基于細(xì)胞代謝組學(xué)技術(shù)的關(guān)黃柏潛在有效成分木蘭堿對前列腺癌細(xì)胞的治療作用研究＊

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（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥血清藥物化學(xué)重點(diǎn)研究室/中美中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)合作中心 哈爾濱 150040）

基于細(xì)胞代謝組學(xué)技術(shù)的關(guān)黃柏潛在有效成分木蘭堿對前列腺癌細(xì)胞的治療作用研究＊

張?zhí)炖祝?時，李先娜，張愛華，孫 暉＊＊

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥血清藥物化學(xué)重點(diǎn)研究室/中美中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)合作中心 哈爾濱 150040）

目的：本文在木蘭堿藥效學(xué)研究基礎(chǔ)之上，進(jìn)行基于UPLC-HDMS/MS技術(shù)的細(xì)胞代謝組學(xué)研究，探討木蘭堿抗前列腺癌的潛在作用機(jī)制。方法：將對數(shù)期22RV1前列腺癌細(xì)胞以適宜密度接種并分為空白組及木蘭堿給藥組，以細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、MTT比色法以及流式細(xì)胞術(shù)分析前列腺癌細(xì)胞系22RV1在給藥前后的細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞存活和增殖狀況以及藥物誘導(dǎo)凋亡的作用和作用強(qiáng)度，從藥效學(xué)角度評價木蘭堿的體外抗前列腺癌活性。進(jìn)一步提取前列腺癌細(xì)胞內(nèi)液并利用高通量液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)平臺對細(xì)胞代謝軌跡進(jìn)行研究，揭示木蘭堿給藥前后內(nèi)源性差異代謝物變化情況。結(jié)果：研究發(fā)現(xiàn)木蘭堿能通過誘導(dǎo)22RV1前列腺癌細(xì)胞凋亡而抑制其增殖，給藥后細(xì)胞生長狀況明顯變差，顯微鏡下難以見到分裂細(xì)胞，培養(yǎng)基中散在大量細(xì)胞碎片。本研究共鑒定了肌醇、鞘磷脂等13個藥效生物標(biāo)志物；代謝經(jīng)路研究顯示包括淀粉和蔗糖代謝、核黃素代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝等7條能量代謝及氨基酸代謝途徑發(fā)生明顯擾動。結(jié)論：木蘭堿對22RV1前列腺癌細(xì)胞系有明顯體外增殖抑制作用，潛在機(jī)制為對多種能量及氨基酸等代謝途徑的干預(yù)作用。本研究闡明木蘭堿治療前列腺癌的整體效應(yīng)機(jī)制，可為發(fā)現(xiàn)臨床有效且毒副作用小的抗前列腺癌藥物提供一定依據(jù)。

木蘭堿 前列腺癌 代謝組學(xué) 生物標(biāo)志物

前列腺癌（Prostate Cancer，PCa）是一種臨床常見的男性惡性腫瘤，發(fā)病隱匿、早期診斷較為困難，至癥狀出現(xiàn)并采取治療措施時往往已錯過最佳時機(jī)，還易發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移及骨轉(zhuǎn)移[1]，在歐美國家發(fā)病率居男性惡性腫瘤之首，死亡率則僅次于肺癌。近年來中國前列腺癌發(fā)病率也呈快速上升趨勢，嚴(yán)重威脅男性健康。傳統(tǒng)的治療手法包括激素治療及手術(shù)摘除，晚期前列腺癌以放、化療和免疫療法為主。但晚期前列腺癌病程后期往往轉(zhuǎn)化為激素抵抗型前列腺癌，內(nèi)分泌療法難以奏效[2-4]。同時傳統(tǒng)化療藥物有很大毒副作用以及多耐藥問題。因此從天然藥物中尋找高效低毒的抗癌活性成分，成為新藥研發(fā)的重要途徑。關(guān)黃柏為常用傳統(tǒng)中藥，被《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，是蕓香科黃柏屬植物黃檗Phellodendron amurense Rupr.的干燥樹皮。多種針對關(guān)黃柏的研究證實(shí)其具有抗菌消炎、抗癌、前列腺滲透、改善免疫力以及降壓等功效。近年來對黃柏所含的多種化學(xué)活性成分展開了深入研究，關(guān)黃柏主要活性成分是生物堿類，被認(rèn)為是其藥效的主要部分，如：小檗堿、木蘭堿等。本課題組前期研究表明木蘭堿是關(guān)黃柏主要入血成分之一。本研究以關(guān)黃柏潛在有效成分木蘭堿為研究對象，進(jìn)行前列腺癌細(xì)胞系22RV1體外增殖抑制的代謝組學(xué)研究，在藥效評價的基礎(chǔ)之上確定木蘭堿抗前列腺癌的藥效生物標(biāo)志物并進(jìn)行代謝通路的分析。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

本研究采用22RV1前列腺癌細(xì)胞系，該細(xì)胞系是常見的惡性前列腺癌細(xì)胞系，也是研究高侵襲性激素抵抗型前列腺癌的理想細(xì)胞系[5]。該細(xì)胞系經(jīng)由南京科佰生物科技有限公司進(jìn)口自美國ATCC細(xì)胞庫。

1.2 藥品與試劑

木蘭堿標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所。胎牛血清（美國Gibico公司，批號：10099-141）；胰蛋白酶（美國Hyclone公司，批號：SH30042.01B）；二甲基亞砜（DMSO）、MTT（美國Sigma公司，批號：M2128-100MG）；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液（美國Hyclone公司，批號：SH30027.01 1X）；Viacount細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（美國Millipore公司，批號：PF032-1EACN）。亮氨酸腦啡肽（美國Sigma公司）；乙腈、甲醇（色譜級，德國Merck技術(shù)有限公司）；甲酸（色譜級，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料公司）。

1.3 儀器與耗材

生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，型號：BSC-1100-LIIA2）；數(shù)顯加熱鍋（德國IKA公司，型號：HB10 digital）；流式細(xì)胞儀（美國Merck-Millipore公司）； CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司，型號：MCO-175）；倒置式基礎(chǔ)型顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號：IX51）；酶聯(lián)免疫分析儀（美國PerkinElmer公司）；高速低溫離心機(jī)（美國ThermoFisher公司，型號：ST-16R）；PB1501-N型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Waters AcquityTM UPLC液相色譜儀、Waters SynaptTM High Definition MS(HDMS/MS)System質(zhì)譜儀、MassLynx V4.1工作站（美國Waters集團(tuán)公司）；微孔濾器（美國Millipore公司）；多規(guī)格培養(yǎng)皿（丹麥Nunc公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

液氮凍存的22RV1人前列腺癌細(xì)胞系 37℃水浴快速融化，離心棄上清后細(xì)胞以含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，于CO2培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2，飽和濕度）內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，次日換液，并于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞生長至培養(yǎng)貼壁面積的 80%-90%時進(jìn)行傳遞培養(yǎng)。

2.2 體外腫瘤生長抑制試驗(yàn)

MTT比色法是用來檢測細(xì)胞存活和生長的一種方法。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測定等。利用MTT法檢測木蘭堿是否對22RV1前列腺癌細(xì)胞系具有增殖抑制作用，計(jì)算其抑制率及IC50值。精密稱定木蘭堿標(biāo)準(zhǔn)品5.48 mg以1 mL DMSO配制成16 mM濃度的母液，避光-20℃冷凍保存。臨用時以RPMI1640培養(yǎng)液稀釋至工作濃度（5、10、20、40、80、160 μM）進(jìn)行體外增殖抑制作用考察，考察時間設(shè)置為24、48、72 h。觀察藥物的體外增殖抑制作用，對照組抑制率為0%。

取對數(shù)生長期細(xì)胞按適宜密度接種于96孔培養(yǎng)板中，邊緣孔加入200 μL PBS溶液。培養(yǎng)24 h后按組別加入不同濃度的木蘭堿含藥培養(yǎng)液，設(shè)置空白培養(yǎng)基對照，每組設(shè)置6個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。到達(dá)相應(yīng)時間后用倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀況及形態(tài)改變并拍照記錄。然后先離心棄去培養(yǎng)液，每孔以PBS小心潤洗2-3遍后均加入20 μL MTT溶液（5 mg·mL-1），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 mL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD 570 nm處測量各孔的吸光值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，得到的各個孔吸光度OD值按以下公式計(jì)算抑制率：

抑制率%=（1-OD加藥組/OD對照組）×100%用平均抑制率作圖，應(yīng)用SPSS 19.0軟件計(jì)算IC50值。

2.3 Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡

凋亡是細(xì)胞死亡的一種基本形式，它在胚胎發(fā)育、組織分化和一些疾病發(fā)生過程中起著重要的調(diào)控作用。在該方法中FITC 標(biāo)記的Annexin V可以用來檢測細(xì)胞凋亡。Propidium Iodide（PI）被用來區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死或晚期凋亡細(xì)胞。本文研究木蘭堿對22RV1前列腺癌細(xì)胞系是否有誘導(dǎo)凋亡的作用。

調(diào)整細(xì)胞密度到大約 1×106細(xì)胞/mL。將 0.5 mL細(xì)胞懸液從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中（5×105個細(xì)胞）轉(zhuǎn)移到一個干凈的離心管內(nèi)。加入10 μL培養(yǎng)基結(jié)合試劑。加入1.25 μL Annexin V-FITC。室溫（18-24℃）避光反應(yīng)15 min。室溫1 000×g離心5 min，去除培養(yǎng)基。將細(xì)胞用0.5 mL 1×結(jié)合緩沖液輕輕重懸。加入10 μL PI。將樣本放置在冰上避光保存。立即用流式細(xì)胞儀檢測分析。

2.4 細(xì)胞代謝組學(xué)樣本制備

取對數(shù)生長期細(xì)胞按合適密度接種于48孔培養(yǎng)板中，邊緣孔加入200 μL PBS緩沖液。培養(yǎng)24 h后給藥組加入含木蘭堿40 μM的培養(yǎng)液，設(shè)置空白培養(yǎng)基對照，每組設(shè)置6個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后分別吸取培養(yǎng)液至標(biāo)記好的、對應(yīng)的A組潔凈離心管中，4℃、1 500 rpm離心5 min。以胰蛋白酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞開始變圓脫落后終止消化迅速轉(zhuǎn)移至標(biāo)記好的、對應(yīng)的B組潔凈離心管中，4℃、1 500 rpm離心5 min。A、B組均小心棄去上清，以PBS緩沖液合并對應(yīng)的A、B兩組離心后底層的細(xì)胞。以移液器輕輕吹打混勻后4℃、1 500 rpm離心5 min。棄去上清后重復(fù)PBS溶液清洗離心步驟一次。再次棄去上清后迅速加入1 mL 20℃冷甲醇淬滅細(xì)胞。適當(dāng)渦旋后將淬滅后的細(xì)胞于冰浴下超聲波破碎（20 W，3 min），充分釋放細(xì)胞內(nèi)容物。4℃、10 000 rpm離心15 min后取上清，過0.22 μm微孔濾膜后濾液供代謝組學(xué)分析。

2.5 細(xì)胞代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集

色譜條件：ACQUITY UPLCTM BEH C18（100 mm ×2.1 mm i.d.，1.7 μm）色譜柱；柱溫：40℃；流速：0.4 mL·min-1；進(jìn)樣量3 μL。流動相0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）；梯度洗脫條件：0-1 min，1%A；1-2 min，1%-40%A；2-5 min，40%-75%A；5-8 min，75%-99%A。質(zhì)譜條件：正、負(fù)離子模式，毛細(xì)管電壓正離子模式3.0 kV，負(fù)離子模式2.8 kV；錐孔電壓正離子模式30 V，負(fù)離子模式35 V；提取電壓3.0 V，離子源溫度110℃，脫溶劑氣溫度350℃，錐孔氣流量為50 L·h-1，脫溶劑氣流量600 L·h-1。亮氨酸-腦啡肽（[M+H]+=556.277 1，[M-H]-=554.277 1）溶液為鎖定質(zhì)量溶液。質(zhì)量掃描范圍：m/z 50-1 000。

2.6 數(shù)據(jù)處理

利用已建立的分析方法進(jìn)行樣品正、負(fù)離子模式全掃描，得到樣品組個體樣本的內(nèi)含三維信息的代謝輪廓圖。采用MassLynx V4.1軟件進(jìn)行色譜峰識別匹配，對數(shù)據(jù)提取和標(biāo)準(zhǔn)化處理后，利用Ezinfo 2.0軟件首先進(jìn)行無監(jiān)督模式的主成分分析（PCA），繪制出反映組間聚集和離散程度的PCA得分圖和3D-PCA得分圖。之后提取空白對照組及72 h給藥時間點(diǎn)樣本數(shù)據(jù)，進(jìn)行PCA分析，排除其他因素干擾獲得與藥物作用相關(guān)的得分圖。

為了找到對代謝輪廓變化起關(guān)鍵性作用的內(nèi)源性代謝物，對細(xì)胞代謝輪廓數(shù)據(jù)進(jìn)行配對偏最小二乘判別分析（Orthonal Partial Least Square-Discriminate Analysis，OPLS-DA）分析，獲得VIPPlot、Loading Plot。離中心越遠(yuǎn)的離子對對其分組貢獻(xiàn)越大。結(jié)合相關(guān)的反應(yīng)離子貢獻(xiàn)度的變量權(quán)重值（VIP）進(jìn)行分析，在VIP散點(diǎn)圖中，離子碎片呈V型排列，底部離子（VIP值?。瑢Υx輪廓軌跡產(chǎn)生變化的貢獻(xiàn)率??；頂端離子（VIP值大），對代謝輪廓軌跡產(chǎn)生變化的貢獻(xiàn)率大。在Loading plot中，依據(jù)載荷圖中距離遠(yuǎn)點(diǎn)越遠(yuǎn)，離子對代謝輪廓軌跡產(chǎn)生變化的貢獻(xiàn)越大。同時對各組所獲得計(jì)量資料信息數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較兩組間差別是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，基于P＜0.05作為篩查條件，作為潛在生物標(biāo)記物集合。為了驗(yàn)證多維統(tǒng)計(jì)中找到的差異物是否在統(tǒng)計(jì)上具有顯著差別，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)志性代謝物組間差異的顯著性。通過代謝物的精確質(zhì)核比在HMDB＊http∶//www.hmdb.ca/https∶//metlin.scripps.edu/和MTELIN＊＊http∶//www.hmdb.ca/https∶//metlin.scripps.edu/數(shù)據(jù)庫中搜索可能的結(jié)構(gòu)式進(jìn)行推測，對由統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的代謝物進(jìn)行檢索對比，確定差異代謝物及相關(guān)代謝途徑。

3 結(jié)果

3.1 體外腫瘤生長抑制實(shí)驗(yàn)

MTT實(shí)驗(yàn)顯示，木蘭堿對22RV1前列腺癌細(xì)胞系具有一定的增殖抑制作用，在設(shè)置的濃度范圍內(nèi)具有明顯的劑量和時間依賴性：木蘭堿作用濃度較低、作用時間較短時抑制作用較差，隨著劑量和作用時間的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)，48、72 h呈現(xiàn)較為明顯的增殖抑制作用。經(jīng)計(jì)算48 h的木蘭堿IC50值為到73.613 μM；72 h的木蘭堿IC50值達(dá)到45.455 μM。以上結(jié)果顯示木蘭堿對22RV1人前列腺癌細(xì)胞系較強(qiáng)的抗癌活性。詳見表1。

顯微觀察顯示，對照組細(xì)胞貼壁良好、延展充分、折光度好，培養(yǎng)基清澈無雜質(zhì)，可見大量分裂期細(xì)胞。而隨著木蘭堿作用時間的延長、濃度的升高，細(xì)胞呈現(xiàn)明顯生長抑制狀態(tài)：貼壁細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，培養(yǎng)液中密布細(xì)胞碎片。剩余貼壁細(xì)胞生長狀態(tài)較差，間距變大，生長受限，視野少見分裂期細(xì)胞。尤其160 μM木蘭堿作用72 h后可見視野中僅剩余少量貼壁細(xì)胞且生長狀態(tài)很差，多數(shù)細(xì)胞已經(jīng)死亡。詳見圖1。

3.2 Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡

Annexin V-FITC和PI雙染結(jié)果顯示：空白對照組細(xì)胞集中分布于流式散點(diǎn)圖左下象限，有極少熒光信號，說明對照組細(xì)胞無凋亡情況。而木蘭堿給藥組（160 μM）作用于22RV1前列腺癌細(xì)胞系24、48、72 h后，可見凋亡細(xì)胞比例逐漸增高并與72 h達(dá)到最高62.92%±2.21%（P＜0.01）。上述結(jié)果表明木蘭堿能顯著誘導(dǎo)22RV1前列腺癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，這一點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)道一致。詳見圖2。

3.3 細(xì)胞代謝組學(xué)分析

圖1 22RV1前列腺癌細(xì)胞形態(tài)觀察（×100）

表1 木蘭堿對22RV1前列腺癌細(xì)胞系增殖抑制作用（n=6）

圖2 木蘭堿誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞系22RV1凋亡作用

圖3 木蘭堿對22RV1前列腺癌細(xì)胞系體外增殖抑制作用的代謝組學(xué)評價

利用已建立的分析方法進(jìn)行樣品正、負(fù)離子模式全掃描，得到樣品組個體樣本的內(nèi)含三維信息的代謝輪廓圖。細(xì)胞代謝樣本的典型總離子流圖見圖3A。正、負(fù)離子模式下的PCA分析結(jié)果顯示空白組及木蘭堿組內(nèi)聚類良好并且在三維空間上組間組分明顯，表明木蘭堿給藥后22RV1前列腺癌細(xì)胞系代謝輪廓發(fā)生明顯改變（圖3B）。對VIP值貢獻(xiàn)大的潛在生物標(biāo)記物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，確定內(nèi)源性生物標(biāo)記物。采用HDMS/MS的方法測定標(biāo)記物的精確信息，得到測定誤差范圍內(nèi)相應(yīng)的可能的化學(xué)物分子式；通過分子式及分子質(zhì)量在HMDB及KEGG等檢索數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，結(jié)合MS/MS選出可能的一種或幾種化合物，最終通過色譜保留行為以及MS/MS數(shù)據(jù)來確定標(biāo)記物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。共鑒定出木蘭堿抗22RV1增殖作用的13個潛在生物標(biāo)記物，分別為：2-氧代-4硫代甲基丁酸（2-Oxo-4-methylthiobutanoic acid），2,3-亞甲戊二酸 （2,3-Methyleneglutaric acid），s-琥珀酰二氫硫辛酰胺（(S)-Succinyldihydrolipoamide），谷氨酰苯丙氨酸（Glutamylphenylalanine），7-羥基-6-甲基-8-核糖基二氫蝶呤（7-Hydroxy-6-methyl-8-ribityl lumazine），肌醇（Galactinol），泛酸4’-磷酸（D-Pantetheine 4'-phosphate），7-甲基鳥苷5磷酸（7-Methylguanosine 5'-phosphate），環(huán)狀磷脂酸(16∶0/0∶0)（CPA(16∶0/0∶0)），溶血磷脂酰膽堿(18∶1(9Z))（LysoPC(18∶1(9Z))），溶血磷脂酰膽堿(18∶0)（LysoPC(18∶0)），尿苷二磷酸乙酰葡萄糖胺（Uridine diphosphate-N-acetylglucosamine），鞘磷脂（d18∶0/16∶1(9Z)）（SM(d18∶0/16∶1(9Z))）。詳見表2。

將鑒定得到的木蘭堿抗前列腺癌相關(guān)的生物標(biāo)記物進(jìn)行MetPA分析，得到與治療作用密切相關(guān)的7個代謝通路，包括淀粉和蔗糖代謝、核黃素代謝、戊糖、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換、半乳糖代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、鞘脂類代謝、精氨酸和脯氨酸代謝。這些結(jié)果說明這些內(nèi)源性代謝產(chǎn)物在整個代謝軌跡中產(chǎn)生了強(qiáng)烈的擾動并且與木蘭堿治療作用密切相關(guān)（圖3D）。

4 討論

腫瘤是遺傳事件異常的不良后果，這一觀點(diǎn)得到了廣泛認(rèn)可[6-9]?；蛟谙到y(tǒng)生物學(xué)中處于上游部位，上游的異常經(jīng)過一系列級聯(lián)反應(yīng)不斷放大最終在多種層面產(chǎn)生一系列復(fù)雜后果。腫瘤細(xì)胞的代謝重編程包含了能量代謝、核酸代謝、脂肪酸代謝異常等多種事件的顯著改變[10]。代謝組學(xué)可以作為癌癥研究的一項(xiàng)有力工具[11]。關(guān)黃柏為常用傳統(tǒng)中藥，被《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，關(guān)黃柏性味苦寒，清熱瀉火而堅(jiān)陰“主五臟腸胃中結(jié)熱、黃疸、腸痔、止瀉痢、女子漏下赤白、陰傷蝕瘡”[12,13]。關(guān)黃柏主要活性成分是生物堿類，被認(rèn)為是其藥效的主要部分。按照結(jié)構(gòu)可劃分為原小檗堿類生物堿、阿撲嗎啡類生物堿、喹啉類生物堿和單萜吲哚類生物堿[14]。其中木蘭堿屬于阿撲嗎啡類生物堿。生物堿類多數(shù)具有生理活性，往往是許多中藥的起效成分[15]。結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)藥效學(xué)研究部分可以看出，木蘭堿對前列腺癌細(xì)胞系22RV1的體外增殖有明確抑制效果。本研究在藥物治療有效的基礎(chǔ)之上，從代謝譜的角度，揭示治療前后，對代謝輪廓的區(qū)分影響較大的生物標(biāo)志物以及相關(guān)代謝通路。通過標(biāo)志物的歸類、比較可以看出，代謝譜作為系統(tǒng)生物學(xué)下游的、具有終端表征特點(diǎn)的一類觀察角度，可以很好的反映藥效。

2,3-亞甲戊二酸是支鏈脂肪酸家族的一員。前列腺癌細(xì)胞的旺盛增殖和遷移、浸潤需要大量的能量，其能量需求依賴于線粒體脂肪酸β-氧化，即2,3-亞甲戊二酸參與的β-氧化過程很可能是前列腺癌細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展過程中的主要能量來源，能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞在代謝應(yīng)激狀態(tài)下的存活與增殖[16]。同時腫瘤細(xì)胞的大量增殖也需要膜的合成，這一過程同時依賴于脂肪酸的從頭合成過程。因此前列腺癌組織可見明顯的脂類代謝異常，支鏈脂肪酸如∶2,3-亞甲戊二酸的代謝異常介導(dǎo)了前列腺癌細(xì)胞的惡性增殖[17]。藥物治療后支鏈脂肪酸的水平降低表明黃柏活性成分木蘭堿能夠抑制前列腺癌細(xì)胞系22RV1的能量代謝，從一定程度上逆轉(zhuǎn)脂肪酸β-氧化代謝的異常，抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞干性丟失。

谷氨酰苯丙氨酸是γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（Gamma-Glutamyltransferase，γ-GT）這一關(guān)鍵酶作用于底物谷胱甘肽及苯丙氨酸的代謝產(chǎn)物。谷氨酰苯丙氨酸水平的異常增高可以反映谷胱甘肽代謝關(guān)鍵酶γ-GT活性的異常增高，使得谷胱甘肽經(jīng)過γ-GT作用與游離氨基酸結(jié)合，造成底物耗竭。谷胱甘肽是凋亡小體形成的必要條件之一，內(nèi)源性谷胱甘肽的含量降低使的其原生的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果減弱[18,19]。谷氨酰苯丙氨酸在給藥后顯著降低，可能是木蘭堿能夠抑制γ-GT活性，穩(wěn)定谷胱甘肽代謝從而改善前列腺癌發(fā)生時前列腺功能和癥狀。

7-羥基-6-甲基-8-核糖基二氫蝶呤（7-Hydroxy-6-methyl-8-ribityl lumazine）簡稱CRM，是核黃素代謝的產(chǎn)物，由6,7-二甲基-8-（1-D-核糖基）24

二氫蝶呤（ 6,7-Dimethyl-8-(1-D-ribityl)lumazine，DMDRL）轉(zhuǎn)化而來。核黃素代謝途徑的生理活性十分廣泛，是許多氧化還原酶系統(tǒng)的輔酶，因而核黃素代謝異?？梢杂绊懺S多代謝過程的正常進(jìn)行，如：能量代謝。核黃素穩(wěn)態(tài)增加可能是癌癥發(fā)生的一個環(huán)節(jié)，這一現(xiàn)象有助于增強(qiáng)癌細(xì)胞的能量代謝水平從而維持其快速生長和分裂過程[20]。在本實(shí)驗(yàn)中觀察到前列腺癌組由DMDRL轉(zhuǎn)化為CRM的途徑較給藥治療組為高，而治療后這一情況得到逆轉(zhuǎn)，由于核黃素代謝途徑影響的廣泛性，多種酶系的異常都可能得到一定程度的糾正，從而起到治療效果。

表2 木蘭堿抗22RV1增殖作用的潛在生物標(biāo)記物信息

2-氧代-4硫代甲基丁酸（2-Oxo-4-methylthiobutanoic acid，KMTB），是半胱氨酸和蛋氨酸代謝途徑的重要節(jié)點(diǎn)物質(zhì)之一，是甲硫基丙醛的直接前體物質(zhì)，而研究表明甲硫基丙醛具有強(qiáng)烈的誘導(dǎo)凋亡效果[21]。KMTB同時參與維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性與穩(wěn)定性。它可以參與泛酸和輔酶A代謝途徑中重要節(jié)點(diǎn)物質(zhì)硫酸泛酰巰基乙胺（又名泛酸-4-磷酸，D-Pantetheine 4'-phosphate）的合成，后者是泛酸和輔酶A生物合成的主要產(chǎn)物之一。KMTB的顯著降低可能與硫酸泛酰巰基乙胺含量呈現(xiàn)直接相關(guān)，木蘭堿給藥組即可觀察到這兩種小分子代謝產(chǎn)物相比前列腺癌組均呈現(xiàn)顯著下降趨勢。給藥后KMTB含量的下降，其直接原因可能是進(jìn)入下一步合成促凋亡物質(zhì)甲硫基丙醛合成增多，同時其穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)功能減弱，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡；另外半胱氨酸和蛋氨酸代謝途徑與下游的泛酸及輔酶A代謝有內(nèi)在聯(lián)系，后者直接參與包括能量代謝及多種物質(zhì)合成反應(yīng)的酶體系，其缺乏會導(dǎo)致相應(yīng)輔酶而受限，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖障礙，而起到增殖抑制效果。

參與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的磷脂類物質(zhì)在代謝中會產(chǎn)生許多磷脂代謝產(chǎn)物其中有許多物質(zhì)屬于重要的信號分子，直接參與細(xì)胞生長調(diào)控。環(huán)狀溶血磷脂酸CPA（16：0/0：0）是溶血磷脂酸類物質(zhì)的一種，該物質(zhì)經(jīng)給藥治療后明顯上升。它對DNA聚合酶有抑制作用的物質(zhì)，其含量升高可以對腫瘤細(xì)胞的遷移及浸潤起到顯著抑制效果，很可能與藥效學(xué)形態(tài)學(xué)觀察時，前列腺癌細(xì)胞的貼附以及伸展能力的降低直接相關(guān)，在體時應(yīng)能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動能力，這一作用也可能與CPA（16：0/0：0）參與膜結(jié)構(gòu)運(yùn)動能力相關(guān)[22]。SM（d18：0/16：1(9Z)）、LysoPC（18：0）以及LysoPC（18：1(9Z)）均屬于磷脂代謝的信號物質(zhì)分子，這些物質(zhì)的顯著改變表征了磷脂代謝紊亂所導(dǎo)致的細(xì)胞生長失調(diào)是癌癥進(jìn)程的一個重要標(biāo)志。

從以上潛在生物標(biāo)志物的生物學(xué)意義可以看出腫瘤在體內(nèi)是十分獨(dú)立而又獨(dú)特的代謝體系，木蘭堿能夠從一定程度上逆轉(zhuǎn)腫瘤這一代謝體系的代謝重編程過程，有助于腫瘤細(xì)胞內(nèi)異常代謝過程的糾正，從而平衡細(xì)胞凋亡逃逸、過度增殖等不良事件。從以上論述還可以看出一個問題，代謝限速酶作為復(fù)雜生化反應(yīng)體系當(dāng)中的關(guān)鍵成員，在代謝的重編程中占有重要地位，影響其下游多種物質(zhì)的代謝。因此，可以合理推斷木蘭堿對關(guān)鍵酶的影響可能是其作用關(guān)鍵之一，對關(guān)鍵限速酶活性的調(diào)節(jié)，抑制了包括能量代謝以及腫瘤營養(yǎng)供給等多個節(jié)點(diǎn)，造成腫瘤細(xì)胞增殖過程中的多個環(huán)節(jié)向正常組織細(xì)胞的方向回調(diào)從而產(chǎn)生治療作用。

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Therapeutic Effects of Magnoline Acting as a Potential Effective Component of Phellodendron Amurense Rupr. on Prostate Cancer Based on the Cell Metabolomics

Zhang Tianlei, Qiu Shi, Li Xianna, Zhang Aihua, Sun Hui
(Research Center of Chinmedomics-State Administration of TCM-Laboratory of Metabolomics / National TCM Key Laboratory of Serum Pharmacochemistry / Sino-US Chinmedomics Technology Cooperation Center, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

This study explored the mechanism behind the inhibitory effects of magnoline on proliferation of human prostate cancer cell line 22RV1 with cell metabolomic technology, for example, the UPLC-HDMS/ MS, based on pharmacodynamics studies of magnoline. The prostate cancer cell line, 22RV1, in the period of logarithmic phase, was inoculated with an appropriate density and divided into the control group and the magnoline group. Compared with those before any treatment, cell morphological changes, cell survival rate, its proliferation, the effectiveness of drug induced apoptosis and its intensity were analyzed after administration, with the cell morphological observation, MTT assay and flow cytometry analysis. On the basis, the antitumor activity of magnoline in prostate cancer was evaluated in vitro in terms of pharmacodynamics. Moreover, the intercellular fluid of prostate cancer cells was extracted to explore the cellular metabolic trajectory with the utilization of high-throughput HPLCMS technology and expounded the differences of endogenous metabolites before and after the administration of magnoline. It was found that magnolia inhibited the proliferation of 22RV1 in a dose and time dependent manner by the apoptosis induction of 22RV1 compared with the control group. And the cells were growing in a state of sickness after administration featuring rare sprinter cells and massive cell debris under the microscope. Furthermore, the cell metabolomic study based on UPLC-HDMS/MS was conducted to reveal the underlying mechanism of pesticide effect. A total of 13 pharmacodynamic biomarkers with the instance of inositol and sphingomyelin were identified. Metpa analysis was applied to find out 7 obviously disturbed metabolic pathways, including starch and sucrose metabolism, riboflavin metabolism, cysteine and methionine metabolism. In conclusion, magnoline suppressed the proliferation of the prostate cancer cell line, 22RV1, in vitro, behind which the potential mechanism was the therapeutic effect of metabolic pathways, such as energenic metabolism and amino acid metabolism. This study elucidated the integral effect of magnoline on treating prostate cancer, which laid a foundation for the development of anti-tumor drugs of prostate cancer with favorable efficacy and less side effect in clinic.

Magnoline, prostate cancer, metabolomics, biomarkers

10.11842/wst.2016.10.013

R285

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-09-19

修回日期：2016-10-13

＊ 國家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目（81173500）：基于知柏地黃丸配伍環(huán)境的關(guān)黃柏治療腎陰虛相火亢盛的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究；負(fù)責(zé)人：孫暉。

＊＊ 通訊作者：孫暉，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥血清藥物化學(xué)及中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究。