素（2.5、4.0、6.7、10.0、20.0、40.0 μmol·L-1）；非那西?。?.25、10.00、16.70、25.00、50.00、100.00 μmol·L-1）；氯唑沙宗（6.25、10.00、16.70、25.00、50.00、100.00 μmol·L-1）；甲苯磺丁脲（2.5、4.0、6.7、10.0、20.0、40.0 μmol·L-1）。

取稀釋梯度濃度的混合探針，用滅活的肝微粒體按2.1.2項(xiàng)下溫孵方法進(jìn)行溫孵實(shí)驗(yàn)。分別繪制6種探針?biāo)幬飿?biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表4。

（2）精密度和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

分別取低、中、高3個(gè)濃度的混合探針?biāo)幬?00 μL于EP管中，氮?dú)獯蹈?，加入滅活肝?00 μL溶解，按2.1.3項(xiàng)下方法處理樣品，配置探針?biāo)幬锏?、中、高三個(gè)濃度的基質(zhì)混合對照品，每個(gè)樣本平行制備3份。同一樣品于同日內(nèi)測定連續(xù)測定6次，計(jì)算日內(nèi)精密度，連續(xù)3天內(nèi)測定3次，計(jì)算日間精密度。將樣本放置24 h后測定，考察樣本在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示6種探針?biāo)幬餃y定的日內(nèi)精密度和日間精密度良好，RSD均小于6%，樣本24 h穩(wěn)定性良好，RSD均小于5%，符合樣本含量測定的要求。

圖1 空白肝微粒體加混合探針和內(nèi)標(biāo)物HPLC色譜圖

表1 肝微粒體濃度對探針底物代謝消除率的影響/%

表2 肝微粒體溫孵時(shí)間對探針底物代謝消除率的影響/%

表3 肝微粒體中各探針?biāo)幬飿?biāo)準(zhǔn)曲線方程式

圖2 混合探針代謝率變化圖

圖3 混合探針代謝率變化圖

（3）回收率實(shí)驗(yàn)

按（2）項(xiàng)下方法制備混合探針?biāo)幬锏?、中、?個(gè)濃度的基質(zhì)混合對照品，平行3組，另取相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣，計(jì)算絕對回收率。結(jié)果顯示6種探針?biāo)幬锏慕^對回收率均大于73.08%，且RSD均小于5%，符合樣本含量測定要求。

2.2 陽性抑制劑對大鼠肝微粒體代謝酶P450活性影響

2.2.1 陽性抑制劑對P450酶活性的抑制

選取添加陽性抑制劑與未加抑制劑的對照組進(jìn)行比較，以探針底物的代謝率來反映酶的活性，每個(gè)陽性抑制劑系列濃度均為0.01/0.1/1/10/100 μmol·L-1，平行做3份。

2.2.2 酶活性（control activity）的計(jì)算

使用已建立的HPLC法測定6種探針底物的峰面積，將其與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值代入各探針底物的肝微粒體標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出各探針底物濃度，以未加陽性抑制劑和受試中藥提取物的空白對照的活性為100%，計(jì)算各CYP450亞型在不同藥物作用下的相對酶活性。

2.2.3 抑制曲線及IC50值

采用Graphpad prism 5.0軟件進(jìn)行非線性回歸分析，將酶相對活性對各抑制劑濃度的對數(shù)值作圖，并計(jì)算IC50值。結(jié)果如表4和圖4所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，選用的各抑制劑的IC50值均小于5 μM，抑制作用效果良好。

2.3 余甘子鞣質(zhì)部位對肝微粒體代謝酶P450活性的影響

以余甘子鞣質(zhì)部位替換2.2項(xiàng)下孵育體系中的陽性抑制劑。余甘子鞣質(zhì)部位提取物的梯度終濃度為0.102、1.020、10.170、101.720、1 017.200 μg·mL-1?？瞻讓φ战M和實(shí)驗(yàn)組同時(shí)進(jìn)行，分別計(jì)算相應(yīng)的IC50值，結(jié)果如表5和圖5所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：余甘子鞣質(zhì)部位對于肝微粒體代謝酶P450各亞型的IC50值均大于50 μg·mL-1，且對CYP3A4、CYP1A2的IC50值超過200 μg·mL-1，對CYP2C9的IC50值超過500 μg·mL-1。

表4 添加陽性抑制劑后各P450酶亞型的相對酶活性(n=3)

表5 余甘子鞣質(zhì)部位對P450酶亞型的相對酶活性的影響(n=3)

圖4 陽性抑制劑抑制曲線(n=3)

3 討論

圖5 余甘子鞣質(zhì)部位抑制曲線(n=3)

依照通用的CYP450酶抑制劑強(qiáng)度分級規(guī)則[8，9]：當(dāng)某種中藥的提取物對P450酶亞型的半數(shù)抑制濃度IC50值小于10 μg·mL-1時(shí)，被認(rèn)為有很強(qiáng)的抑制作用，在臨床使用過程中發(fā)生藥物相互作用的可能性較大，結(jié)果可能使其他由CYP450酶代謝的藥物療效減弱甚至失效；當(dāng)IC50值介于10 μg·mL-1到50 μg·mL-1時(shí)，被認(rèn)為有明顯的抑制作用；當(dāng)IC50值介于100到200 μg·mL-1時(shí)，被認(rèn)為有微弱的抑制作用；當(dāng)IC50值大于200 μg·mL-1則認(rèn)為抑制作用不明顯，臨床聯(lián)合用藥相對安全。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明余甘子鞣質(zhì)部位對于肝微粒體代謝酶P450各亞型抑制作用的IC50值均大于50 μg·mL-1，且對CYP3A4、CYP1A2的IC50值超過200 μg·mL-1，對CYP2C9的IC50值超過500 μg·mL-1，說明余甘子鞣質(zhì)部位對于肝酶活性的抑制作用并不強(qiáng)烈，在臨床使用過程中發(fā)生藥物相互作用的可能性較小。余甘子鞣質(zhì)部位對肝微粒體P450代謝酶6種主要亞型的抑制作用不明顯，不易產(chǎn)生相應(yīng)的藥物-藥物相互作用。

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Effects of Tannins Extracted from Phyllanthi Fructus on the Activity of Cytochrome P450 Enzymes in Rats

Cui Yaping ,Yang Guanghui, Qi Qi,Wu Lingfang, Chen Wenjing, Liang Wenyi, Li Shi, Zhang Lanzhen
(School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

This study aimed to investigate the effects of tannins extracted from Tibetan medicine Phyllanthi Fructus on cytochrome P450 enzyme of liver microsomes in rats. Cocktail probe substrates were incubated with liver microsomes in vitro. Metabolic elimination percentages of the six probe substrates, including dapsone, dextromethorphan hydrobromide, coumarin, phenacetin, chlorzoxazone and tolbutamide, were determined by HPLC. The effects of tannins extracted from Tibetan medicine Phyllanthi Fructus on the enzymatic activity of rat liver microsomal P450s was evaluated. It was found that tannins extracted from Phyllanthi Fructus did not impact P450 enzymes. The IC50values of CYP3A4 and CYP1A2 were over 200 μg·mL-1, while the IC50 value of CYP2C9 was superior to 500 μg·mL-1. In conclusion, Tannins extracted from Tibetan medicine Phyllanthi Fructus did not significantly affect cytochrome P450 enzymes.

Tannins extracted from Phyllanthi Fructus, rat liver microsomes, metabolic enzyme P450, activity

（責(zé)任編輯：姜月瀅，責(zé)任譯審：朱黎婷）

10.11842/wst.2016.07.013

R282

A

2016-06-19

修回日期：2016-06-19

＊ 國家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目（81274187）：基于藏藥余甘子酚酸類成分體內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的抗癌藥效物質(zhì)與質(zhì)量控制研究，負(fù)責(zé)人：張?zhí)m珍。

＊＊ 通訊作者：張?zhí)m珍，本刊編委，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥和民族藥藥效物質(zhì)研究。