青錢柳多糖對(duì)H4IIE肝細(xì)胞胰島素信號(hào)傳遞的影響＊

許光遠(yuǎn)，孫 文，郭 璇，候 丹，吳麗麗，張 巖，張 茁，張 露，秦靈靈，李 博，李偉笠，劉銅華

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東方醫(yī)院 北京 100078；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)研究所 北京 100029；

3. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 咸陽(yáng) 712046；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)科技處 北京 100029；

5. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100029；712046；6. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院 北京 100700；7. 北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 北京 100078）

青錢柳多糖對(duì)H4IIE肝細(xì)胞胰島素信號(hào)傳遞的影響＊

許光遠(yuǎn)1，孫 文2，郭 璇1，候 丹3，吳麗麗2，張 巖1，張 茁3，張 露1，秦靈靈4，李 博5，李偉笠6，劉銅華7＊＊

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東方醫(yī)院 北京 100078；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)研究所 北京 100029；

3. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 咸陽(yáng) 712046；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)科技處 北京 100029；

5. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100029；712046；6. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院 北京 100700；7. 北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 北京 100078）

目的：觀察青錢柳多糖對(duì)肝細(xì)胞胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)鍵靶點(diǎn)基因、蛋白表達(dá)的影響。方法：以H4IIE大鼠肝細(xì)胞為模型，培養(yǎng)72 h后，采用Neutral Red法檢測(cè)青錢柳多糖（50、100、200、400 μg·mL-1）對(duì)細(xì)胞活性的影響；根據(jù)細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果分為正常對(duì)照組（Control組）、胰島素組（Insulin組）、青錢柳多糖低劑量組（LCP組）和高劑量組（HCP組）；藥物干預(yù)2 h后RT-PCR檢測(cè)肝細(xì)胞相應(yīng)基因表達(dá)，藥物干預(yù)30 min后，利用Western blot法檢測(cè)肝細(xì)胞相應(yīng)蛋白磷酸化水平。結(jié)果：與Control組比較，100、200、400 μg·mL-1青錢柳多糖干預(yù)后肝細(xì)胞活性顯著升高（P＜0.01）；干預(yù)2 h后，LCP組InsR、IRS-2基因表達(dá)顯著升高（P＜0.05），Insulin組和HCP組InsR、IRS-2基因表達(dá)極顯著升高（P＜0.01）；干預(yù)30 min后，Insulin組、HCP組InsR β、IRS-2、Akt蛋白磷酸化水平顯著升高（P＜0.01）。結(jié)論：青錢柳多糖具有增加肝細(xì)胞活性作用，其上調(diào)肝細(xì)胞胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵靶點(diǎn)InsR、IRS-2基因表達(dá)，以及InsR β、IRS-2、Akt蛋白磷酸化水平可能是其發(fā)揮降糖作用的機(jī)制。

青錢柳多糖 H4IIE肝細(xì)胞 胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路

隨著生活方式的改善，2型糖尿病已成為目前嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2011年中國(guó)糖尿病人數(shù)增長(zhǎng)速率達(dá)到9.7%，居世界首位，遠(yuǎn)高于世界平均增長(zhǎng)水平6.4%[1]。最新研究數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)糖尿病患者中95%以上為2型糖尿病[2]，因此，中國(guó)在2型糖尿病防治中面臨巨大壓力。

青錢柳Cyclocarya paliurus（Batal）Ijinskaja系胡桃科青錢柳屬落葉喬木，是中國(guó)特有樹(shù)種，其葉具有生津止渴、清熱解毒的功效，被稱為“甜茶”，民間多用于防治糖尿病[3]。現(xiàn)代藥理研究表明，青錢柳含有降糖、降壓、降脂等多種活性物質(zhì)[4]，其中多糖類在降糖方面功效尤為突出[5]，但作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)以H4IIE大鼠肝細(xì)胞為模型，觀察青錢柳多糖對(duì)其胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)鍵靶點(diǎn)基因、蛋白的影響，以探討青錢柳多糖的降糖機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞

大鼠肝癌細(xì)胞（H4IIE細(xì)胞），由日本武庫(kù)川女子大學(xué)東洋醫(yī)藥研究室贈(zèng)予。常規(guī)復(fù)蘇細(xì)胞，養(yǎng)于含10%FBS、1%青-鏈霉素的DMEM（1g·L-1葡萄糖）培養(yǎng)基，放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 儀器

酶標(biāo)儀GLOMA MULTI DETECTION SYSTEM（美國(guó)Promega公司）；PCR擴(kuò)增儀（ABI Prism 7500）；光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司，BX53型）；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)移槽（美國(guó)BIO-RAD公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司，ChemiDocTMXRS+with Image LabTMSoftware）細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司，HERA CELL 150i CO2incubator）。

1.3 試藥與藥材

青錢柳葉采自江西修水地區(qū)，青錢柳多糖（協(xié)和藥物研究所提供，含量約為8.11%，總糖部位多糖含量為75.34%）；FBS胎牛血清（美國(guó)gibco公司，批號(hào)：1744349）；DMEM培養(yǎng)基（日本京都Nacalai Tesque公司，批號(hào)：L4R2552）；諾和靈R生物合成人胰島素注射液（德國(guó)諾和諾德公司，批號(hào)：批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字J20100117）；p-InsRβ、t-InsRβ、p-IRS-2、t-IRS-2、p-Akt、t-Akt、β-actin抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司，批號(hào)：0011、0008、0005、0003、0014、0020、0013）；Block one（日本京都Nacalai Tesque公司，批號(hào)：L4E0085）；Block one-P（日本Nacalai Tesque公司，批號(hào)：L5G4440）；THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（日本TOYOBO公司）；RNA引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

2 方法

2.1 藥物提取

干燥的青錢柳葉粉碎成粗粉，用8倍量85%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮得醇提浸膏。將醇提浸膏混懸分散于40 L水中，用石油醚以1:1的體積比萃取3次，進(jìn)行脫脂處理。脫脂處理后，水部分減壓濃縮后進(jìn)行冷凍干燥得到該部位的干燥粉末。

2.2 H4IIE細(xì)胞活性檢測(cè)

采用Neutral Red法檢測(cè)H4IIE細(xì)胞活性。H4IIE細(xì)胞培養(yǎng)72 h后（培養(yǎng)基：DMEM+10%FBS+ 1%青-鏈霉素），待細(xì)胞長(zhǎng)至70%-80%，消化，稀釋為5×104cells·mL-1的細(xì)胞懸液，每孔1 mL加入12孔板，按加入不同濃度（50、100、200、400 μg·mL-1）的青錢柳多糖，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，PBS洗1次，加入50 μg·mL-1中性紅溶液培養(yǎng)3 h，PBS洗1次，加入中性紅溶解劑，540 nm測(cè)定OD，計(jì)算存活率：存活率=給藥組OD/對(duì)照組OD×100%。

2.3 細(xì)胞分組與給藥

H4IIE細(xì)胞以5×104cell·mL-1濃度接種于12孔板，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，分為4組，每組3個(gè)樣本，分組如下：正常對(duì)照組（Control組）：含5%FBS的DMEM；胰島素組（Insulin組）：100 nmol·L-1胰島素+含5%FBS的DMEM；青錢柳多糖低劑量組（LCP組）：200 μg·mL-1CP+含5%FBS的DMEM；青錢柳多糖高劑量組（HCP組）=400 μg·mL-1CP+含5%FBS的DMEM，按實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行培養(yǎng)。

2.4 H4IIE細(xì)胞RT-PCR檢測(cè)

給藥干預(yù)2 h后H4IIE細(xì)胞，PBS洗1次，按照RNA提取試劑盒提取RNA；其次，反轉(zhuǎn)錄，GoScript?Reverse Transcription System試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，退火25℃ 5 min，延伸42℃ 1 h，滅活70℃ 15 min，得到cDNA。20 μL反應(yīng)體系，2 μL cDNA稀釋液加入10 μLGoTaq反應(yīng)液、7.2 μL Nuclease-Free Water和0.8 μL引物混合物，置于Applied Biosystems 7 500 Real Time PCR System進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃1 min（共 40 次循環(huán)）；95℃15 s，60℃15 s溶解。引物如下：GAPDH上游引物5’- TGAAGCAGGCATCTGAGGG-3’，下游引物5’-CGAAGGTGGAAGAGTGGGAG-3’；InsR上游引物5’- TTTGTCATGGATGGAGGCTA -3’，下游引物5’- CCTCATCTTGGGGTTGAACT -3’；IRS-2上游引物5’- TCCTATCCCGAAGAGGGTCT -3’，下游引物5’- TGGGCATATAGCCATCATCA -3’。

2.5 H4IIE細(xì)胞Western blot檢測(cè)

按分組給藥處理30 min后，以Homoginized Buffer提取總蛋白，加2倍量的上樣緩沖液，100℃5 min 蛋白變性，上樣量每孔20 μg，100 V 2 h電泳，預(yù)處理PVDF膜及濾紙，半干法凝膠轉(zhuǎn)膜，100 A 1 h，膜在TBS溶液中室溫下?lián)u床洗15 min；Blocking one/ Blocking one-P封閉30 min，分別以p-InsRβ、t-InsRβ、p-IRS-2、t-IRS-2、p-Akt、t-Akt、β-actin等抗體（1:1 000稀釋）孵育，4℃過(guò)夜，洗膜后二抗（1:10 000）孵育，室溫1 h。洗膜后加ECL發(fā)光液，室溫反應(yīng)1 min，凝膠成像系統(tǒng)成像，蛋白條帶用Image J 7.0圖像分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）方法；兩組間比較，滿足方差齊性時(shí)用 LSD-t 檢驗(yàn)，不滿足方差齊性時(shí)用非參數(shù)檢驗(yàn)；P＜ 0.05 表示有顯著性差異，P＜0.01 表示有極顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度青錢柳多糖對(duì)H4IIE細(xì)胞活性的影響

H4IIE肝細(xì)胞長(zhǎng)至80%-90%，給予不同濃度的青錢柳多糖干預(yù)24 h，觀察細(xì)胞活性。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)所選用濃度中，青錢柳多糖無(wú)細(xì)胞毒作用，并表現(xiàn)出隨濃度升高活性增強(qiáng)的趨勢(shì)（P＜0.01）。因此，選擇作用于H4IIE 細(xì)胞活性最強(qiáng)的兩個(gè)濃度（200、400 μg·mL-1），進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)（表1）。

3.2 青錢柳多糖對(duì)H4IIE細(xì)胞 InsR、IRS-2 mRNA表達(dá)的影響

80%-90%H4IIE肝細(xì)胞按照分組給藥干預(yù)2 h，RT-PCR檢測(cè)青錢柳多糖對(duì)H4IIE肝細(xì)胞InsR、IRS-2 mRNA表達(dá)的影響。與Control組相比，Insulin組InsR、IRS-2 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），而LCP、HCP組也均顯著上調(diào)InsR、IRS-2 mRNA的表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），并呈現(xiàn)劑量依賴性升，提示青錢柳多糖能夠上調(diào)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)鍵靶點(diǎn)基因表達(dá)（表2）。

3.3 青錢柳多糖對(duì)H4IIE細(xì)胞InsRβ、IRS-2、Akt蛋白磷酸化的影響

胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路是調(diào)節(jié)糖代謝的重要途徑，其中InsRβ、IRS-2、Akt是該通路中關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白，其磷酸化是該通路發(fā)揮作用的重要標(biāo)志。H4IIE肝細(xì)胞按照分組給藥干預(yù)30 min后，檢測(cè)青錢柳多糖對(duì)p-InsRβ、t-InsRβ、p-IRS-2、t-IRS-2、p-Akt、t-Akt 蛋白表達(dá)的影響。與Control組相比，insulin組InsRβ、IRS-2、Akt蛋白磷酸化水平顯著升高（P＜ 0.05）；LCP、HCP組也顯著上調(diào)InsRβ、IRS-2、Akt蛋白磷酸化水平（P＜0.05，P＜0.01），提示青錢柳多糖能夠提高胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路靶點(diǎn)蛋白磷酸化水平（表3、圖1）。

4 討論

青錢柳多糖是青錢柳葉水提物中的一類重要生物活性物質(zhì)，其中含有多種成分，主要包括鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖[6]，此外還含有Ca、Al、Mg、K、Fe、Mn、P、Zn、Na、Se、Cr、Pb、Cu等多種微量元素[7]。研究發(fā)現(xiàn)，青錢柳多糖具有明確降糖作用[8]，能顯著增加IR-HepG2細(xì)胞的糖耗量，改善IR[9]；增加糖尿病小鼠肝糖原合成，抑制糖異生[10]。Kurihara H等[11]通過(guò)水煎、冷凍減壓得到青錢柳水提物，以表兒茶素（Epicatechin）作對(duì)照，發(fā)現(xiàn)其可能通過(guò)抑制α-葡萄糖苷酶活性發(fā)揮降糖作用。還有研究發(fā)現(xiàn)，青錢柳多糖對(duì)四氧嘧啶建立的糖尿病小鼠模型胰島細(xì)胞具有保護(hù)作用[12]。因此，青錢柳多糖具有多途徑降糖作用，但其具體分子作用機(jī)制尚不明確。

表1 青錢柳多糖對(duì)H4IIE細(xì)胞活性的影響(·x ± s，n=5)

表2 青錢柳多糖對(duì)H4IIE細(xì)胞InsR、IRS-2mRNA表達(dá)的影響(·x ± s，n=3)

圖1 青錢柳多糖對(duì)H4IIE細(xì)胞InsRβ、IRS-2、Akt蛋白磷酸化的影響

表3 青錢柳多糖對(duì)H4IIE細(xì)胞InsRβ、IRS-2、Akt蛋白磷酸化的影響(·x ± s，n=3)

胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路是胰島素在調(diào)節(jié)糖代謝中發(fā)揮作用的重要途徑，其信號(hào)傳遞減弱或障礙導(dǎo)致胰島素抵抗（Insulin Resistance，IR）發(fā)生，血糖升高。肝臟是胰島素作用的主要靶器官之一，肝細(xì)胞中胰島素信號(hào)傳導(dǎo)的異常對(duì)糖代謝產(chǎn)生重要影響。胰島素受體（Insulin Receptor，InsR）包括α和β兩個(gè)亞基，胰島素與α亞單位結(jié)合后使β亞基構(gòu)象改變而發(fā)生酪氨酸殘基磷酸化，激活I(lǐng)nsR[13]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制InsR的磷酸化，導(dǎo)致IR發(fā)生[14]。IRS是胰島素受體底物家族，包括IRS-1、IRS-2、 IRS-3、IRS-4等眾多亞型，其中IRS-2主要在肝臟表達(dá)[15]。IRS-2接受激活的InsR刺激后酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化[16]，從而活化下游分子PI3K、Akt，調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取以及糖原合成。在胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路中InsR、IRS-2、Akt等分子的磷酸化是其活化發(fā)揮作用的主要標(biāo)志，因此，其活化程度反映了胰島素信號(hào)的傳遞情況。本研究發(fā)現(xiàn)，在青錢柳多糖干預(yù)H4IIE細(xì)胞24 h后，InsR、IRS-2基因表達(dá)較對(duì)照組明顯上調(diào)；而在青錢柳多糖干預(yù)H4IIE細(xì)胞30 min后檢測(cè)InsRβ、IRS-2、Akt磷酸化水平發(fā)現(xiàn)青錢柳多糖高、低劑量組InsRβ、IRS-2、Akt磷酸化水平較對(duì)照組明顯上調(diào)；這提示青錢柳多糖能夠上調(diào)胰島素信號(hào)通路上關(guān)鍵靶點(diǎn)的基因表達(dá)及磷酸化水平，可能是其發(fā)揮降糖作用的機(jī)制。

綜上所述，青錢柳是民間常用降糖藥物，其多糖成分在既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中具有明確的降糖效果，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其能夠上調(diào)體外培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路上InsR、IRS-2基因表達(dá)和InsRβ、IRS-2、Akt蛋白磷酸化水平，可能是青錢柳多糖的降糖作用機(jī)制，為進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

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Impacts of Cyclocarya Paliurus Polysaccharide on Insulin Signaling Pathway in H4IIE Liver Cells

Xu Guangyuan1, Sun Wen2, Guo Xuan1, Hou Dan3, Wu Lili2, Zhang Yan1, Zhang Zhuo3, Zhang Lu1, Qin Lingling4, Li Bo5, Li Weili6, Liu Tonghua7
(1. Dongfang Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China;
2. Health-Cultivation Laboratory of the Ministry of Education, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029,China;
3. College of Clinical Medical, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 100029, China;
4. Department of Science and Technology, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100028, China;
5. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China;
6. Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China;
7. School of Graduates, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

This study aimed to explore the impacts of Cyclocarya paliurus polysaccharide (CP) on insulin signal pathway in liver cells. H4IIE liver cells of rat that cultivated for 72 h were made up for the model group. H4IIE cells at 70%-80% confluence were exposed to various concentrations of CP, including 50, 100, 200 and 400 μg·mL-1, for measuring cell viability using Neutral Red. Based on the results of cell viability, H4IIE cells were divided into the control group, the insulin group (100 nmol·L-1), the low dose CP group (the LCP group, 200 μg·mL-1) and the high dose CP group (the HCP group, 400 μg·mL-1). After the cultivation of cells for 2 h, mRNA levels were measured by real-time RT-PCR, while phosphorylation levels of target proteins were detected by western blot after the treatment for 30 min. It was found that the cell viability indexes in the cells administered by 100, 200 and 400 μg·mL-1CP increased significantly compared with the control group (P＜0.01). After the administration for 2 h, InsR and IRS-2 mRNA expressions in the insulin group, the LCP group and the HCP group increased (P＜0.05 or P＜0.01). After the administration for 30 min, phosphorylation levels of InsRβ, IRS-2 and Akt in the insulin group were higher than those in the HCP group (P＜0.01). In conclusion, CP probably increased the cell viability of H4IIE cells, and improved the blood glucose index through enhancing the mRNA expressions of InsR and IRS-2 and the phosphorylation levels of InsRβ, IRS-2 and Akt in the liver.

Kyclocarya paliurus polysaccharide, H4IIE liver cell, insulin signaling pathway

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

10.11842/wst.2016.07.0010

R587.1

A

2016-07-01

修回日期：2016-07-13

＊ 北京市教育委員會(huì)科學(xué)研究與研究生培養(yǎng)共建項(xiàng)目-科研項(xiàng)目：中藥干預(yù)胰島素抵抗技術(shù)平臺(tái)建設(shè)與方藥篩選研究，負(fù)責(zé)人：劉銅華。

＊＊ 通訊作者：劉銅華，本刊編委，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中醫(yī)藥防治糖尿病及其并發(fā)癥的臨床和基礎(chǔ)研究。