糖耐康改善ZDF大鼠胰島β細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究＊

吳莉娟，孫 文，劉銅華，吳麗麗，秦靈靈

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 成都 610075；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 北京 100029；4. 北京中醫(yī)藥大學(xué)科技處 北京 100029）

糖耐康改善ZDF大鼠胰島β細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究＊

吳莉娟1，孫 文2，劉銅華3＊＊，吳麗麗2，秦靈靈4

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 成都 610075；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 北京 100029；4. 北京中醫(yī)藥大學(xué)科技處 北京 100029）

目的：探討糖耐康干預(yù)2型糖尿病大鼠（ZDF）胰島β細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制。方法：6只雄性ZDF（fa/+）大鼠設(shè)為正常對(duì)照組，雄性ZDF（fa/fa）大鼠30只設(shè)為2型糖尿病成模組。根據(jù)體質(zhì)量及隨機(jī)血糖將成模組大鼠隨機(jī)分為5組，即模型組、二甲雙胍組、糖耐康高、中、低劑量組。給藥前測(cè)大鼠空腹血糖值及血清胰島素值；給藥6周再次檢測(cè)大鼠空腹血糖值及血清胰島素值并進(jìn)行比較。采用HE染色觀察胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變；采用TUNEL法檢測(cè)各組大鼠胰腺組織中胰島β細(xì)胞凋亡情況；免疫組織法觀察細(xì)胞死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)酶Caspase-3在胰島中表達(dá)情況。結(jié)果：給藥6周后，糖耐康高、中、低劑量組均可顯著改善ZDF大鼠空腹血糖（P＜0.01）；糖耐康高、中、低劑量組血清胰島素值較模型組均有所升高，其中，高、低劑量組有顯著性差異（P＜0.05）；給藥組胰島素抵抗指數(shù)較模型組均有所下降，其中，糖耐康高劑量組及二甲雙胍組有極顯著性差異（P＜0.01）。HE染色顯示給藥組的胰島細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)較模型組有所改善。TUNEL結(jié)果顯示ZDF（fa/fa）大鼠胰腺組織內(nèi)均可見胰島細(xì)胞凋亡改變，與模型比，給藥組TUNEL陽(yáng)性表達(dá)率均顯著性減少（P＜0.05）。免疫組化結(jié)果顯示給藥組Caspase-3蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）。結(jié)論：糖耐康能有效降低ZDF大鼠胰島β細(xì)胞的凋亡，即對(duì)胰島β細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。

糖耐康 胰島β細(xì)胞 ZDF大鼠 蘇木精-伊紅染色法 原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù) 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3

糖尿病作為威脅人類生命的重要疾病之一，其發(fā)病率逐年上升。2型糖尿?。═ype 2 Diabetes，T2DM）的發(fā)生，占整個(gè)糖尿病的90%以上，其發(fā)病機(jī)制主要是胰島素分泌功能受損和胰島素抵抗。胰島素抵抗是胰島素作用的靶器官對(duì)胰島素作用的敏感性減低。而胰島素分泌功能受損主要表現(xiàn)在胰島β細(xì)胞的分泌功能下降及其凋亡所造成的β細(xì)胞數(shù)量的減少[1]。研究證實(shí)在T2DM發(fā)病過程中，胰島β細(xì)胞數(shù)量呈進(jìn)行性減少[2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人類尸檢研究顯示，T2DM發(fā)病過程中胰島β細(xì)胞的數(shù)量減少可達(dá)到60%-80%，而正常人切除50%胰腺，其胰島素分泌功能就會(huì)出現(xiàn)異常[3,4]。另一研究發(fā)現(xiàn)T2DM患者因胰島素抵抗，會(huì)發(fā)生脂質(zhì)長(zhǎng)期過載于細(xì)胞內(nèi)而引起氧化應(yīng)激導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的功能衰退[5]。在發(fā)病初期，胰島素抵抗及β細(xì)胞分泌功能上的改變極為重要，而凋亡所致的β細(xì)胞數(shù)量減少卻在整個(gè)T2DM發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用。因此，保護(hù)胰島β細(xì)胞、預(yù)防并延緩β細(xì)胞凋亡及進(jìn)程、阻止其功能衰退成為治療T2DM整個(gè)發(fā)病過程的關(guān)鍵[6]。

劉銅華教授在治療糖尿病過程中，根據(jù)中醫(yī)理論結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)及現(xiàn)代藥理研究成果研制出中藥復(fù)方——糖耐康，既往動(dòng)物和臨床試驗(yàn)均表明其能有效調(diào)節(jié)血糖、血脂，改善胰島素抵抗[7，8]。本研究旨在觀察糖耐康對(duì)自發(fā)性2型糖尿病大鼠模型——ZDF大鼠胰島β細(xì)胞是否存在保護(hù)作用，以進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性ZDF（fa/fa）大鼠35只及ZDF（fa/+）大鼠6只（購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK京2012-0001），6-7周齡，體質(zhì)量200±20 g。大鼠在SPF級(jí)條件下飼養(yǎng)，由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK京2010-0032），標(biāo)準(zhǔn)屏障系統(tǒng)。飼養(yǎng)條件：溫度21±2℃、濕度60±10%，12 h/ 12 h光照黑暗循環(huán)，自由攝食飲水。

1.1.2 儀器及試劑

BX53F型光學(xué)顯微鏡及其成像系統(tǒng)（日本奧林巴斯公司）、ZDP-A2080A恒溫箱（上海智城公司）、高速低溫離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司，型號(hào)/貨號(hào)/批號(hào)： 3K15/10797/9001678）、小型染色缸、濕盒、吸管、各種規(guī)格的加樣器及槍頭等。TUNEL試劑盒（美國(guó)Roche公司，批號(hào)：11684817910）、Caspase-3兔抗大鼠抗體（活化半胱氨酸蛋白酶蛋白-3抗體，北京博奧森公司，批號(hào)：bs-0081R）、山羊血清及羊抗兔二抗（北京博奧森公司，批號(hào)：SP-0023）、胰島素放免試劑盒（北京中生北控科技股份有限公司，批號(hào)：HY-10069）、葡萄糖測(cè)試盒（北京中生北控科技股份有限公司，批號(hào)：SHPTT60110）、糖耐康（3g/袋，北京中醫(yī)藥大學(xué)藥廠制備，組方由人參、女貞子、夏枯草、三白草、番石榴葉組成。每克顆粒相當(dāng)于3.61 g生藥。實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水配制后超聲半小時(shí)，4℃保存）、鹽酸二甲雙胍片（0.5g/片，中美上海施貴寶，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20023370）、DAB工作液（北京博奧森公司，批號(hào)：AE111701/ C-0010）、Proteinase K工作液（德國(guó)默克公司，批號(hào)：1245680100）、蘇木素（北京索萊寶公司，批號(hào)：G1140）、伊紅（北京索萊寶公司，批號(hào)：G1100）、PBS、雙蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）等。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模及分組

將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，雄性ZDF（fa/+）大鼠作為正常組，給予普通飼料喂養(yǎng)；雄性ZDF（fa/fa）大鼠給予上海介宏貿(mào)易有限公司生產(chǎn)的PMI Labdiet 5008飼料誘導(dǎo)4周，選不同日兩次隨機(jī)血糖水平均值≥11.1 mmol·L-1者，為成模大鼠，共30只。按體質(zhì)量及隨機(jī)血糖分層隨機(jī)分為5組：二甲雙胍組（6只，二甲雙胍片0.18 g·kg-1），糖耐康低劑量組（6只，糖耐康0.81 g·kg-1），糖耐康中劑量組（6只，糖耐康1.62 g·kg-1），糖耐康高劑量組（6只，糖耐康3.24 g·kg-1）。給藥組均按每天0.01 mL·g-1的體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)灌胃給藥1次，正常組和模型組則給予相同劑量的生理鹽水灌胃，連續(xù)6周。各組大鼠均自由取食、飲水。

1.2.2 血糖及胰島素監(jiān)測(cè)

給藥前，禁食不禁水10 h后，目?jī)?nèi)眥取血測(cè)空腹血糖（Fasting Plasma Glucose，F(xiàn)PG）及血清胰島素值（Serum Insulin，INS）。

1.2.3 胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）

給藥前及給藥后，禁食不禁水10小時(shí)，大鼠目?jī)?nèi)眥取血，所測(cè)得FPG及空腹血清胰島素（Fasting Serum Insulin，F(xiàn)INS）。胰島素抵抗指數(shù)=空腹血糖值（FPG）×空腹胰島素值（FINS）/22.5。

1.2.4 取材

第6周，末次給藥后禁食不禁水10 h，予1%戊巴比妥鈉（0.04 mL·kg-1）麻醉成功后，腹主動(dòng)脈取血，靜置3 h后3 500 r·min-1分離血清，-80℃保存，測(cè)FPG。分離胰腺，部分組織置于4%多聚甲醛固定24 h，制備石蠟切片。

1.2.5 HE染色

常規(guī)石蠟切片經(jīng)過二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，蘇木素、伊紅染色，脫水、二甲苯透明后，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.6 TUNEL

常規(guī)石蠟切片先經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，隨后給予Proteinase K工作液進(jìn)行細(xì)胞通透，在恒溫箱孵育30 min后加TUNEL反應(yīng)液（處理組用50 μL 1號(hào)液+450 μL 2號(hào)液的混勻液；而陰性對(duì)照組僅加50 μL 2號(hào)液，陽(yáng)性對(duì)照組先加入100 μL DNase 1 50 μL 1號(hào)液+450 μL 2號(hào)液的混勻液），期間予以PBS反復(fù)沖洗，加converter-POD，與底物DAB反應(yīng)顯色，梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，中性樹膠封片。計(jì)算各組細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）[9]的值：每只大鼠取胰組織切片5張，每張切片在光鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)胰島，計(jì)數(shù)每個(gè)胰島中的凋亡細(xì)胞（呈棕黃色）及正常細(xì)胞。按以下公式計(jì)算：細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）=凋亡細(xì)胞數(shù)/(凋亡細(xì)胞數(shù)+正常細(xì)胞數(shù))。

1.2.7 免疫組化

常規(guī)石蠟切片經(jīng)過二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，Triton細(xì)胞通透后，微波爐加熱抗原修復(fù)，滴加正常山羊血清封閉液，加入一抗Caspase-3（活化）（1:100稀釋）后，置于4度冰箱過夜。第2天，經(jīng)PBS沖洗后，加入羊抗兔二抗（生物素標(biāo)記二抗工作液），DAB顯色后，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗，梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，中性樹膠封片。各組胰島細(xì)胞漿中具有活性的Caspase-3表達(dá)率的計(jì)算是每只大鼠取胰腺組織切片5張，每張切片在光鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)胰島，使用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件，計(jì)算平均光密度值公式：平均光密度值=光密度值/胰島總面積。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均以SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）形式表示；組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 糖耐康對(duì)大鼠FPG的影響

給藥前及給藥6周后，各組大鼠取血測(cè)FPG。給藥前，模型組及各給藥組大鼠與正常組大鼠相比，F(xiàn)PG值顯著升高（P＜0.01）；各給藥組大鼠與模型組相比，F(xiàn)PG值無(wú)顯著差異（P＞0.05）。給藥后，模型組及各給藥組大鼠與正常組大鼠相比，F(xiàn)PG值顯著升高（P＜0.01）；各給藥組大鼠與模型組相比，F(xiàn)PG值均顯著下降（P＜0.01）。結(jié)果見表1。

2.2 糖耐康對(duì)大鼠INS的影響

給藥前及給藥6周后，各組大鼠取血測(cè)INS。給藥前，模型組及各給藥組大鼠與正常組大鼠相比，INS值有極顯著差異（P＜0.01）；各給藥組大鼠與模型組相比，INS值無(wú)顯著差異（P＞0.05）。給藥后，模型組及各給藥組大鼠與正常組大鼠相比，INS值顯著升高（P＜0.01）；給藥組與模型組相比，二甲雙胍組、糖耐康高劑量組及低劑量組INS值均顯著升高（P＜0.05），糖耐康中劑量組大鼠INS值有所升高（P＞0.05），但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果見表2。

2.3 糖耐康對(duì)HOMA-IR的影響

給藥前及給藥6周后，計(jì)算各組大鼠HOMAIR。給藥前，模型組及各給藥組大鼠與正常組大鼠相比，HOMA-IR有極顯著差異（P＜0.01）；各給藥組大鼠與模型組相比，HOMA-IR無(wú)顯著差異（P＞0.05）。給藥后，模型組及各給藥組大鼠與正常組大鼠相比，HOMA-IR顯著升高（P＜0.01）；給藥組與模型組相比，二甲雙胍組、糖耐康高劑量組HOMA-IR均極顯著降低（P＜0.01），糖耐康中、低劑量組大鼠HOMAIR有所降低（P＞0.05），但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果見表3。

表1 ZDF大鼠FPG值測(cè)定結(jié)果

表2 ZDF大鼠INS值測(cè)定結(jié)果

表3 ZDF大鼠HOMA-IR結(jié)果

2.4 大鼠胰腺組織HE染色結(jié)果

正常組胰島細(xì)胞，邊界整齊，胰島β細(xì)胞聚集分布；模型組胰島細(xì)胞邊界不整齊，胰島β細(xì)胞腫脹，大小不等，排列紊亂，胰島細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)模糊（圖1）。

圖1 鏡下觀察ZDF大鼠胰島細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)(HE染色×400)

表4 各組大鼠胰島細(xì)胞AI值(n=6)

2.5 大鼠胰腺組織TUNEL檢測(cè)結(jié)果

正常組大鼠胰島邊界清楚，胰島β細(xì)胞分布正常，幾乎未見棕黃色的陽(yáng)性細(xì)胞；模型組胰島邊界模糊，胰島β細(xì)胞分布異常，可見大量的棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與正常組相比，糖耐康中、低劑量組及模型組可見棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞顯著增多（P＜0.01），糖耐康高劑量組及二甲雙胍組均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與模型組相比，各給藥組棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少（P＜0.01）均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與二甲雙胍組相比，糖耐康高劑量組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），糖耐康中劑量組（P＜0.05）及糖耐康低劑量組（P＜0.001）均顯著增多（P＜0.05）。結(jié)果見表4、圖2。

2.6 大鼠胰腺組織Caspase-3蛋白表達(dá)結(jié)果

正常組大鼠胰島邊界清楚，胰島β細(xì)胞分布正常，細(xì)胞漿內(nèi)Caspase-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)（棕黃色著色區(qū)）較少；模型組胰島內(nèi)可見大量的棕黃色Caspase-3蛋白表達(dá)。與正常組比，各給藥組及模型組棕黃色陽(yáng)性蛋白表達(dá)顯著增多（P＜0.01）；與模型組相比，給藥組棕黃色陽(yáng)性蛋白表達(dá)顯著減少（P＜0.01）。與二甲雙胍組比，糖耐康高劑量組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），糖耐康中劑量組（P＜0.001）及糖耐康低劑量組（P＜0.001）顯著增多（P＜0.01）。結(jié)果見圖3、表5。

圖2 鏡下觀察ZDF大鼠胰腺組織TUNEL染色情況(TUNEL×400)

圖3 鏡下觀察ZDF大鼠胰島Caspase-3表達(dá)情況(免疫組化×400)

3 討論

細(xì)胞凋亡（Apoptosis）概念于1972年由Kerr等首次提出，是由基因控制的細(xì)胞的自然死亡過程，現(xiàn)在普遍認(rèn)為細(xì)胞的凋亡也可能是由半胱氨酸蛋白酶Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)控的結(jié)果。Caspase-3是半胱氨酸蛋白酶家族中重要的一員，最初從人類的Jurkat-T淋巴細(xì)胞中克隆出。作為細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白酶，其以酶原形式存在，是整個(gè)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)。正常情況下，Caspase-3以休眠的酶原形式存在，在T2DM的發(fā)展過程的早期，胰島β細(xì)胞具有一定的代償能力，發(fā)揮分泌胰島素的正常功能；當(dāng)其失代償時(shí)，胰島素分泌減少，則會(huì)表現(xiàn)出空腹血糖升高，未加控制則見糖毒性、脂毒性。長(zhǎng)期的高糖或游離脂肪酸等的增高、氧化應(yīng)激的自由基產(chǎn)生增加，胞內(nèi)細(xì)胞色素C（Cyt-C）會(huì)從線粒體內(nèi)膜分離下來釋放到胞漿中，從而激活Caspase路徑；Caspase-3活化后，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，胰島β細(xì)胞損害、衰竭，甚至凋亡，以致胰島β細(xì)胞的胰島素分泌徹底消失[10-12]。

實(shí)驗(yàn)采用的ZDF大鼠，是從具有“肥胖基因”并出現(xiàn)糖尿病表型的大鼠中篩選出的高胰島素血癥肥胖模型，表現(xiàn)為糖耐量異常、高胰島素血癥、高脂血癥和胰島素抵抗[13]，與人的非胰島素依賴型糖尿病具有相似改變等特點(diǎn)。該大鼠由于瘦素受體突變使得瘦素對(duì)食欲控制及產(chǎn)熱作用受損，最終導(dǎo)致多食、明顯肥胖、血糖、血脂異常，其病情發(fā)展復(fù)制了人類糖尿病的進(jìn)程[14，15]。以往研究發(fā)現(xiàn)，在T2DM自發(fā)型動(dòng)物模型ZDF(fa/fa)大鼠體內(nèi)，胰島β細(xì)胞數(shù)量明顯減少，提示胰島β細(xì)胞的凋亡有可能參與T2DM的發(fā)病過程。因此，本實(shí)驗(yàn)選用此糖尿病大鼠模型[16]。

表5 各組大鼠胰島細(xì)胞Caspase-3平均光密度值(n=6)

糖耐康主要由人參、女貞子、夏枯草、三白草、番石榴葉組成，具有清熱生津、益氣養(yǎng)陰的功效，既往研究顯示其可有效調(diào)控T2DM動(dòng)物或患者的血糖。據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，方中的人參皂苷也具有明顯地阻止胰島β細(xì)胞凋亡的功能[17]。本實(shí)驗(yàn)中模型組INS值較給藥前明顯下降，提示該組胰島β細(xì)胞不斷凋亡，胰島素的分泌下降；糖耐康高、中劑量組、二甲雙胍組血清胰島素值有所上升，糖耐康低劑量組INS值稍有下降，提示糖耐康可改善胰島β細(xì)胞凋亡，使得胰島素分泌恢復(fù)正常。給藥后ZDF大鼠的FPG值較給藥前明顯下降，可能是由于糖耐康改善胰島β細(xì)胞凋亡情況，胰島素正常分泌以降低體內(nèi)葡萄糖濃度。結(jié)合給藥后，給藥組HOMA-IR均有所降低，可見其能改善胰島素抵抗；其中，血清胰島素本應(yīng)在胰島素抵抗改善后降低，而本實(shí)驗(yàn)中給藥組血清胰島素卻有所升高。在T2DM過程中，同時(shí)存在胰島素抵抗及胰島β細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)中HOMAIR降低的同時(shí)血清胰島素卻有所升高這可能提示糖耐康在改善胰島素抵抗的同時(shí)減少胰島β細(xì)胞的凋亡，使胰島素得以正常分泌。TUNEL實(shí)驗(yàn)觀察糖耐康干預(yù)ZDF大鼠胰島β細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)糖耐康給藥組的胰島β細(xì)胞凋亡水平均明顯下降；免疫組化結(jié)果顯示，糖耐康給藥組均可下凋亡相關(guān)基因Caspase-3蛋白表達(dá)水平，抑制整個(gè)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下調(diào)，從而減少胰島β細(xì)胞凋亡，恢復(fù)分泌胰島素的功能有關(guān)。

由此可見，糖耐康調(diào)節(jié)2型糖尿病大鼠血糖作用，可能與其改善胰島素抵抗的同時(shí)通過調(diào)控Caspase-3，抑制凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減少胰島β細(xì)胞的凋亡相關(guān)。而從整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，糖耐康各組與西藥二甲雙胍對(duì)胰島β細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用結(jié)果一致，究其具體機(jī)制我們將做進(jìn)一步的蛋白及基因水平研究以驗(yàn)證。

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The Mechanism Behind the Anti-Apoptotic Effects of TNK on Islet β Cell in Type 2 Diabetic ZDF Rats

Wu Lijuan1, Sun Wen2, Liu Tonghua3, Wu Lili2, Qin Lingling4

(1. School of Clinical Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, China;
2. Health-Cultivation Laboratory of the Ministry of Education, Beijing University of Chinese Medcine, Beijing 100029, China
3. School of Graduates, Beijing University of Chinese Medcine, Beijing 100029, China;
4. Department of Science and Technology, Beijing University of Chinese Medcine, Beijing 100029, China)

This study aimed to investigate the anti-apoptotic effects of Tangnaikang (TNK) on islet β cells in Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Six male fa/+ ZDF rats were took as the control group, while other thirty male fa/ fa ZDF rats were divided into five groups at random: the model group, the metformin group, the high-, mediumand low-dose TNK groups, depending on their body weight and random blood glucose. Prior to the administration, fasting blood glucose and fasting insulin were measured by drawing blood with inner canthusl. Materials were prepared when administered for six weeks. Fasting blood glucose and fasting insulin were detected again. When the sections of the rat pancreatic tissue were embedded, the morphological changes of the islet were observed via HE staining, and the apoptosis of islet β cell were observed using TUNEL. Positive expression of Caspase-3, the transduction enzyme of cell death signal, was tested by immunohistochemical method. It was found that the fasting blood glucose of the (fa/fa) ZDF rats in the high-, medium- and low-dose TNK group was significantly improved after administration (P ＜ 0.01). The serum insulin of rats in the high-, medium- and low-dose TNK group arised compared with the model group, while the high- and low-dose TNK group showed differences in a statistical sense. Compared with the model group, the HOMA-IR of all the treatment group decreased, while significant difference was presented between the high-dose TNK group and the metformin group. HE staining showed that the morphology of the islet β cell of the rats in all the treatment group was improved. The results of TUNEL showed significantly apoptotic changes on islet β cell of the fa/fa ZDF rats. Compared with the model group, the positive expression of TUNEL in the metformin group and the high-dose TNK group were significantly reduced (P ＜ 0.05). The result of immunohistochemistry method showed that the protein levels of Caspase-3 in the metformin group and the high-dose TNK group decreased (P ＜ 0.05). In conclusion, it was demonstrated that TNK effectively reduced the apoptosis of islet β cells in fa/fa ZDF rats, which presented a protective effect.

Tangnaikang, islet β cells, Zucker diabetic fatty rats, hematoxylin-eosin staining, terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay, caspase-3

（責(zé)任編輯：董曉娜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

10.11842/wst.2016.07.007

R2-031

A

2016-07-01

修回日期：2016-07-15

＊ 科學(xué)技術(shù)部國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃課題（2014BAI10B04）：中藥干預(yù)糖調(diào)節(jié)受損臨床療效評(píng)價(jià)研究，負(fù)責(zé)人：劉銅華。

＊＊ 通訊作者：劉銅華，本刊編委，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中醫(yī)藥防治糖尿病及其并發(fā)癥的臨床和基礎(chǔ)研究。