中藥活性成分發(fā)現(xiàn)關鍵技術研究進展＊

宋慧鵬，楊 華，高 雯，陳 君，李 萍

（中國藥科大學天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室 南京 210009）

中藥活性成分發(fā)現(xiàn)關鍵技術研究進展＊

宋慧鵬，楊 華，高 雯，陳 君，李 萍＊＊

（中國藥科大學天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室 南京 210009）

中藥是當今新藥研發(fā)的重要來源之一?，F(xiàn)代科學技術的迅猛發(fā)展為中藥研究帶來了新的機遇，同時也促進了中藥理論的不斷創(chuàng)新。建立既符合中藥特點又適應現(xiàn)代藥物研發(fā)的理論和技術是中藥藥效物質研究迫切需要解決的問題。本文結合筆者課題組近5年的研究實例，介紹了中藥活性成分發(fā)現(xiàn)的關鍵技術，包括化合物庫制備-活性評價-結構鑒定一體化技術、生物垂釣和化學垂釣技術、基于配體和受體的虛擬篩選技術、中藥譜效關聯(lián)發(fā)現(xiàn)技術、等效成分群發(fā)現(xiàn)技術等，以期為中藥藥效物質研究提供一定的參考，進而加快中藥現(xiàn)代化進程。

中藥活性成分發(fā)現(xiàn) 先導化合物 等效成分群 整合作用

中藥藥效物質不明確是制約中藥現(xiàn)代化和國際化的“瓶頸”問題之一。傳統(tǒng)的中藥藥效物質研究往往采取“化學成分分離-分子結構鑒定-生物活性評價或活性導向分離”的模式。該模式是中藥藥效物質研究的重要方法之一，引導了青蒿素的發(fā)現(xiàn)。然而，中藥的臨床應用重視整體調節(jié)、辨證論治，具有多成分、多靶點整合的作用特點。故在中藥藥效物質研究中，既要進一步發(fā)展和完善單體活性成分發(fā)現(xiàn)的方法、技術，也要建立符合中藥整體作用特點的活性組分發(fā)現(xiàn)理論與技術體系。本文結合筆者課題組的研究工作，就構建中藥“活性單體篩選”和“活性組分發(fā)現(xiàn)”體系進行綜述（圖1），以期為中藥快速發(fā)展提供技術支撐。

1 活性單體篩選策略

由于50%上市藥直接或間接來源于天然產物[1]，中藥在新藥研發(fā)方面具有得天獨厚的優(yōu)勢。針對中藥成分復雜、結構多樣的特點，近年興起的化合物庫制備-活性評價-結構鑒定一體化技術、生物和化學垂釣技術、基于受體和配體的虛擬篩選技術等，均可用于快速辨識中藥提取物中的先導化合物。

1.1 化合物庫制備-活性評價-結構鑒定一體化技術

早期中藥活性成分發(fā)現(xiàn)研究主要依賴于化學分離，但其操作繁瑣、周期長的弊端降低了活性成分發(fā)現(xiàn)效率。為此，本課題組集成化學、生物、分析等多學科交叉的理論和方法，構建了由高精度化合物庫制備、高通量活性篩選、高分辨質譜定性并行組成的化合物庫制備-活性評價-結構鑒定一體化技術?；衔飵熘苽湎到y(tǒng)引入了機械自動化的技術，通過軟件精確設置高效液相色譜的組分收集時間窗，實現(xiàn)對中藥全組分采樣和化合物庫構建；制備柱的流出液經(jīng)分流后進入質譜同步進行結構識別；制備好的化合物被遞送至高通量活性篩選系統(tǒng)（如酶標儀）進行活性掃描。一次運行即可完成整個篩選過程，無需投入過多人力，大大縮短了篩選時間。運用該技術，研究者從丹參提取物首次發(fā)現(xiàn)16個Nrf2-ARE通路的激動劑[2]和19個凝血酶抑制劑[3]；從甘草提取物中制備了39個餾分，其中9個成分為Nrf2-ARE通路的激動劑[4]。

圖1 中藥活性成分發(fā)現(xiàn)關鍵技術體系、原理及適用性

1.2 垂釣技術

1.2.1 生物垂釣技術

目前，上市藥物的作用靶點主要是酶和受體。生物垂釣技術根據(jù)受體-配體結合理論，用與疾病相關的酶或受體作為誘餌靶標，直接從復雜的中藥提取物中快速、靈敏、準確地提取活性小分子，從而使篩選效率成倍提升。下文以二維渦流色譜法、超濾質譜聯(lián)用技術以及細胞膜色譜法為例分別說明其應用及技術特點。

二維渦流色譜法是一種典型的在線篩選方法，其主要步驟包括：將靶蛋白與中藥提取液孵育，活性小分子會和靶蛋白結合形成復合物；通過渦流色譜將靶蛋白-小分子復合物捕獲；運用解離液將小分子從復合物中釋放；游離出來的配體小分子進入高分辨質譜進行分析，獲得配體的結構信息以及與靶蛋白的親和參數(shù)。本課題組通過六通閥將渦流色譜柱、常規(guī)分析柱、高分辨質譜儀串聯(lián)，實現(xiàn)了活性分子捕獲-解離與結構鑒定的在線結合[5]，并成功運用于丹參水提物中黃嘌呤氧化酶抑制劑的篩選，從中篩選出了丹酚酸C、丹酚酸A和異丹酚酸C三個活性化合物[6]。丹酚酸C為首次報道的黃嘌呤氧化酶抑制劑，與陽性藥別嘌呤醇的活性相當。

超濾質譜聯(lián)用技術是由van Breemen在1997年提出[7]，最初應用于組合化合物庫的篩選，近幾年在中藥活性成分發(fā)現(xiàn)方面顯示出巨大的優(yōu)勢[8]。超濾是基于壓力或離心力設計的膜分離技術，利用靶蛋白與小分子的質量差實現(xiàn)分離。將靶蛋白與中藥提取物的共孵液加入超濾濃縮離心管，超濾膜能夠截留靶蛋白-小分子復合物，游離的小分子則被過濾；加入適宜的解離液對復合物進行變性以釋放活性小分子，并將最終的濾液注入液質系統(tǒng)進行結構鑒定。成本較低、操作簡便、靶蛋白用量少為該技術的主要優(yōu)勢。本課題組在前期超濾實驗的基礎上做了針對性改進，引入一個酶通道阻滯劑作為對照組，通過實驗組和對照組的親和色譜峰面積差異進而辨別假陽性現(xiàn)象。該技術已應用于菊花中黃嘌呤氧化酶抑制劑的篩選，從中篩選出強活性的黃酮類小分子，揭示了菊花用于治療痛風的藥效物質基礎[9]。此外，超濾質譜聯(lián)用技術在與微孔板酶活測定法、分子對接技術聯(lián)用時顯示出很好的兼容性，不僅能夠有效減少假陽性篩選結果的幾率，而且也有利于先導化合物的優(yōu)化和高質量酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)。該方法已應用于脈絡寧復方及其衍生組合化合物庫中活性成分的篩選，所發(fā)現(xiàn)的3,4-二咖啡酰基奎尼酸甲酯和3,5-二咖啡?；崴峒柞ゾ哂信c陽性藥相當?shù)狞S嘌呤氧化酶抑制活性[10]，對于后期藥物研發(fā)具有參考意義。

細胞膜色譜技術是近年來生物親和色譜領域的研究熱點。細胞膜表面含有眾多受體，是天然的多靶標材料，尤其適合中藥“多成分、多靶點”的篩選特點。賀浪沖教授課題組在20世紀90年代建立了以硅膠-細胞膜為固定相的色譜系統(tǒng)用于鈣拮抗劑與心肌細胞膜和兔紅細胞膜、二氫吡啶類異構體藥物與兔小腦細胞膜的特異性相互作用研究[11]。經(jīng)過20余年的發(fā)展，細胞膜色譜已形成系統(tǒng)的技術體系，其關鍵環(huán)節(jié)主要集中在構建合適的靶細胞用于細胞膜的制備、細胞膜色譜儀器搭建、后期活性成分驗證。到目前為止，大鼠嗜堿性白血病2H3細胞[12]、腹腔巨噬細胞[13]、心肌細胞[14]等細胞系已成功用于細胞膜色譜法；基于該方法的自動化裝置也不斷取得突破。例如，Hou等[15]將細胞膜色譜與高效液相色譜-質譜通過兩位10通閥、兩根C18富集柱在線串聯(lián)，實現(xiàn)了對厚樸中抗乳腺癌活性成分的快速高通量篩選。細胞膜色譜的難點之一在于后期活性成分驗證。經(jīng)典的驗證方法是放射性配體結合試驗，該方法能夠定性定量表征配體和受體之間的親和力，是細胞膜色譜法篩選結果的重要佐證。細胞膜色譜能夠將中藥體系和生物體系兩個復雜系統(tǒng)有機地聯(lián)系在一起，從膜受體的角度揭示中藥活性成分及相互作用。

1.2.2 化學垂釣技術

中藥參與體內生物化學反應是中藥起效的重要途徑之一?；瘜W垂釣是將化學成分分離、生化反應監(jiān)測和物質基礎發(fā)現(xiàn)互補融合的技術，能夠快速同時表征草藥中各化合物的化學信息和活性信息。不同于生物垂釣以小分子和靶標的結合作為辨識指標，化學垂釣直接檢測化合物對模擬生化反應的干預，因而很大程度上可以避免小分子與靶標非特異性結合所產生的假陽性現(xiàn)象?；瘜W垂釣的早期代表之一是Verpoorte在2 000年建立的在線識別乙酰膽堿酯酶抑制劑的生物化學檢測法[16]，隨后Vermeulen及其合作者深入系統(tǒng)地開展方法學探索[17,18]。近年來，該方法廣泛地應用于中藥研究，并對中藥活性成分的發(fā)現(xiàn)起到了積極的推動作用。Li等[19]建立了針對α-葡萄糖苷酶的在線生物活性檢測法，并從4味草藥中發(fā)現(xiàn)了鞣料云實素和鞣花酸兩個抑制劑；同期他們也實現(xiàn)了對黃嘌呤氧化酶的在線生物活性篩選并成功發(fā)現(xiàn)黃芩素、白楊素等多個抑制劑[20,21]。

現(xiàn)代病理學表明很多疾病與自由基密切相關，中藥的抗氧化活性一直是研究熱點之一?；谧杂苫宄幕瘜W垂釣技術，根據(jù)篩選形式可分為柱后反應篩選（在線）和柱前反應篩選（離線）。柱后反應法是利用色譜柱對中藥提取物進行分離，用分流閥對柱后流出液進行分流，一部分進入檢測器，而另一部分與自由基在反應環(huán)中進行反應后進入另外一個檢測器，有活性的化合物會在該檢測器信號中出現(xiàn)倒峰。本課題組將該方法應用于金銀花中酚酸、黃酮、環(huán)烯醚萜苷3個部位的研究[22]。結果顯示，酚酸和黃酮是參與自由基清除的主要活性成分，而環(huán)烯醚萜苷無抗氧化能力。柱前反應法也稱離線法，其基本原理是將中藥提取物與自由基反應，然后將反應液進行高效液相色譜分析，通過比較反應液和原中藥提取物色譜圖中峰面積的變化發(fā)現(xiàn)能夠清除自由基的化合物。相比于在線法，離線法雖然自動化程度相對較低，但穩(wěn)定性相對較高。例如，運用該方法對甘草提取物進行篩選，從中篩選出了11個具有自由基清除能力的化合物[23]；進一步將該方法與全二維液相色譜偶聯(lián)應用于銀杏葉提取物篩選，從銀杏葉提取物的61個成分中鑒定出25個自由基清除劑[24]。

1.3 基于配體/受體的虛擬篩選技術

中藥復雜的化學體系以及廣泛涉及的藥理靶點決定了虛擬篩選對于中藥現(xiàn)代化的必要性。針對中藥成分作用靶點不明確或者一個成分作用于多個靶點的難題，基于配體的中藥虛擬篩選策略逐漸興起。由于該策略是依據(jù)已知藥物的結構和活性建立藥效團模型或定量構效關系預測中藥成分活性，不需具體藥理靶點的結構信息，尤其適合中藥作用靶點多、靶點不明確的特點。基于配體的中藥虛擬篩選策略主要包括3個步驟：中藥化學成分表征、提取已知藥物的結構和活性數(shù)據(jù)建模、運用模型預測中藥成分的活性。該策略被應用于丹七方中能夠同時清除羥基自由基、超氧陰離子以及二苯基苦酰肼基的廣譜自由基清除劑的篩選[25]。該研究同時涉及3種自由基，從靶點的角度進行篩選會使問題復雜化。從配體角度出發(fā)，構建基于已知廣譜自由基清除藥物的藥效團模型，并利用該模型從丹七方中篩選到了丹參素、紫草酸等一系列活性分子。這些化合物對于某些特定自由基的清除能力甚至強于上市藥物。目前，基于配體的中藥虛擬篩選方法尚處于方法學摸索階段，初步用于一些相對簡單的模型。隨著經(jīng)驗積累和研究深入，該方法將應用于更多復雜疾病模型。

基于受體的中藥虛擬篩選技術是運用分子模擬的方法來建立大分子受體-小分子配體復合物的三維結構，分析并預測兩者的相互作用機制，以此篩選能夠與受體活性口袋互補結合的中藥小分子。應用該技術的必要前提是小分子化合物結構和藥理靶點晶體結構已知。以分子對接為例，該技術成功用于銀杏中α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選，從中發(fā)現(xiàn)了11個活性小分子，其中丁香亭、金松雙黃酮為首次報道[26]。相比于傳統(tǒng)藥物篩選方法，中藥虛擬篩選從分子結構的角度出發(fā)，提供了更多的結構和活性信息，更好地體現(xiàn)了中藥藥效的深層機制，同時節(jié)省了大量的資金和勞動力。但由于目前任何一種虛擬篩選技術都無法真實還原受體-配體的相互作用，該方法通常與其他篩選技術配合，從而實現(xiàn)對中藥復雜化學體系的快速準確篩選。

2 活性組分發(fā)現(xiàn)策略

隨著涉及多重信號、多個靶點復雜疾病的研究不斷加深，藥物研究模式逐漸從“一個藥物、一個靶點、一種疾病”轉變?yōu)椤岸鄠€藥物、多靶點、復雜疾病”。這種轉變與中藥防治疾病的整體性和系統(tǒng)性特點不謀而合。中藥的特色是藥味配伍發(fā)揮整合作用，從確有療效的中藥復方中發(fā)現(xiàn)具有配伍關系的成分組合，有利于揭示中藥的藥效物質基礎以及藥效物質間的相互作用規(guī)律。

2.1 中藥譜效關聯(lián)發(fā)現(xiàn)技術

闡明中藥化學物質組及其對應的藥效關系是從整體觀的角度發(fā)現(xiàn)活性組分的關鍵所在。目前，中藥指紋圖譜能在最大程度反映中藥化學物質。國內很多科研工作者已在譜效關系領域進行了探索，采用生物信息學的方法進行信息挖掘，去除無效的化學成分，保留與藥效活性真正相關的藥效組分，倡導建立與其療效相互關聯(lián)的中藥指紋圖譜，建立反映中藥內在質量的標準[27,28]。本課題組以譜效關系的研究思路為指導，采用數(shù)理統(tǒng)計評價成分之間的相互作用關系，進一步發(fā)展了適用于中藥活性成分發(fā)現(xiàn)的譜效關聯(lián)技術。該方法用于石蒜中拮抗乙酰膽堿酯酶的活性組分篩選，結果表明加蘭他敏和石蒜堿具有協(xié)同作用且與石蒜整體活性的相關度最高[29]。進一步考慮到中藥各成分含量參差不齊，本團隊建立了“重構譜效關聯(lián)發(fā)現(xiàn)技術”。該技術將中藥原有的指紋圖譜以色譜峰為單位打破，以校正因子計算原理為指導對色譜峰進行重構，減少因中藥提取液中各成分含量差異懸殊導致的組分漏篩。該技術成功應用于丹七方中有效組分的發(fā)現(xiàn)和相互作用研究，結果表明微量成分丹參酮類是拮抗凝血酶的關鍵組分，并且組分內部之間存在普遍的加合作用[30]。譜效關聯(lián)發(fā)現(xiàn)技術通過對中藥化學物質組的活性全掃描，客觀反映了組分與中藥整體活性的相關度，充分揭示組分內部的相互作用關系，為中藥藥效物質基礎以及組分新藥的研究提供了一種新的方法。

2.2 等效成分群發(fā)現(xiàn)技術

中藥藥效物質基礎的闡明需要不斷在理論和方法學上創(chuàng)新。在中藥復雜的化學體系中，哪些成分能夠表征中藥藥效是中藥基礎研究需要解決的根本問題。本課題組以中醫(yī)藥整體觀和現(xiàn)代系統(tǒng)生物學為指導，基于“從整體中剖析局部，從局部回歸整體”的研究理念，創(chuàng)建了符合中藥自身特點、能夠科學表征中藥藥效物質基礎的“等效成分群”研究理論與方法。該理論的科學內涵包括：①等效成分群與原中藥針對某一病癥的藥效相當，是中藥的核心有效部位；②等效成分群定性定量表征明確，即該組分所包含的化合物以及含量比例都已清楚解析；③等效成分群中每個成分通過各自的靶點貢獻于整體藥效，整個成分群依然保留中藥“多成分，多靶點”的作用方式。該理論是對中藥藥效物質基礎的深化研究，能夠科學揭示藥效-成分內在關聯(lián)以及整體與局部相互作用關系[31]。

圍繞“等效成分群”理論，課題組建立和發(fā)展了與之配套的中藥復雜藥效物質發(fā)現(xiàn)技術與方法學體系。其核心內容及對應的關鍵步驟如下：①中藥體內外物質組的表征：該技術以質譜診斷離子匹配定性、標準疊加定量、固有物質組/代謝組網(wǎng)絡關聯(lián)為代表，在充分考慮中藥成分在體內體外存在形式和含量差異的基礎上，攻克多成分復雜體系“定性難、定量不準”的方法學難題；②潛在有效組分的篩選：以與中藥主治功能密切相關的靶標為誘餌，直接捕獲中藥提取物中能與靶標作用的有效組分，配合“體內外物質組表征技術”對潛在有效組分成分進行確認；③組分的制備與活性評估：基于自主設計的自動化成分捕集系統(tǒng)，以與誘餌靶標相互作用的成分為目標，精確制導該組分的捕獲與缺失，以權威的體內外藥效模型指標評價目標組分及剩余部位的活性；④目標組分的等效性評估與反饋確認：以生物信息統(tǒng)計學的方法計算目標組分對于整體中藥的活性貢獻權重，經(jīng)過等效性評價與反饋篩選，發(fā)現(xiàn)和確證能與原中藥發(fā)揮同等藥效的組分，即為等效成分群。該理論及技術應用于復方丹參方的研究，從中發(fā)現(xiàn)了一個由18個成分組成的“等效成分群”（含量為原方的15.01%），該組合可以在細胞、器官、動物水平表征原方抗心肌缺血的整體藥效[32]。該研究為復方丹參方藥效物質基礎的闡明提供了數(shù)據(jù)支撐，國家自然科學基金委曾以“中藥藥效物質基礎研究領域取得重要進展”對此進行報道。

需要注意的是，中藥普遍存在著“一藥多用”的現(xiàn)象，即同一種中藥可以用于治療不同的疾病。在這種情況下，其藥效物質基礎及等效成分群可能不同。例如，復方丹參滴丸抗炎的等效成分群由6個成分組成[33]，區(qū)別于其抗心肌缺血的18個成分。

3 結語

中藥活性成分的發(fā)現(xiàn)是創(chuàng)新中藥研發(fā)的源泉?？v觀整個中藥活性篩選方法學體系，基于整體觀的“活性組分發(fā)現(xiàn)”理論和技術仍需完善，本課題組將繼續(xù)圍繞中藥多成分多靶點整合作用的特點和等效成分群理論，不斷汲取現(xiàn)代科技發(fā)展的有益成果，以強有力的創(chuàng)新技術和方法助力中藥現(xiàn)代化和國際化。

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Song Huipeng, Yang Hua, Gao Wen, Chen Jun, Li Ping
(State Key Laboratory of Nature Medicines, China Pharmaceutical University, Nanjing, 210009, China)

Traditional Chinese medicines (TCM) is one of the most important sources of new drugs. The rapid development of modern science and technology has brought new opportunities for TCM. Admittedly, new academic theory is getting into a golden period of innovation. Key technologies that enbody TCM features and adapt to modern drug-screening requirements are urgently needed. After five years’ endeavor, the authors’ group has made great progress in the new theories and methodologies for the discovery of bioactive compounds from TCM. In this review, a total of five key technologies: library-bioactivity-structure integration, biological and chemical fishing technology, ligand-and receptor-based virtual screening, profile-bioactivity relationship and the technology for discovering bioactive equivalent combinatorial components (BECCs), were introduced. In the text, several valuable demonstrations over the TCM-based drug discovery were provided, for uncovering the scientific basis of TCM and accelerating the process of TCM modernization.

Bioactive compounds of traditional Chinese medicines, screening technology, integration effect, lead compound, bioactive equivalent combinatorial components

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

10.11842/wst.2016.07.002

R284

A

2016-06-30

修回日期：2016-07-17

＊ 國家自然科學基金委創(chuàng)新研究群體項目（81421005）：中藥活性成分群發(fā)現(xiàn)與作用機理，負責人：李萍。

＊＊ 通訊作者：李萍，本刊編委，教授，博士生導師，主要研究方向：中藥及天然藥物有效成分群發(fā)現(xiàn)和質量評價研究。