白芍提取物對PMS肝氣郁證大鼠下丘腦Cav1.2介導(dǎo)的CaM/CaMKⅡ/BDNF信號通路的影響＊

宋春紅，王杰瓊，李 芳，李自發(fā)，魏 盛，王美艷，薛 玲＊＊，姜運良

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 泰安 271018；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心 濟(jì)南 250355；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 濟(jì)南 250355；4.北京市豐臺區(qū)婦幼保健院 北京 100067）

白芍提取物對PMS肝氣郁證大鼠下丘腦Cav1.2介導(dǎo)的CaM/CaMKⅡ/BDNF信號通路的影響＊

宋春紅1，2，王杰瓊3，李 芳4，李自發(fā)2，魏 盛2，王美艷3，薛 玲3＊＊，姜運良1＊＊

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 泰安 271018；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心 濟(jì)南 250355；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 濟(jì)南 250355；4.北京市豐臺區(qū)婦幼保健院 北京 100067）

目的：本文主要探討白芍提取物對PMS肝氣郁證大鼠下丘腦Cav1.2鈣通道關(guān)鍵蛋白CACNA1C及其下游信號通路中CaM、BDNF蛋白表達(dá)和對CaMKⅡ磷酸化的影響，從而明確白芍提取物治療肝氣郁結(jié)證的分子作用靶點。方法：利用慢性束縛應(yīng)激法制備PMS肝氣郁證大鼠模型，使用白芍提取物進(jìn)行藥物干預(yù)。模型制備成功后檢測下丘腦CACNA1C蛋白表達(dá)，以及下游信號通路中CaM、BDNF蛋白表達(dá)和CaMKⅡ的磷酸化水平。離體培養(yǎng)海馬原代神經(jīng)元，通過KCl激活L型鈣通道，檢測白芍提取物中的有效成分單體芍藥苷對細(xì)胞內(nèi)鈣超載的影響。結(jié)果：PMS肝氣郁證大鼠下丘腦CACNA1C蛋白表達(dá)增加，CaMKⅡ磷酸化水平提高，BDNF表達(dá)減少，說明白芍提取物可顯著改善上述蛋白表達(dá)異常的現(xiàn)象，抑制KCl激活的L型鈣通道引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加。結(jié)論：白芍提取物可能是通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Cav1.2，抑制其下游CaM/CaMKⅡ信號通路的活化發(fā)揮治療PMS肝氣郁證的作用。

PMS肝氣郁證 白芍提取物 L型鈣通道α1C亞基基因 鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

白芍能養(yǎng)肝血，補(bǔ)肝陰，抑肝陽，為促進(jìn)肝主疏泄調(diào)暢情志活動的重要中藥之一。在現(xiàn)代中醫(yī)藥研究中，常用白芍治療抑郁。白芍提取物是從中提取的，經(jīng)過精制、濃縮、干燥而成的天然提取物。課題組前期研究表明白芍提取物對PMS肝氣郁證模型大鼠有治療作用[1]。CACNA1C基因編碼L型鈣通道（Cav）的α1C亞基，該亞基是構(gòu)成功能性鈣通道的主要成分，近年來研究表明CACNA1C基因多態(tài)性與情緒類疾病如精神分裂癥和重度抑郁發(fā)生有關(guān)，且與女性的發(fā)病更為密切[2]。研究者們認(rèn)為PMS的發(fā)生過程中易感的神經(jīng)生物學(xué)因子與重度抑郁癥相似[3]。本課題組前期研究表明PMS肝氣郁證大鼠L型鈣通道功能改變。那么白芍提取物治療PMS肝氣郁證與Cav1.2通道及其下游信號通路關(guān)系如何？本研究利用慢性束縛應(yīng)激方法制備PMS肝氣郁證大鼠模型。在整體動物水平檢測白芍提取物對PMS肝氣郁證大鼠下丘腦中CACNA1C蛋白的表達(dá)及其介導(dǎo)的CaM/ CaMKII信號的影響。在離體細(xì)胞水平，檢測芍藥苷對L型鈣通道（Cav）激活后細(xì)胞內(nèi)鈣離子的動態(tài)變化影響。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級健康雌性Wistar大鼠140-160 g，30只，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供[生產(chǎn)許可證號SCXK（魯）2011-0003]。大鼠購買后飼養(yǎng)于行為學(xué)實驗室一周，置于20±2℃晝夜顛倒的環(huán)境，每日21∶00開燈、9∶00關(guān)燈。除實驗期外自由飲食飲水。各組大鼠每日均由實驗操作者抓握移動，熟悉環(huán)境從而消除人為操作的影響。

1.2 實驗藥品與試劑

白芍提取物（青島陽光海川醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號：20110527）；CACNA1C鼠單克隆一抗（英國Abcam公司，貨號：ab58552）；CaM一抗（美國Sigma公司，貨號：SAB4503194）；CaM-PK II兔多克隆一抗（美國Cell Signaling Technology公司，批號：4436）；p-CaMKII（Thr286）兔多克隆一抗（美國Cell Signaling Technology公司，批號：3361）；BDNF兔單克隆一抗（美國Sigma公司，貨號：AV41970鼠單克隆一抗）；Tubulin兔單克隆一抗（美國Abmart公司，貨號：M2005）。山羊抗兔二抗（濟(jì)南遠(yuǎn)達(dá)晶美生物科技有限公司，貨號：SB20026619）；蛋白Marker（美國Thermo Fisher Scientific公司，貨號：SM0671，批號：26681），預(yù)染蛋白marker（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：26619）；蛋白酶抑制劑（美國Sigma公司，貨號：P8340）。Fluo-4（美國Life Technologies公司，貨號：F1420126619），Neurobasal培養(yǎng)基（美國Gibco公司，貨號：21103，批號：10888-022），B-27@ Supplement（50×）（美國Gibco公司，貨號：17504-044）。

1.3 實驗儀器

顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號：CX21）；大鼠曠場實驗箱（北京天鳴宏遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司，型號：XR-XZ301）；SDS-PAGE電泳儀、蛋白印跡轉(zhuǎn)移裝置（美國伯樂公司，型號：041BR86548）；凝膠成像系統(tǒng)（英國Syngene公司，型號：G：BOX Chemi XR5）。激光共聚焦顯微鏡（日本ZEISS公司，型號：LSM510）。

2 方法

2.1 PMS肝氣郁證大鼠模型制備、給藥及行為學(xué)評價

選用慢性束縛應(yīng)激法制備模型[4]。采用曠場實驗篩選得分相近大鼠進(jìn)入實驗，依陰道涂片鏡檢法確定大鼠的動情周期。根據(jù)陰道涂片結(jié)果，選擇動情周期處于非接受期（動情間期和動情后期）大鼠30只，標(biāo)記，稱重。按隨機(jī)數(shù)字表的方法將大鼠隨機(jī)分為3組,分別為正常對照組（簡稱正常組）、PMS肝氣郁證模型組（簡稱模型組）、PMS肝氣郁證造模給予白芍提取物組（簡稱白芍組）。白芍組在造模的同時每天上午9∶00灌胃給藥一次，每日給藥劑量為36 mg·kg-1（相當(dāng)于人臨床8倍劑量），持續(xù)造模過程整個階段。正常組和模型組大鼠給予相同體積的滅菌飲用水。造模完成后，即進(jìn)行曠場實驗，計算糖水消耗量以及強(qiáng)迫游泳實驗。

2.1.1 曠場實驗

給藥結(jié)束后，應(yīng)用XR-XZ301曠場實驗系統(tǒng)，XR-SuPerMaze動物行為視頻跟蹤分析系統(tǒng)，進(jìn)行曠場實驗。曠場箱尺寸L×W×H=100 cm×100 cm ×50 cm（大鼠），攝像采樣速度：15 幀/秒；每只大鼠觀察時間為6 min，每只大鼠實驗結(jié)束后使用酒精清潔曠場箱。

2.1.2 強(qiáng)迫游泳實驗

將大鼠放入水溫23℃、水深30 cm的透明玻璃桶中（高度：40 cm，直徑：20 cm），同時進(jìn)行視頻采集，15 min后，將實驗動物轉(zhuǎn)移至干燥環(huán)境30 min，待大鼠毛發(fā)干燥后將其移回鼠籠中，每只大鼠實驗結(jié)束后清潔圓筒并換水。實驗結(jié)束后使用視頻分析軟件進(jìn)行視頻分析，記錄懸浮不動時間、懸浮不動次數(shù)和潛伏期，其中懸浮不動為大鼠身體漂浮于水面身體輕微運動保持鼻孔露出水面。

進(jìn)行強(qiáng)迫游泳的同時應(yīng)用Smart 3.0行為學(xué)視頻采集與分析系統(tǒng)采集大鼠行為學(xué)數(shù)據(jù)（懸浮不動時間、懸浮不動次數(shù)），并通過后期觀看錄像記錄大鼠強(qiáng)迫游泳潛伏期。

2.2 腦組織取材

強(qiáng)迫游泳實驗完畢后，將大鼠稱重，斷頭處死，于冰上迅速剝離下丘腦裝入1.5 mL離心管中，立即置于液氮罐中迅速冷凍，后轉(zhuǎn)移入-70℃冰箱備用。

2.3 樣品蛋白濃度檢測

取出腦組織，室溫解凍，配裂解液（PMSF：RIPA =1：100），稱量組織重量，按照組織重量（mg）：裂解液體積（μL）=1：7.5比例加入裂解液，用組織勻漿器研磨組織至無組織塊。4℃ 13 000 rpm離心10 min，取上清液。按照蛋白上清液體積：5×Loading Buffer體積=1：4比例加入5×Loading Buffer，混勻后100℃水浴變性5-10 min，-20℃保存。按照BCA試劑盒說明書操作計算蛋白濃度。

2.4 Western bolt法測定下丘腦中相關(guān)蛋白的表達(dá)

以40 μg下丘腦總蛋白每泳道上樣，SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)移至NC膜上，將NC膜室溫震蕩2 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。分別于相應(yīng)的一抗（Anti-CACNA1C， 1：500；Anti-CaM，1：800；Anti-CaMKⅡ，1：1 000； Anti-p-CaMKⅡ，1：1 000；Anti-BDNF，1：1 000；Anti-Tubulin，1：2 000）搖床4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，室溫振搖。將NC膜放入二抗稀釋液中室溫振搖1 h。TBST洗膜3次，室溫振搖10 min最后用TBS洗膜1次，室溫振搖10 min。ECL發(fā)光液A液和B液等體積避光混勻，配成發(fā)光液。吸去NC膜表面的TBS，在目的條帶附近滴加發(fā)光液，最后使用成像儀成像。

2.5 芍藥苷對L型鈣通道激活后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

參照課題組之前的SOP體外培養(yǎng)大鼠海馬原代神經(jīng)元[5]，在培養(yǎng)至第7天加入芍藥苷，干預(yù)時間為24 h，細(xì)胞分組情況如下：空白組、芍藥苷高劑量組（200 μM）、芍藥苷中劑量組（100 μM）、芍藥苷低劑量組（50 μM）。用HBSS清洗細(xì)胞3次，加入Fluo-4染料1 mL，37℃，孵育45 min。洗凈Fluo-4染料，并使用HBSS將細(xì)胞外殘留的染料洗凈，再加入1 mL HBSS，孵育15 min，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子與染料充分結(jié)合。

圖1 各組大鼠曠場試驗得分以及糖水偏好率統(tǒng)計結(jié)果

利用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，采用one-way ANOVA進(jìn)行分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計意義。

3 結(jié)果

3.1 PMS肝氣郁證大鼠模型評價

3.1.1 各組大鼠的宏觀行為學(xué)表現(xiàn)

實驗前，各組大鼠均精神狀態(tài)良好活潑好動、毛有光澤、眼角干凈、球形糞便。第一天束縛時，模型組和給藥組大鼠表現(xiàn)為強(qiáng)烈的反抗、嘶叫、雙目圓睜、毛須豎立、糞便明顯增多；造模結(jié)束后，對照組大鼠的狀態(tài)與初期相同，模型組大鼠不活躍，精神萎靡，毛發(fā)散亂直立、眼神呆滯，大便變稀，反抗能力明顯降低；解開束縛紗布時，未見對峙，大多跑到角落不動。而給藥組大鼠在被抓時，叫聲較柔和，毛發(fā)較整潔，眼角干凈，與模型組相比活動明顯較多。

3.1.2 曠場試驗得分以及糖水偏好率

曠場試驗得分是動物探索行為及興奮性的總體反應(yīng)，本實驗結(jié)果如下圖1所示，造模前各組大鼠曠場試驗得分無顯著性差別；造模后，與正常組相比，模型組大鼠曠場實驗得分顯著性降低（P＜0.01）；白芍組無顯著性差異。造模前各組大鼠糖水消耗量無顯著性差別，造模后，與正常組相比，模型組大鼠糖水偏好率呈極顯著性降低（P＜0.001），白芍組大鼠無顯著性差別。

3.1.3 強(qiáng)迫游泳實驗

給藥后，大鼠非接受期懸浮不動時間結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組顯著性升高（P＜0.05）；與模型組相比，白芍組顯著性降低（P＜0.01）。大鼠懸浮不動次數(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組顯著性升高（P＜0.01）；與模型組相比，白芍組顯著降低（P＜0.01）。如圖2所示。

曝光時間100 ms，熒光參數(shù)為：激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm。每3 s收集一次圖片，采集240 s，第30 s向細(xì)胞中加入KCl，使其終濃度為100 mM。

2.6 數(shù)據(jù)分析

3.2 各組大鼠下丘腦Cav1.2介導(dǎo)的CaMKⅡ信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)與磷酸化水平

本實驗研究每組樣本量為6，主要觀察CaMKⅡ蛋白表達(dá)量及其磷酸化水平，詳見圖2、圖3。與正常組相比，模型組大鼠下丘腦中CACNA1C蛋白表達(dá)量顯著增加（P＜0.01），BDNF蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），CaMKⅡ蛋白的磷酸化水平顯著增加（P＜0.01），白芍組CaM蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，白芍組大鼠下丘腦中CACNA1C蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.01），CaM蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.01），BDNF蛋白表達(dá)量顯著增高（P＜0.01），CaMKⅡ蛋白的磷酸化水平顯著降低（P＜0.01）。

3.3 芍藥苷對海馬神經(jīng)元內(nèi)鈣離子濃度變化

實驗結(jié)果顯示，加入KCl后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加，如圖5、6所示。與對照組相比，芍藥苷各劑量組熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），且降低程度與劑量相關(guān)。

4 討論

本文從體內(nèi)外兩個水平研究了白芍提取物及其主要有效單體芍藥苷對PMS肝氣郁證大鼠腦中L型鈣通道（Cav1.2）介導(dǎo)的CaM/CaMKⅡ信號通路的作用。實驗結(jié)果表明Cav1.2介導(dǎo)的CaM/ CaMKⅡ在模型組大鼠中關(guān)鍵蛋白CACNA1C的蛋白表達(dá)和CaMKⅡ的磷酸化水平是升高的而BNDF蛋白表達(dá)降低；造模同時給予白芍提取物后大鼠下丘腦中上述蛋白無異常表達(dá)的現(xiàn)象。高濃度KCL在細(xì)胞內(nèi)可激活L型鈣通道，芍藥苷可顯著抑制由KCL引起的細(xì)胞內(nèi)鈣超載。

圖2 給藥后各組懸浮不動時間、次數(shù)比較

圖3 各組大鼠下丘腦CACNA1C及相關(guān)蛋白的Western Blot電泳圖

圖4 各組大鼠下丘腦CACNA1C及相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量

圖5 加KCl前后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度變化

圖6 添加KCL后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化

近年的研究認(rèn)為CACNA1C是精神情感障礙類疾病的易感基因之一[6]，基因敲除實驗表明經(jīng)基因修飾的CACNA1C-/-小鼠對二氫吡啶不敏感，硝苯地平對強(qiáng)迫游泳實驗的小鼠無抗抑郁作用，說明CACNA1C介導(dǎo)了LTCC拮抗劑的抗抑郁效果[7]。CACNA1C雜合基因敲除的小鼠可以改變抑郁癥狀的表型，同時L型鈣通道1.2亞型（Cav1.2）通道蛋白表達(dá)水平降低和LTCC通道電流減少。在臨床上L型鈣通道拮抗劑尼莫地平已經(jīng)應(yīng)用于情感障礙類疾病的治療[8]。本實驗發(fā)現(xiàn)在模型組下丘腦中CACNA1C蛋白表達(dá)升高，該蛋白的高表達(dá)可能就增加了LTCC的電流密度，因此使得細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，鈣離子與CaM結(jié)合后激活了CaMKⅡ，這與本實驗結(jié)果p-CaMKⅡ水平升高是一致的。CaMKⅡ磷酸化后作用的靶蛋白之一即是CREB，p-CaMKⅡ可使CREB的兩個位點發(fā)生磷酸化，這兩個位點分別是Ser133和Ser142，Ser133和Ser142位點的磷酸化分別能啟動和抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。研究認(rèn)為CaMKⅡ主要是對Ser142發(fā)揮作用。本實驗沒有購買到檢測Ser142位點磷酸化的CREB抗體，所以本文直接檢測了CREB調(diào)控的BDNF蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示模型組BDNF表達(dá)降低，而白芍組表達(dá)升高。這說明CaMKⅡ磷酸化后可能通過對CREB Ser142位點的磷酸化抑制了BDNF的表達(dá)。因此結(jié)合本實驗認(rèn)為下丘腦中CACNA1C高表達(dá)導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)CaM/ CaMKⅡ的激活與PMS肝氣郁證的發(fā)生有關(guān)。

白芍提取物中主要藥效成分芍藥苷具有促進(jìn)皮層神經(jīng)元生長，保護(hù)腦缺血后損傷的作用，可以改善神經(jīng)行為學(xué)癥狀，血腦屏障通透性，增加大腦局部血流量以及抗抑郁等作用[9]。而且研究結(jié)果也表明芍藥苷對神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用與抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載密不可分[10]。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)芍藥苷能通過抑制PC12細(xì)胞內(nèi)CaM/ CaMKⅡ來發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)的作用。結(jié)合本實驗結(jié)果，本文推測白芍提取物可能通過抑制Cav1.2介導(dǎo)的CaM/CaMKⅡ信號通路來發(fā)揮其治療PMS肝氣郁證的作用。

為驗證白芍提取物是否特異性作用于L型鈣通道，本研究使用L型鈣通道激活劑KCL激活海馬原代神經(jīng)元，利用熒光標(biāo)記結(jié)合激光共聚焦顯微鏡動態(tài)檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光強(qiáng)度變化。實驗選擇的是海馬原代神經(jīng)元細(xì)胞而沒有選擇下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞，主要原因如下：第一，海馬是神經(jīng)元原代培養(yǎng)的首選部位，該腦區(qū)所含神經(jīng)元密度高，非神經(jīng)元細(xì)胞相對較少，培養(yǎng)方法成熟；第二，24h內(nèi)新生鼠下丘腦體積非常小，從實驗動物福利角度選擇體積大的海馬腦區(qū)；第三，本文體內(nèi)實驗結(jié)果初步判斷白芍提取物可能會作用到L型鈣通道，在體外細(xì)胞的驗證中只要神經(jīng)元上表達(dá)L型鈣通道，實驗結(jié)果就能證實其特異性作用。

本研究體內(nèi)體外兩個層次驗證了白芍提取物對Cav1.2鈣通道的抑制作用，為該藥物在治療精神情感障礙類等情緒類疾病的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 李芳,宋春紅,魏盛,等.白芍提取物對經(jīng)前期綜合征肝氣郁證模型大鼠額葉5-HT（3A/3B）R分布與蛋白表達(dá)的影響.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2015,17(11):2267-2271.

2 Bigos K L, Mattay V S, Callicott J H, et al. Genetic variation in CACNA1C affects brain circuitries related to mental illness. Arch Gen Psychiatry, 2010, 67(9): 939-945.

3 Gingnell M, Comasco E, Oreland L, et al. Neuroticism-related personality traits are related to symptom severity in patients with premenstrual dysphoric disorder and to the serotonin transporter genelinked polymorphism 5-HTTPLPR. Arch Womens Ment Health, 2010, 13(5): 417-423.

4 魏盛,王海蘋,喬明琦.慢性束縛應(yīng)激及居住入侵法制備經(jīng)前期綜合征肝氣郁證大鼠模型的行為學(xué)觀測與分析.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2012,14(4):1848-1852.

5 李芳,喬明琦,葛慶芳,等.舒郁膠囊對大鼠海馬原代培養(yǎng)神經(jīng)元Ca2＋-CaM通路的作用.中國藥理學(xué)通報,2012,12:1762-1765.

6 Erk S, Meyerlindenberg A, Linden D E, et al. Replication of brain function effects of a genome-wide supported psychiatric risk variant in the CACNA1C gene and new multi-locus effects. Neuro Image, 2014, 94, 147-154.

7 Dao D T, Mahon P B, Cai X, et al. Mood disorder susceptibility gene CACNA1C modifies mood-related behaviors in mice and interacts with sex to influence behavior in mice and diagnosis in humans. Biol Psychiatry, 2010, 68(9): 801-810.

8 Wisner K L, Peindl K S, Perel J M, et al. Verapamil treatment for women with bipolar disorder. Biol Psychiatry, 2002, 51(9): 745-752.

9 Qiu F, Zhong X, Mao Q, et al. The antidepressant-like effects of paeoniflorin in mouse models. Exp Ther Med, 2013, 5(4): 1113-1116.

10 Wang D, Wong H K, Feng Y, et al. Paeoniflorin, a natural neuroprotective agent, modulates multiple anti-apoptotic and proapoptotic pathways in differentiated PC12 cells. Cell Mol Neurobiol, 2013, 33(4): 521-529.

11 Wang D, Tan Q, Zhang Z. Neuroprotective effects of paeoniflorin, but not the isomer albiflorin, are associated with the suppression of intracellular calcium and calcium / calmodulin protein kinase II in PC12 cells. J Mol Neurosci, 2013, 51(2): 581-590.

Extracts of Radix Paeoniae Alba Affects the Hypothalamic Cav1.2 Regulated by the CaM / CaMKII / BDNF Signaling in Premenstrual Syndrome (PMS) Rats with Liver-Qi Depression

Song Chunhong1,2, Wang Jieqiong3, Li Fang4, Li Zifa2, Wei Sheng2, Wang Meiyan, Xue Ling3, Jiang Yunliang1
(1. College of Animal Sciences, Shandong Agricultural University, Tai'an 271018, China;
2. Laboratory Animal Center , Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;
3. School of Pharmaceutical Sciences, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;
4. Department of Pharmacy, Fengtai Maternal & Children's Health Hospital of Beijing, Beijing 100069, China)

This study aimed to explore the impacts of the extracts from Radix Paeoniae Alba on hypothalamic CACNA1C, the key protein of Cav1.2 channel, and hypothalamic CaM and BDNF in its downstream, as well as the phosphorylation of CaMKⅡ in the hypothalamus in PMS rats with liver-qi depression. On this basis, the molecular targets of the extracts engaged in the treatment was confirmed. The PMS model rats with liver-qi depression were caused by chronic restraint stress taking the extracts from Radix Paeoniae Alba as its treatment. When verified success of the modeling of liver-qi depression, the hypothalamic protein expressions of CACNA1C, CaM and BDNF of its downstream and the phosphorylation of CaMKⅡ were detected. Then the hippocampal primary neurons were cultivated in vitro, in which the L-type calcium channels was activated by KCl to test the effects of paeoniflorin monomer, one of the active ingredients in the extracts, on intercellular calcium overload in the hippocampal neurons. In the experiment, it was found that the protein expressions of hypothalamus CACNA1C and p-CaMK II increased, while hypothalamus BDNF decreased significantly, which indicated that the extract of Radix Paeoniae Alba could regulate the abnormal expressions of the aforementioned proteins and inhibit the augmented intercellular calcium concentration caused by the activation the L-type calcium channels stimulated by KCl. In conclusion, it was demonstrated that the extract of Radix Paeoniae Alba could suppress the activation of CaM / CaMKⅡ signaling in its downstream by the regulation of intercellular Cav1.2 channels to achieve the efficacy of mitigating PMS liver-qi depression in rats.

Premenstrual syndrome model rat with liver-qi depression, the extracts of Radix Paeoniae Alba, L-type calcium channel α1 C subunit, calmodulin dependent protein kinase II, brain-derived neurotrophic factor

10.11842/wst.2016.10.021

R285.5

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-05-22

修回日期：2016-06-12

＊ 國家自然科學(xué)基金委青年科學(xué)基金項目（81473359）：Cav1.2介導(dǎo)的CaM/CaMKⅡ鈣信號通路在PMS肝氣郁證中的作用及舒郁膠囊干預(yù)機(jī)制研究，負(fù)責(zé)人：宋春紅；山東省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項目任務(wù)書（2013-025）：舒郁膠囊對抑郁癥模型大鼠海馬腦區(qū)鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ（ CaMKII）表達(dá)和分布的影響，負(fù)責(zé)人：宋春紅。

＊＊ 通訊作者：薛玲，教授，主要研究方向：中藥藥理學(xué)；姜運良，教授，主要研究方向：動物分子遺傳學(xué)。