睡眠剝奪誘導小鼠氣虛證模型的方法研究＊

甘加寬，樊憬懿，王冬芝，任鈞國，劉建勛

（中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院基礎醫(yī)學研究所/中藥藥理北京市重點實驗室 北京 100091）

睡眠剝奪誘導小鼠氣虛證模型的方法研究＊

甘加寬，樊憬懿，王冬芝，任鈞國＊＊，劉建勛

（中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院基礎醫(yī)學研究所/中藥藥理北京市重點實驗室 北京 100091）

目的：通過比較睡眠剝奪、力竭游泳、睡眠剝奪結合力竭游泳3種造模方法，研究小鼠氣虛模型的建立與評價方法。方法：將小鼠分為正常對照組、睡眠剝奪組、力竭游泳組、睡眠剝奪+力竭游泳（簡稱“復合組”），每組12只，睡眠剝奪組采用多平臺水環(huán)境法進行睡眠剝奪，每天10 h；力竭游泳組采用負重10%進行力竭游泳，每天一次；復合組兩種方法聯(lián)合使用，連續(xù)28天。試驗結束后，觀察小鼠行為與體重，抓力儀測量小鼠抓力，利用小動物無創(chuàng)監(jiān)護儀檢測脈搏信號（心率、呼吸頻率、呼吸幅度、脈搏幅度），采用數(shù)碼照相機采集舌面圖像，利用細胞流式儀檢測脾臟T細胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+）與B細胞（CD19+）。結果：與正常對照組比較，3組模型小鼠活動能力均降低，呈現(xiàn)疲勞特性，體重、抓力顯著降低（P＜0.05-0.01）；小鼠舌面均見不同程度的變白，僅復合組具有顯著性差異（P＜0.05）；睡眠剝奪組與復合組小鼠心率、呼吸頻率、脈搏幅度與呼吸幅度均顯著降低（P＜0.05-0.01）；3組的CD3+、CD4+、CD8+T細胞亞群顯著增加（P＜0.01），睡眠剝奪組的CD19+B細胞顯著減少（P＜0.01）。結論：三種方法均可以成功制備氣虛小鼠模型，以睡眠剝奪造模最優(yōu)。

氣虛模型 小鼠 睡眠剝奪 力竭游泳

長期以來，動物模型的研制對醫(yī)學發(fā)展有著重要的意義，中醫(yī)動物模型已成為中醫(yī)科研方法體系的一個重要組成部分，是開展中醫(yī)證候及中藥新藥實驗研究的一個重要方法。氣虛證作為中醫(yī)許多疾病的常見證候，以氣短、乏力、神疲、脈虛等虛弱證候為主要臨床表現(xiàn)。近年來，有關氣虛證動物模型的研究取得了一定的進展，造模方法主要有限制飲食法、瀉下法、疲勞法、煙熏法、化療藥物法、X線照射法、耗氣破氣法等[1]；常用實驗動物主要包括小鼠[2]、大鼠[3]、豚鼠[4]、家兔[5]等。

中醫(yī)認為，勞倦過度、飲食失節(jié)、情志異常等是引起氣虛證的主要因素，以往多采用勞倦過度、飲食失節(jié)的方法造模，但隨著社會的發(fā)展，工作、生活、學習的壓力和睡眠質量的下降已經(jīng)成為氣虛發(fā)生的主要原因。為此，本研究通過比較睡眠剝奪、游泳力竭及雙因素復合的方法開展小鼠氣虛模型的研究，以期為氣虛證動物模型的制備提供一種新方法。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物

SPF級ICR雄性小鼠48只，體質量18-20 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證：SCXK（京）2012-0001。

1.1.2 儀器

尼康D90單反相機；S-1100型電子天平（長沙湘平科技發(fā)展有限公司）；MouseOx Plus型小動物無創(chuàng)監(jiān)護儀（上海玉研科學儀器有限公司）；YLS-13A型大小鼠抓力測定儀（北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司）；NAVIOS流式細胞儀（美國BeckmanCoulter公司）。

1.1.3 試劑

異氟烷（魯南貝特制藥有限公司，批號：64150703）；紅細胞裂解液（北京中生柏奧生物科技有限責任公司，批號：20160531）；PBS（北京中生柏奧生物科技有限責任公司，批號：20160623）；小鼠CD3ePE流式試劑（北京利文商貿有限責任公司，批號：C0031010516503）；小鼠CD4FITC流式試劑（北京利文商貿有限責任公司，批號：C0041020916353）；小鼠CD8aAPC流式試劑（北京利文商貿有限責任公司，批號：C0081031616203）；CD19 PE-Cyanine7抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司，批號：E07526-1637）。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與處理

將48只ICR雄性小鼠隨機分成正常對照組、睡眠剝奪組、游泳組、睡眠剝奪+游泳組，每組12只。睡眠剝奪組[6-8]：利用改良多平臺水環(huán)境（自制小平臺高40 mm，豎管直徑10 mm，底盤直徑60 mm，平臺直徑25mm）進行睡眠剝奪，每日8∶00（即開燈時間）至17∶00將小鼠置于水平臺，進行部分睡眠剝奪，17∶00以后將其從平臺上取下放入鼠籠進行飼養(yǎng)。力竭游泳組[9-11]：在小鼠尾根部負荷其體重10%的鉛塊作為重物,放入500 mm×350 mm×200 mm的游泳箱內，水深19 cm，水溫30±1℃，保證小鼠在水中不能用尾巴接觸箱底。當小鼠頭部沉入水中，5 s內不能浮出水面自由呼吸時作為力竭標準。睡眠剝奪+游泳組：同時給予睡眠剝奪和力竭游泳干預。正常對照組不做任何處理，上述造模方法均連續(xù)4周。

1.2.2 體重

采用電子天平稱量各組實驗動物的體重。

1.2.3 抓力

采用YLS-13A大小鼠抓力測定儀測定各組實驗動物的抓力。

1.2.4 舌像

尼康D90單反相機拍照小鼠舌面，用Adobe Photoshop CS5軟件分析舌面，舌背，足部的三原色比例。

1.2.5 脈搏

MouseOx Plus小動物無創(chuàng)監(jiān)護儀測定小鼠血氧飽和度、心率、呼吸頻率、脈搏幅度、呼吸幅度。

1.2.6 脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)

實驗結束后，小鼠摘眼球取血，頸椎脫臼處死小鼠，70%酒精浸泡10 min，無菌條件下剖開小鼠腹腔取脾與胸腺，稱重，計算脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)，公式如下：

脾臟（胸腺）指數(shù)（%）=脾臟（胸腺）濕重（g）/小鼠體重（g）×100%

1.2.7 脾臟T細胞亞群與B細胞[12]

取小鼠脾臟研磨過100目篩， PBS5 mL沖洗，收集分離的脾細胞懸液，于1 000 r·min-1，4℃條件下離心5 min，棄上清；加紅細胞裂解液Tris-NH4Cl 3mL，混勻脾細胞，靜置10 min，加1mL PBS 終止裂解，于1000 r·min-1，4℃條件下離心5 min，取下面白色細胞沉淀，PBS洗2遍，重懸細胞，計數(shù)調整細胞濃度為1：107/mL，進行流式細胞術檢測樣品T細胞亞群與B細胞。

1.2.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 小鼠體重的變化

小鼠體重的變化數(shù)據(jù)見表1，由表1可知，與正常對照組比較，第2周和第4周時，睡眠剝奪組、游泳組、睡眠剝奪+游泳組均能引起小鼠體重明顯下降（P＜0.01）。與游泳組比較，睡眠剝奪組、睡眠剝奪+游泳組的體重變化不明顯（P＞0.05）。

2.2 小鼠抓力的變化

小鼠抓力可反映氣虛證神疲乏力、少氣懶言的癥狀。由表2可知，與正常對照組比較，2周、4周時，睡眠剝奪組、游泳組、睡眠剝奪+游泳組小鼠的抓力均明顯下降（P＜0.01-0.05）。與游泳組比較，睡眠剝奪組、睡眠剝奪+游泳組小鼠的抓力無明顯變化（P＞0.05）。

2.3 小鼠舌象的變化

中醫(yī)氣虛證候有舌淡苔白。由表3可知，與正常對照組比較，2周、4周時，睡眠剝奪組、游泳組、睡眠剝奪+游泳組小鼠舌像R、G、B、R/G、R/B值均無明顯差異（P＞0.05）。與游泳組比較，睡眠剝奪組小鼠的舌像數(shù)據(jù)無明顯變化（P＞0.05），睡眠剝奪+游泳組數(shù)據(jù)顯示G值、B值變小，R/B值、R/G值偏大，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。根據(jù)R/B值，R/G值的理論意義，變大說明舌質在變紅，可見復合組出現(xiàn)舌面瘀紫。

2.4 小鼠脈搏的變化

中醫(yī)氣虛證候在脈象上是脈細弱。由表4可知，與正常對照組比較，2周時，睡眠剝奪組、游泳組、睡眠剝奪+游泳組血氧飽和度無明顯差異（P＞0.05），心率游泳組偏低（P＜0.01）；余兩組無差異（P＞0.05）；呼吸頻率，脈搏幅度與呼吸幅度無明顯差異（P＞0.05）；與游泳組比較，睡眠剝奪組小鼠的舌像數(shù)據(jù)無明顯變化（P＞0.05）；睡眠剝奪+游泳組卻均心率升高，呼吸頻率下降，脈搏幅度升高，呼吸幅度沒變化。

由表5可知，在干預4周時，與正常對照組比較，各組的心率均明顯下降（P＜0.01-0.05），睡眠剝奪組與睡眠剝奪+游泳組呼吸頻率，脈搏幅度和呼吸幅度均明顯降低（P＜0.01-0.05），但游泳組各指標出像明顯升高，與小鼠游泳未達到氣虛有關（P＜0.01）。與游泳組比較，睡眠剝奪組與睡眠剝奪+游泳組血氧飽和度與心率無明顯差異（P＞0.05），呼吸頻率下降，脈搏幅度升高，呼吸幅度均顯著性變?。≒＜0.01-0.05）。

2.5 小鼠脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)的變化

氣虛模型機體免疫功能紊亂降低。由表6可知，與正常對照組比較，4周時，睡眠剝奪組、游泳組、睡眠剝奪+游泳組均能引起小鼠脾臟指數(shù)下降，但無明顯差異（P＞0.05）胸腺指數(shù)睡眠剝奪組與睡眠剝奪+游泳組變大，差異明顯（P＜0.01）,游泳組無差異（P＞0.05）。與游泳組比較，睡眠剝奪組、睡眠剝奪+游泳組脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)無明顯差異（P＞0.05）。

2.6 小鼠脾臟淋巴細胞亞群的變化

由表7可知，與正常對照組比較，2周、4周時，睡眠剝奪組、游泳組、睡眠剝奪+游泳組均能引起小鼠體重明顯下降（P＜0.01）。與游泳組比較，睡眠剝奪組、睡眠剝奪+游泳組的體重變化不明顯（P＞0.05）。如表7顯示，T細胞亞群CD3+，CD4+，CD8+值干預組均明顯偏大，而CD19+B細胞活性降低（P＜0.01）。

表1 小鼠體質量的變化（x±s，n=12）

表1 小鼠體質量的變化（x±s，n=12）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與游泳組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

體重/g1天2周4周正常對照組18.6±1.08 34.5±3.25 37.6±2.71睡眠剝奪組18.7±1.09 30.9±1.99**34.6±1.83*##游泳組18.9±0.90 30.5±2.01**32.2±1.50**睡眠剝奪+游泳組18.6±0.82 28.8±2.27**31.5±2.35**分組

表2 小鼠抓力的變化（x±s，n=12）

表3 小鼠舌象的變化（x±s，n=12）

表4 小鼠2周脈搏的變化（x±s，n=12）

表5 小鼠4周脈搏的變化（x±s，n=12）

表6 小鼠脾臟、胸腺指數(shù)的變化（x±s，n=12）

3 討論

中醫(yī)氣虛證候的臨床癥狀表現(xiàn)為消瘦、神疲乏力、少氣懶言、面色淡白、舌淡苔白、脈細弱[13]。結合中醫(yī)氣虛證的理論，根據(jù)動物證候模型擬臨床研究的方法[14]，本課題組制訂了小鼠氣虛證的判定指標：用體重反映小鼠的消瘦情況，用小鼠抓力反映乏力情況，用舌面顏色變化反映小鼠舌像情況[15]，用呼吸幅度反映少氣的情況，用小鼠脈搏的幅度反映脈象的情況。

中醫(yī)理論認為“勞則氣耗”，目前開展氣虛模型的研究多遵此理論進行。最常用的方法就是力竭運動，如動物力竭游泳制作脾氣虛模型[16，17]與心氣虛模型[18]。此外，也有結合限制飲食方法制備氣虛模型[19]。

疲勞主要分為形體疲勞與神志疲勞，目前最常采用力竭游泳的方法多以“形體疲勞”為主。從目前中醫(yī)的臨床實踐來看，情志因素在氣虛證的形成過程中具有重要的作用，因此，開展神志疲勞誘導的氣虛模型的研究非常必要。睡眠剝奪（SleepDeprivation，SD）是指因環(huán)境或自身的原因喪失了所需要的睡眠量的過程或狀態(tài)[20]，其導致的中樞疲勞屬于神志疲勞。長時間的SD會使人或動物產(chǎn)生疲勞、免疫功能低下、激惹等不良的情緒狀態(tài)[21]。有學者采用水環(huán)境站臺技術剝奪大鼠快速動眼相睡眠來與手術病理造模比較，研究發(fā)現(xiàn)：睡眠剝奪可以制備心氣虛證大鼠模型[22]。同時，SD不僅引起精神疲勞，也引起機體疲勞，相較游泳力竭實驗也具有可操作性。因此，本實驗采用睡眠剝奪法制備小鼠氣虛模型，同時與力竭游泳進行了比較。

表7 小鼠脾臟淋巴細胞亞群的變化（x±s，n=12）

本實驗的結果顯示，睡眠剝奪、力竭游泳與睡眠剝奪+力竭游泳干預均能引起小鼠體重下降，抓力的變化與體重一致，表明三種方法均能引起小鼠乏力，三者之間無明顯區(qū)別。根據(jù)實驗結果，本實驗采取了SD的方法進行氣虛模型造模。脈搏幅度與呼吸幅度在兩周時模型組比正常組小，四周時差異更明顯，說明睡眠剝奪與力竭游泳均能引起小鼠脈象變細。脈搏數(shù)據(jù)中心率與呼吸頻率均變小，說明神勞與體勞均使小鼠脈搏變弱，綜合脈搏數(shù)據(jù)可得：干預組小鼠脈搏為細弱，達到氣虛的實驗目的。睡眠剝奪組與睡眠剝奪——游泳組脈搏數(shù)據(jù)各項參數(shù)較游泳組均明顯降低，且兩組間數(shù)據(jù)無差異，說明單純的睡眠剝奪法即可引起小鼠脈象呈現(xiàn)氣虛模型中的“細脈”與“弱脈”。根據(jù)實驗結果，睡眠剝奪造成的神疲乏力比游泳力竭造成的肌肉勞累更容易造成氣虛，而睡眠剝奪+游泳復合干預因素也未顯示明顯的氣虛效果，故可用睡眠剝奪干預四周模擬臨床氣虛證候。

臨床研究表明，氣虛證患者的細胞免疫、非特異性免疫、紅細胞免疫功能均降低[23]。本實驗結果表明，睡眠剝奪、力竭游泳、睡眠剝奪+力竭游泳三種方法均可使小鼠脾臟的T淋巴細胞升高，而B淋巴細胞確降低，且睡眠剝奪對小鼠淋巴細胞數(shù)的影響較強。進一步說明睡眠剝奪單因素即能夠影響機體免疫功能，從而達到中醫(yī)氣虛證候。

綜上所述，本實驗中三種造模方法均可成功制備氣虛模型。其中，睡眠剝奪造模方法簡單、可操作性強、重復性好。并且，睡眠剝奪法更能從病因角度反映“氣虛證”的形成過程，更符合現(xiàn)代人因不良生活方式而導致亞健康狀態(tài)的發(fā)病現(xiàn)狀。因此，從實驗結果分析及病因角度考慮，睡眠剝奪可以成為制備氣虛模型的一種首選方法。

1 李軍蘭,方肇勤. 氣虛證動物模型造摸方法綜述. 上海中醫(yī)藥大學學報, 2004,18(3):56-60.

2 盧文麗,方肇勤,潘志強,等. 四種不同品系小鼠氣虛血虛證候的比較與評價. 遼寧中醫(yī)雜志, 2007,34(4):519-522.

3 袁國強,吳以嶺,賈振華,等. 缺氧氣虛大鼠NEI網(wǎng)絡共同化學信號分子變化規(guī)律及通心絡干預作用. 第二軍醫(yī)大學學報, 2008,29(7):787-791.

4 席斌,田道法. 變應性鼻炎肺氣虛證與血清IL-4和IFN-7相關性的實驗研究. 時珍國醫(yī)國藥，2007,15(3):166-170.

5 明海霞,金戈,劉喜平,等. 益氣活血中藥對心氣虛證家兔血漿NO、ET的影響. 中醫(yī)研究, 2008,20(10):6-8.

6 楊遙,劉靜,徐江濤,等. REM睡眠剝奪對小鼠海馬tau蛋白磷酸化的影響. 臨床和實驗醫(yī)學雜志, 2014,13(1):4-7.

7 許光輝,吳艷萍，羅友華,等. 刺五加增強小鼠睡眠剝奪模型免疫功能和抗疲勞能力的實驗研究. 中國實驗方劑學雜志, 2012,18(23):173-175.

8 鄒慧莉,趙廣宇,宿長軍,等. 快速眼動睡眠剝奪對中樞5-羥色胺缺失小鼠orexin陽性神經(jīng)元活性的影響. 神經(jīng)解剖學雜志, 2009,25(3):312-316.

9 韓小燕,劉春雨. 蜂膠對力竭游泳小鼠紅細胞的保護作用. 貴州體育科技, 2014,(2):58-60.

10 劉佳,龍娟,胡維新,等. 人參莖葉總皂苷對負重游泳小鼠抗疲勞作用及其機制. 青島大學醫(yī)學院學報, 2013,49(3):221-223.

11 池愛平,郭歡歡,康堔喆,等. 五味子多糖的提取及其對高溫下游泳小鼠代謝的影響. 四川體育科學, 2014,(6):25-27.

12 王朝霞,王兆朋,賈青,等. 蝎毒多肽提取物對5-Fu干預H22荷瘤小鼠免疫功能的影響. 藥物評價研究, 2016,39(1):46-51.

13 冷偉,楊霓芝,樸勝華,等. 通脈口服液對氣虛血瘀證單側輸尿管梗阻大鼠腎小管間質病變的影響. 時珍國醫(yī)國藥, 2010,21(3):579-581.

14 劉洋,劉旭東,劉文俊,等. 基于脾氣虛的脾陽虛大鼠模型的復制方法及評價標準研究. 中國醫(yī)學創(chuàng)新, 2016,13(3):25-28.

15 馮玄超,郭淑貞,武志黔,等. 慢性心率衰竭模型大鼠氣虛血瘀證相關信息的評價. 中華中醫(yī)藥雜志, 2014,29(5):1563-1567.

16 施旭光,曾云桂,林榮鋒,等. 補中益氣湯不同黃芪藥量對脾氣虛大鼠糖代謝酶的影響. 中醫(yī)藥信息,2014,31(5) :23-26.

17 施旭光,王閩予,翟理祥,等. 補中益氣湯配伍對脾氣虛大鼠胃泌素及其基因表達的影響.中藥新藥與臨床藥理, 2012,23(6):609-612.

18 唐燁霞,程志清,姚立,等. 大鼠心氣虛模型的制備方法. 包頭醫(yī)學院學報, 2009,25(1):5-6.

19 黃志遠,黃家濤. 黃芪多糖對氣虛小鼠免疫功能的作用研究. 中國當代醫(yī)藥,2014,21(20):14-21.

20 趙翠霞,謝韜,袁雪芬,等. 睡眠剝奪對機體神經(jīng)行為機能的損害.中國慢性病預防與控制,2010,19(5) :541-543.

21 徐健,顏崇淮,沈曉月. 睡眠剝奪損害學習記憶能力的研究. 中國預防醫(yī)學雜志,2004,38(2):134-137.

22 趙明鏡,王碩仁,于成瑤,等. 兩種心氣虛證動物模型的對比研究.北京中醫(yī)藥大學學報,2006,29(8):525-529.

23 張茜,劉向國,武松. 肺氣腫肺氣虛證模型大鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)變化的實驗研究. 甘肅中醫(yī)學院學報,2006,23(1):20-22.

The Establishment and Evaluation of Qi Deficiency Syndrome of Mouse Model Induced by Sleep Deprivation

Gan Jiakuan, Fan Jingyi, Wang Dongzhi, Ren Junguo, Liu Jianxun
(Institute of Basic Medical Sciences / Key Laboratory of Pharmacology of Chinese Materia in Beijing, Xiyuan Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100091, China)

This study aimed at investigating the establishment and evaluation of qi deficiency syndrome in mice by comparing the three modeling methods involving sleep deprivation, exhausted swimming and the combination of sleep deprivation and exhaustive swimming. The mice were randomly divided into the control group, the sleep deprivation group, the exhausted swimming group and the combined group (sleep deprivation combined with exhausted swimming) with 12 ones in each group. Multi-platform water environment was applied to the mice of the sleep deprivation group with a 10-hour swim each day. Mice of the exhausted swimming group received loading swim of 10% of the body weight once a day. The mice of the combination group had accepted both the tests for 28 days. At the end of the experiment, the behavior tests and body weight were recorded, so were the holding force measured by force gauge, the heart rate, respiratory rate, respiratory amplitude and pulse amplitude tested by small animal noninvasive monitor, tongue images collected by digital camera and T cell subsets (CD3+, CD4+and CD8+) and B cell (CD19+) in the spleen detected by flow cytometry. Compared with the control group, it was found that the activity was reduced featuring fatigue in mice, while the body weight and holding force significantly decreased in the three groups (P ＜ 0.05 or 0.01). The tongue complexions of mice whitened in different degrees only in the combined group (P ＜ 0.05). And the heart rate, respiratory rate, pulse amplitude and respiratory amplitude were significantly decreased in mice of the sleep deprivation group and the combined group (P ＜ 0.05 or 0.01). The CD3+, CD4+, CD8+T cell subsets significantly increased in mice of the three groups (P ＜ 0.01), while CD19+B cells significantly decreased in mice of the sleep deprivation group (P ＜ 0.01). It was concluded that the three methods successfully built the mouse model of qi deficiency syndrome, while the sleep deprivation was the optimum modeling method.

Qi deficiency model, mouse, sleep deprivation, exhausted swimming

10.11842/wst.2016.10.022

R285.5

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

2016-09-28

修回日期：2016-10-25

＊ 科學技術部國家重點基礎研究發(fā)展計劃（973計劃）項目（2015CB554405）：氣血相關理論的生物學基礎研究，負責人：劉建勛。

＊＊ 通訊作者：任鈞國，研究員，主要研究方向：中藥藥理研究。