基于代謝組學(xué)的茵陳蒿湯及組分配伍對大鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用研究＊

閆廣利，周小航，孫 暉，王揚陽，王玉影，王玉美，張愛華，王喜軍

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥血清藥物化學(xué)重點研究室/中美中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)合作中心 哈爾濱 150040）

基于代謝組學(xué)的茵陳蒿湯及組分配伍對大鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用研究＊

閆廣利，周小航，孫 暉，王揚陽，王玉影，王玉美，張愛華，王喜軍＊＊

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥血清藥物化學(xué)重點研究室/中美中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)合作中心 哈爾濱 150040）

目的：利用代謝組學(xué)技術(shù)，結(jié)合臨床生化檢測和組織病理學(xué)，評價茵陳蒿湯及其組分配伍對長期過量攝入酒精誘導(dǎo)肝損傷的保護(hù)作用。方法：對Wistar大鼠進(jìn)行“白酒—玉米油—吡唑”混合溶液灌胃和飼喂高脂飼料12周制備酒精性肝損傷大鼠模型，茵陳蒿湯及其組分配伍組分別于造模開始每日灌胃給予茵陳蒿湯和6,7-二甲氧基香豆素、京尼平苷、大黃酸配伍組合，12周末測定血清ALT、AST、ALP、TG、T-BIL、TP、ALB、CHOL、HA、LN、PCIIINP、CIV濃度和肝臟組織HYP、γ-GT、MDA、TBA、SOD和GSHPX含量，觀察肝左葉HE和Masson染色病理組織切片，并利用UPLC-Q/TOF-MS技術(shù)采集尿液代謝輪廓數(shù)據(jù)，提取各組樣品中酒精性肝損傷生物標(biāo)記物信息，分析空白對照組、模型對照組、茵陳蒿湯組及茵陳蒿湯組分配伍組之間大鼠代謝輪廓及生物標(biāo)記物的變化。結(jié)果：茵陳蒿湯及其組分配伍均能顯著抑制酒精性肝損傷大鼠血清ALT、AST、ALP、TG、T-BIL、TP、ALB、CHOL、HA、LN、PCIIINP、CIV濃度和肝臟組織HYP、γ-GT、MDA、TBA、SOD和GSH-PX含量的變化，減少肝臟細(xì)胞炎性浸潤和肝纖維化，并使肝損傷大鼠整體代謝輪廓遠(yuǎn)離模型對照組而靠近正常對照組，使10個生物標(biāo)記物趨于正常水平。結(jié)論 茵陳蒿湯對大鼠酒精性肝損傷具有顯著的保護(hù)作用，其3個組分6,7-二甲氧基香豆素、京尼平苷和大黃酸的配伍組合能夠有效表達(dá)茵陳蒿湯的生物效應(yīng)，是其主要有效組分，為茵陳蒿湯防治酒精性肝損傷疾病的創(chuàng)新藥物開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

茵陳蒿湯 6,7-二甲氧基香豆素 京尼平苷 大黃酸 酒精性肝損傷 干預(yù)作用 代謝組學(xué)

酗酒損害人的身體機(jī)能，甚至引起一系列的肝臟病變，例如酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化等肝損傷疾病[1]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，酒精消耗量在逐年上升，酒精性肝損傷疾病的發(fā)病率隨之不斷上漲，且已成為僅次于傳染性肝病的第二大類肝病。因此，亟待開發(fā)用于防治長期過量攝入酒精而誘導(dǎo)肝損傷疾病的有效藥物[2]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為酒為濕熱有毒之品，長期過量飲酒引起濕熱蘊結(jié)之證，治以清熱利濕為主[3，4]。茵陳蒿湯出自漢代張仲景《傷寒論》，具有清熱、利濕、退黃的功用，是治療濕熱黃疸的經(jīng)典方劑，臨床常用于治療病毒性肝炎、膽囊炎、膽石癥、鉤端螺旋體病等所引起的黃疸等證屬濕熱內(nèi)蘊者[5]。文獻(xiàn)報道，臨床以茵陳蒿湯為基礎(chǔ)方治療酒精性肝病[6，7]，相關(guān)藥效學(xué)研究表明：茵陳蒿湯能夠有效干預(yù)和治療長期酒精攝入誘導(dǎo)的大鼠肝損傷[8，9]，而且認(rèn)為酒精性肝病與茵陳蒿湯存在方證對應(yīng)關(guān)系[10]。

本課題組前期利用代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合肝功能檢測評價了茵陳蒿湯對酒精誘導(dǎo)的急性肝損傷的保護(hù)作用[11]，并結(jié)合中藥血清藥物化學(xué)方法，確證了6,7-二甲氧基香豆素、京尼平苷、大黃酸為茵陳蒿湯保肝作用的主要有效組分[12]。本研究制備慢性酒精性肝損傷大鼠模型，進(jìn)一步利用代謝組學(xué)技術(shù)，結(jié)合肝膽功能、肝臟脂肪病變、肝纖維化等相關(guān)臨床生化指標(biāo)和組織病理變化，評價茵陳蒿湯及其組分配伍對大鼠長期過量酒精攝入誘導(dǎo)肝損傷的保護(hù)作用，促進(jìn)茵陳蒿湯在防治酒精性肝損傷疾病中的應(yīng)用，以及為基于茵陳蒿湯的防治酒精性肝病創(chuàng)新藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

Acquity UPLC超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Micromass Q/TOF micro四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；ULTRA-TURRAX T25 Basic高速勻漿機(jī)（德國IKA公司）；KDC-160HR型高速冷凍離心機(jī)（中國科大創(chuàng)新股份公司）；電子分析天平（上海梅特勒·托利多有限公司）；SECOMAN BASIC半自動生化分析儀（法國SECOMAN公司）；UV MINI-1240型紫外分光光度計（日本SHIMADZU公司）；VX-II型多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）；Rotavapor R-3水浴加熱器（瑞士Buchi公司）。

1.2 藥品與試劑

茵陳蒿湯凍干粉：準(zhǔn)確稱取18 g茵陳蒿，加1.40 L水，煮沸，保持沸騰煎煮至700 mL，再加入9 g梔子和6 g大黃，再保持沸騰煎煮10 min，煎煮液紗布過濾，濾液濃縮至約1 g·mL-1，制成凍干粉。6,7-二甲氧基香豆素（純度達(dá)98%）、京尼平苷（純度達(dá)95%）、大黃酸（純度達(dá)95%），均為自制。

色譜級乙腈、色譜級甲酸（美國迪馬公司，批號分別為70121、12117）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料公司，批號：20130208）。60℃紅星二鍋頭酒（北京紅星股份有限公司，批號：20121130），玉米油（黑龍江興貿(mào)食品公司，批號：20120421），吡唑（美國阿拉丁公司，批號：S33638-326），生理鹽水（哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司，批號：20130131D1），烏拉坦（上海山浦化工有限公司，批號：20121011）。堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）測定試劑盒、總膽紅素（Total Bilirubin，T-BIL）測定試劑盒、白蛋白（Albumin，ALB）測定試劑盒、總膽固醇（Cholesterol，CHOL）測定試劑盒、甘油三酯（Triglyceride，TG）測定試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine Aminotransferase，ALT）測定試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate Amino Transferase，AST）測定試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號分別是130571、130961、130871、130261、130771、130370、131171）；羥脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）試劑盒、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathion Peroxidase，GSH-PX）試劑盒、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）試劑盒、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，γ-GT）試劑盒、總膽汁酸（Total Bile Acid，TBA）試劑盒、考馬斯亮藍(lán)總蛋白（KMAS）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別是20130512、20130315、20130612、20130423、230130202、20130325、20130421）；透明質(zhì)酸（Hyaluronic Acid，HA）試劑盒、Ⅲ型前膠原肽（Procollagen III N-termi，PIIINP）試劑盒、Ⅳ型膠原（Collagen IV，CIV）試劑盒，層粘連蛋白（Laminin，LN）試劑盒（北京北方生物工程研究所，批號分別是130420、130420、130420、130420）。

1.3 實驗動物

Wistar大鼠（清潔級），雄性，體重200±20 g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。飼養(yǎng)溫度25±3℃，濕度65%-75%，12 h蔽光，12 h光照，自由飲水飲食，適應(yīng)一周后開始實驗。

2 實驗方法

2.1 茵陳蒿湯及其組分配伍灌胃溶液的制備

取凍干粉適量，用0.3%CMC-Na溶液混懸，制成含生藥1.2 g·mL-1的溶液，作為茵陳蒿湯灌胃溶液。

精密稱取6,7-二甲氧基香豆素180 mg、京尼平苷90 mg、大黃酸60 mg，加少量甲醇制成真溶液，再用60 mL 0.3%CMC-Na溶液稀釋，研磨均勻，即得茵陳蒿湯組分配伍灌胃溶液。

2.2 動物分組及給藥

取預(yù)適應(yīng)的Wistar大鼠，按體重隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、茵陳蒿湯給藥組、組分配伍給藥組，每組12只。模型對照組、茵陳蒿湯給藥組和組分配伍給藥組大鼠每天灌胃給予“白酒-玉米油-吡唑”按6、2、24 g·kg-1的濃度組合混合成溶液（劑量為8 mL·kg-1），及飼喂高脂飼料（基礎(chǔ)飼料∶膽固醇∶豬大油=79∶1∶20），進(jìn)行造模[13]；同時，茵陳蒿湯給藥組和組分配伍組分別以10 mL·kg-1的劑量每天灌胃給予大鼠茵陳蒿湯灌胃溶液和3個組分配伍灌胃溶液，干預(yù)肝損傷病變過程。另外，空白對照組及模型對照組大鼠每天灌胃加入少量甲醇的0.3%CMC-Na溶液，并且空白對照組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)。各組大鼠于開始試驗后12周末，收集尿液、血液、肝組織，進(jìn)行臨床生化、組織病理和代謝組學(xué)評價。

2.3 樣品采集與處理

各組大鼠于末次給藥后禁食，收集夜晚12 h尿液，-80℃貯存；分析前水浴解凍，在4℃，13 000 r·min-1離心10 min，過0.22 μm濾膜，供UPLC-MS分析。收集尿液后，經(jīng)麻醉處理，腹主動脈采集血液樣本，室溫靜置30 min后，在4℃條件下5 000 rpm離心10 min，分離上層血清，按試劑盒說明操作，檢測血清ALT、AST、ALP、TG、T-BIL、ALB、CHOL、HA、LN、PCIIINP、CIV。大鼠取血后，用0.9%生理鹽水灌流1 min左右，至肝臟無色后摘取肝左葉按照HE和Masson染色方法制備病理組織切片，在200倍鏡下采集照片；其余肝臟組織制備成勻漿，按試劑盒說明操作，測定HYP、γ-GT、MDA、TBA、SOD和GSH-PX及蛋白定量。

2.4 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集

2.4.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLCTMHSS T3（100 mm×2.1 mm i.d.，1.8 μm）（美國Waters公司）；流動相：流動相A為0.1%甲酸乙腈，流動相B為0.1%甲酸水，線性梯度洗脫，0-2.5 min，1%-11%A；2.5-4.5 min，11%-21%A；4.5-7.0 min，21%-40%A；7.0-7.5 min，40%-50%A；7.5-10.0 min，50%-99%A；柱溫：45 ℃；流速：0.4 mL·min-1；進(jìn)樣量：3 μL。

2.4.2 質(zhì)譜條件

正、負(fù)離子掃描模式。電噴霧離子源；毛細(xì)管電壓3 000V；樣品錐孔電壓正離子模式25 V，負(fù)離子模式30 V；提取錐孔電壓正離子3.0 V，負(fù)離子模式2.5 V；脫溶劑氣溫度300℃；錐孔氣流量50 L·h-1；脫溶劑氣流量500 L·h-1。準(zhǔn)確質(zhì)量測定采用亮氨酸-腦啡肽（Leucine-Enkephalin，[M+H]+=556.277 1， [M-H]-=554.261 5）溶液為鎖定質(zhì)量溶液。質(zhì)量掃描范圍：m/z 50-1 000 Da。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

組間數(shù)據(jù)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 18.0中的單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行分析，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，兩組均數(shù)間的比較采用t檢驗，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

尿液樣品UPLC-MS數(shù)據(jù)導(dǎo)入Markerlynx軟件，設(shè)置參數(shù)提取每個樣品的“保留時間_質(zhì)荷比_峰面積”信息，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后利用嵌套的EZinfo 2.0模塊對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行非監(jiān)督的主成分分析（Principle Components Analysis，PCA），得到反映各組聚類程度的得分圖（Scores Plot），對模型組與空白對照組大鼠的尿液代謝輪廓數(shù)據(jù)進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（Orthonal Partial Least Square-Discriminate Analysis，OPLS-DA），獲得反映變量貢獻(xiàn)度大小的VIP-plot圖，選取VIP＞1.5且組間t檢驗P＜0.05的變量離子，作為潛在生物標(biāo)記物集合，進(jìn)一步利用二級質(zhì)譜信息及結(jié)合HMDB、KEGG、METLIN等組學(xué)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，確定酒精性肝損傷的生物標(biāo)記物，并利用MetPA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建內(nèi)源性生物標(biāo)記物的關(guān)聯(lián)代謝通路。觀察各給藥組對生物標(biāo)記物的回調(diào)程度，選取能夠顯著回調(diào)的生物標(biāo)記物作為各組的效應(yīng)生物標(biāo)記物，評價茵陳蒿湯及其組分配伍對酒精性肝損傷的干預(yù)作用。

3 實驗結(jié)果

3.1 對臨床生化指標(biāo)的影響

按照試劑盒說明書操作，測定各組大鼠臨床生化指標(biāo)，包括肝功能指標(biāo)血清AST、ALT濃度，肝纖維化指標(biāo)血清HA、LN、CIV、PIIINP濃度和肝組織HYP含量，肝臟氧化損傷指標(biāo)肝臟中SOD、GSH和MDA含量，脂代謝指標(biāo)血清TG、CHOL濃度，膽功能指標(biāo)血清ALP、TBA、ALB濃度和肝臟中γ-GT、TB含量，結(jié)果見表1、表2、表3。與空白對照組比較，模型對照組中各測定指標(biāo)均有極顯著差異（P＜0.01），表明大鼠長期攝入酒精并結(jié)合高脂飲食，其肝膽多種功能出現(xiàn)顯著損傷，并出現(xiàn)肝脂代謝紊亂和肝纖維化病變。與模型對照組比較，茵陳蒿湯組除了血清CHOL濃度的變化無顯著差異（P＞0.05）外，血清GSH濃度的回調(diào)具有顯著差異（P＜0.05），其它指標(biāo)的回調(diào)均具有極顯著差異（P＜0.01）；組分配伍組血清γ-GT、GSH、MDA濃度的回調(diào)具有顯著差異（P＜0.05），其它指標(biāo)的回調(diào)均具有極顯著差異（P＜0.01），表明茵陳蒿湯及其組分配伍均顯著抑制了大鼠肝膽功能損傷、肝臟氧化損傷、肝臟脂代謝紊亂及肝纖維化，具有顯著的保護(hù)酒精性肝損傷的作用。

表1 茵陳蒿湯及其組分配伍對酒精性肝損傷大鼠肝纖維化指標(biāo)的影響

表2 茵陳蒿湯及其組分配伍對酒精性肝損傷大鼠肝功能及膽功能指標(biāo)的影響

表3 茵陳蒿湯及其組分配伍對酒精性肝損傷大鼠血清白蛋白、脂代謝及肝臟氧化損傷指標(biāo)的影響

3.2 對組織病理學(xué)指標(biāo)的影響

各組大鼠肝左葉典型HE染色圖見圖1（A-D），圖中可見空白組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，染色均勻；模型組大鼠肝細(xì)胞排列紊亂，匯管區(qū)可見炎性細(xì)胞浸潤及肝竇充血；茵陳蒿湯組和組分配伍組均見大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)趨于正常，肝細(xì)胞呈放射狀排列，肝竇無充血。

各組大鼠肝左葉典型Masson染色圖見圖1（EH），圖中可見膠原纖維呈藍(lán)色，空白組大鼠有含量很少且規(guī)則排布的膠原纖維；模型組大鼠藍(lán)色區(qū)域成片，顯示有大量的膠原纖維；茵陳蒿湯組和組分配伍組大鼠與模型組大鼠相比，藍(lán)色區(qū)域均明顯減少。

3.3 對整體代謝輪廓及生物標(biāo)記物的影響

上述臨床生化及組織病理學(xué)觀察結(jié)果表明，結(jié)合高脂飲食，大鼠灌胃酒精12周誘導(dǎo)了肝膽功能損傷、肝氧化損傷、肝脂肪變及肝纖維化等肝損傷病變，酒精性肝損傷大鼠模型制備成功。利用UPLC-Q/TOF-MS技術(shù)采集12周末正常對照組、模型對照組、茵陳蒿湯組、茵陳蒿湯組分配伍組大鼠尿液的代謝輪廓數(shù)據(jù)，標(biāo)準(zhǔn)化處理后PCA分析的得分圖（見圖2），圖中可見各組數(shù)據(jù)聚類明顯，其中空白對照組與模型對照組偏離最遠(yuǎn)，茵陳蒿湯組和組分配伍組交織在一起，接近空白對照組，表明茵陳蒿湯和組分配伍組能夠抑制酒精性肝損傷大鼠代謝網(wǎng)絡(luò)的紊亂，并且具有相似的保護(hù)作用。

對空白對照組和模型對照組大鼠尿液UPLC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA分析，提取對組間分類貢獻(xiàn)度較大且t檢驗P＜0.05的變量離子進(jìn)行鑒定，結(jié)果確定了21個長期攝入酒精誘導(dǎo)大鼠肝損傷的生物標(biāo)記物[14]。從空白對照組、模型對照組、茵陳蒿湯組、組分配伍組經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后的尿液UPLC-MS數(shù)據(jù)中，提取這21個肝損傷生物標(biāo)記物的峰面積信息，作為它們在各大鼠體內(nèi)的相對表達(dá)水平，經(jīng)組間t檢驗分析，選取茵陳蒿湯組、組分配伍組分別與模型對照組比較具有顯著差異（P＜0.05）的標(biāo)記物作為效應(yīng)生物標(biāo)記物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在21個肝損傷生物標(biāo)記物中，茵陳蒿湯及其3個組分配伍均對其中10個生物標(biāo)記物具有顯著回調(diào)作用，見圖3。利用MetPA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建生物標(biāo)記物的關(guān)聯(lián)代謝通路，主要涉及?；撬岷蛠喤；撬岽x通路，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成通路，丙酮酸酯代謝，苯基丙氨酸代謝，表明6,7-二甲氧基香豆素、京尼平苷、大黃酸的配伍組合有效表達(dá)了茵陳蒿湯對酒精性肝損傷的保護(hù)作用，是茵陳蒿湯的主要有效組分。

圖1 茵陳蒿湯及其組分配伍對長期攝入酒精誘導(dǎo)肝損傷大鼠的肝臟組織病理學(xué)影響

圖2 茵陳蒿湯及其組分配伍對長期攝入酒精誘導(dǎo)肝損傷大鼠尿液代謝輪廓的影響

圖3 茵陳蒿湯及其組分配伍保護(hù)長期攝入酒精誘導(dǎo)大鼠肝損傷的效應(yīng)生物標(biāo)記物相對表達(dá)強(qiáng)度的比較

4 討論

長期過量飲酒引起的肝臟損傷涉及多個連續(xù)的病理變化，在啟動期及發(fā)展期依次出現(xiàn)酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化的病理過程，而肝纖維化進(jìn)一步發(fā)展可引起肝小葉結(jié)構(gòu)改建、假小葉及結(jié)節(jié)形成，即肝硬化。早期肝纖維化具有可逆性，但到后期有再生結(jié)節(jié)形成出現(xiàn)肝硬化時則不可逆，故酒精性肝纖維化的預(yù)防和逆轉(zhuǎn)對酒精性肝病的治療起著決定性作用[15]。本研究參考文獻(xiàn)[13]，采用白酒-玉米油-吡唑混合液灌胃結(jié)合喂飼高脂飲食的造模方法制備了伴有肝纖維化病變的酒精性肝損傷大鼠模型，在3個月的模型制備過程中，動態(tài)觀察了4周、7周、12周大鼠血清及肝組織的生化、病理變化，確定在第12周末造模大鼠出現(xiàn)肝纖維化病變，并伴有局部肝細(xì)胞脂肪變性和炎性浸潤的脂肪肝、肝炎病變，以及肝膽功能損傷和肝氧化損傷，表明典型酒精性肝損傷模型制備成功[14]。

茵陳蒿湯和6,7-二甲氧基香豆素、京尼平苷、大黃酸三個組分配伍組合均能夠抑制肝功能標(biāo)志物血清AST、ALT濃度的升高和ALB濃度的降低，抑制肝纖維化標(biāo)志物血清HA、LN、CIV、PIIINP濃度和肝組織HYP含量的升高，增加肝臟SOD、GSH含量和減少MDA含量，抑制脂代謝標(biāo)志物血清TG、CHOL濃度的升高，抑制膽功能指標(biāo)血清ALP、TBA濃度和肝臟中γ-GT、TB含量的升高，抑制肝細(xì)胞炎癥浸潤和纖維組織增生，表明茵陳蒿湯及其組分配伍能夠降低長期過量攝入酒精導(dǎo)致的肝膽功能損傷、肝臟脂質(zhì)過氧化損傷，并抑制肝纖維化和炎性病變，對酒精性肝損傷具有顯著的保護(hù)作用。而且，茵陳蒿湯與其三個組分的配伍組合對酒精性肝損傷的保護(hù)作用無顯著差異，表明6,7-二甲氧基香豆素、京尼平苷、大黃酸配伍組合有效表達(dá)了茵陳蒿湯對酒精性肝損傷的保護(hù)作用。

長期過量攝入酒精對機(jī)體的損傷是多方面的，其中肝損傷是主要病理變化。代謝組學(xué)從機(jī)體整體代謝表型的變化中表征外源性擾動對機(jī)體功能的影響，并探索與代謝表型變化相關(guān)的分子機(jī)制。本研究在成功制備酒精性肝損傷大鼠模型基礎(chǔ)上，利用代謝組學(xué)技術(shù)鑒定了21個關(guān)聯(lián)的生物標(biāo)記物，對酒精性肝損傷具有顯著保護(hù)作用的茵陳蒿湯能夠抑制其中10個生物標(biāo)記物的變化，使其趨于正常水平。文獻(xiàn)報道[10]，酒精性肝損傷大鼠模型病機(jī)為脾氣不足、濕熱內(nèi)蘊，而茵陳蒿湯能夠調(diào)控10個模型相關(guān)生物標(biāo)記物的變化，從以方測證角度分析認(rèn)為這10個生物標(biāo)記物可能反映了酒精性肝損傷大鼠模型濕熱內(nèi)蘊的生物學(xué)本質(zhì)。茵陳蒿湯10個效應(yīng)生物標(biāo)記物主要涉及?；撬岷蛠喤；撬岽x通路，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成通路，丙酮酸酯代謝通路，苯基丙氨酸代謝通路，其中，苯丙氨酸代謝通路中馬尿酸合成的減少與肝損傷存在密切相關(guān)關(guān)系，長期過量攝入酒精能夠減少體內(nèi)馬尿酸的合成，減低尿液中馬尿酸的濃度[16]；?；撬岷蛠喤；撬岽x通路中?；撬峥赊D(zhuǎn)化為2-羥基乙烷磺酸，而?；撬釋Ω闻K具有保護(hù)作用[17]；纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸生物合成通路和丙酮酸酯代謝通路的紊亂表明酒精性肝損傷造成機(jī)體氨基酸和糖類代謝的異常，這與文獻(xiàn)報道一致[18，19]。另外，值得注意的是，2-羥基乙烷磺酸、辛二酸在急性酒精性肝損傷大鼠模型中也發(fā)生代謝異常[20]。因此，茵陳蒿湯的10個效應(yīng)生物標(biāo)記物在多個代謝通路上反映了酒精性肝損傷濕熱內(nèi)蘊的生物學(xué)本質(zhì)。

綜上所述，茵陳蒿湯和6,7-二甲氧基香豆素、京尼平苷、大黃酸的配伍組合均能抑制肝膽功能損傷、肝臟脂質(zhì)過氧化損傷及肝纖維化和炎性病變，并均能使10個酒精性肝損傷生物標(biāo)記物趨于正常水平，對酒精性肝損傷具有相似的保護(hù)作用，6,7-二甲氧基香豆素、京尼平苷和大黃酸有效表達(dá)了茵陳蒿湯的生物效應(yīng)，是其保肝作用的主要有效組分。

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A Metabonomic Study on the Protective Effects of Yin Chen Hao Decoction and Its Component Group on Rats with Alcoholic Liver Injury

Yan Guangli, Zhou Xiaohang, Sun Hui, Wang Yangyang, Wang Yuying, Wang Yumei, Zhang Aihua, Wang Xijun
(Research Center of Chinmedomics-State Administration of TCM-Laboratory of Metabolomics / National TCM KeyLaboratory of Serum Pharmacochemistry / Sino-US Chinmedomics Technology Cooperation Center, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

The present investigation was designed to evaluate the protective effects of Yin Chen Hao Decoction (YCHD) and its component group consisting of scoparone, geniposide and rhein on rats with liver injury induced by long-term excessive intake of alcohol using metabonomic technologies and typical pharmacodynamics indexes. Wistar rats had been administered with the mixed solution of alcohol, corn oil and pyrazole and high fat diet for 12 weeks to establish the alcoholic liver injury rat model. At the start day of modeling, rats were intragastricly administered with YCHD and its component group involving scoparone, geniposide and rhein. At the end of the 12thweek, the serum concentrations of ALT, AST, ALP, TG, T-BIL, TP, ALB, CHOL, HA, LN, PCIIINP and CIV were detected and so were the contents of HYP, γ-GT, MDA, TBA, SOD and GSH-PX in the liver. Meanwhile, the pathological examinations of left lobe of liver sections were implemented with HE and Masson staining. Finally, urine endogenic metabolites profiling data and vital biological information of alcoholic liver injury were gleaned using UPLC-Q/TOF-MS-based metabonomic technology. The regulations of biomarkers in the control group, the model group, the YCHD group and the component group were quantified with the pattern recognition and statistics technology. As a result, YCHD and its component group successfully suppressed the changes of ALT, AST, ALP, TG, T-BIL, TP, ALB, CHOL, HA, LN, PCIIINP, CIA, Hyp, γ-GT, MDA, TBA, SOD and GSH-Px with the long-term excessive intake of alcohol. Liver inflammatory cell infiltration and liver fibrosis were improved, while the metabolic profile was far from the model group but close to the control group. Among the 21 biomarkers of alcoholic liver injury rats, 10 biomarkers recovered to normal levels. In conclusion, YCHD presented favorable effects on liver injury rats induced by the long-term excessive intake of alcohol. The combination of scoparone, geniposide and rhein played a representative biological role in the treatment of YCHD, which laid a foundation for the development of some innovative drugs of alcohol liver injury.

Yin Chen Hao decoction, scoparone, geniposide, rhein, alcoholic liver injury, therapeutic effect, metabonomics

10.11842/wst.2016.10.014

R285.5

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-09-19

修回日期：2016-10-12

＊ 國家自然科學(xué)基金委重點項目（81430093）：中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的系統(tǒng)分析方法學(xué)——中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究，負(fù)責(zé)人：王喜軍；科學(xué)技術(shù)部“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2015ZX09101043-011）：中藥經(jīng)典名方整合作用機(jī)制關(guān)鍵技術(shù)研究，負(fù)責(zé)人：王喜軍。

＊＊ 通訊作者：王喜軍，本刊編委，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥血清藥物化學(xué)及中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究。