基于中醫(yī)方證代謝組學(xué)的生脈散干預(yù)老年癡呆癥大鼠的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究＊

盧盛文，孔 玲，初 航，韓 瑩，韓金偉，劉志東，王喜軍

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥血清藥物化學(xué)重點(diǎn)研究室/中美中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)合作中心 哈爾濱 150040）

基于中醫(yī)方證代謝組學(xué)的生脈散干預(yù)老年癡呆癥大鼠的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究＊

盧盛文，孔 玲，初 航，韓 瑩，韓金偉，劉志東，王喜軍＊＊

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥血清藥物化學(xué)重點(diǎn)研究室/中美中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)合作中心 哈爾濱 150040）

目的：本實(shí)驗(yàn)主要利用中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)評(píng)價(jià)生脈散預(yù)防老年癡呆的藥效及發(fā)現(xiàn)其關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)。方法：首先采用灌胃三氯化鋁聯(lián)合腹腔注射D-半乳糖連續(xù)90天建立老年癡呆大鼠模型，并利用UPLC-HDMS技術(shù)采集和分析模型大鼠尿液代謝數(shù)據(jù)，共確定了42個(gè)老年癡呆癥的生物標(biāo)記物；同時(shí)干預(yù)組在造模同時(shí)采用連續(xù)給與生脈散凍干粉溶液（5.3 g·kg-1）對(duì)模型大鼠進(jìn)行治療。結(jié)果：通過Morris水迷宮、腦組織病理學(xué)檢測(cè)及Aβ免疫組化等方法評(píng)價(jià)了生脈散的干預(yù)作用，發(fā)現(xiàn)了生脈散具有抑制Aβ毒性、保護(hù)神經(jīng)元和改善認(rèn)知障礙的作用；在此基礎(chǔ)上利用代謝組學(xué)技術(shù)評(píng)價(jià)了干預(yù)組對(duì)42個(gè)老年癡呆生物標(biāo)志物的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)生脈散主要影響了色氨酸代謝和脂質(zhì)代謝的多個(gè)靶點(diǎn)；同時(shí)采用血清藥物化學(xué)方法研究了生脈散的體內(nèi)直接作用物質(zhì)，找到30種成分并與生脈散明顯回調(diào)的生物標(biāo)志物相關(guān)聯(lián)。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了五味子木質(zhì)素類及人參皂苷類的多種成分與色氨酸代謝和脂質(zhì)代謝極度相關(guān)，為生脈散預(yù)防老年癡呆的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

方證代謝組學(xué) 生脈散 老年癡呆癥 色氨酸代謝 脂質(zhì)代謝

老年癡呆癥是一種神經(jīng)退行性疾病，以記憶障礙作為典型癥狀。目前缺乏有效的治療藥物[1]。中醫(yī)理論認(rèn)為老年癡呆癥屬于“善忘”和“健忘”的范疇，與臟腑功能、氣血運(yùn)行和情志等多種因素有關(guān)[2,3]。其治則以調(diào)節(jié)臟腑功能，運(yùn)行氣血為主。生脈散屬補(bǔ)益劑，補(bǔ)肺氣養(yǎng)心，《醫(yī)方論·卷三·清暑之劑》云：“肺主氣，心主血，生脈散養(yǎng)心肺之陰，使氣血得以榮養(yǎng)一身”?，F(xiàn)代臨床使用生脈散治療老年癡呆癥也取得了一定的療效[4-6]。生脈散由人參、麥冬和五味子組成,含有多種活性成分[7-9]。但是這些成分中哪些是有效成分，它們又如何在體內(nèi)相互配合發(fā)揮藥效目前尚不清楚。因此生脈散的藥效評(píng)價(jià)及發(fā)現(xiàn)藥效物質(zhì)成為了科學(xué)闡明生脈散抗老年癡呆機(jī)制及新藥開發(fā)的前提。

生脈散作為方劑具有復(fù)雜的成分體系和體內(nèi)的作用靶點(diǎn)，目前缺乏非導(dǎo)向性的多靶點(diǎn)藥物評(píng)價(jià)方法及藥物篩選方法。而中醫(yī)方證代謝組學(xué)的出現(xiàn)有望填補(bǔ)這個(gè)領(lǐng)域的空白[10]。該方法通過代謝組學(xué)技術(shù)系統(tǒng)評(píng)價(jià)證候的生物學(xué)特點(diǎn)，以特征性生物標(biāo)記物建立中藥的藥效評(píng)價(jià)體系。本文通過“證候診斷-方劑效應(yīng)評(píng)價(jià)-體內(nèi)直接作用物質(zhì)分析”研究思路建立證候與方劑之間的聯(lián)系[11,12]。根據(jù)這種方法本實(shí)驗(yàn)在灌胃三氯化鋁聯(lián)合腹腔注射D-半乳糖成功建立老年癡呆癥大鼠模型基礎(chǔ)上[13]，首先利用代謝組學(xué)技術(shù)系統(tǒng)評(píng)價(jià)了老年癡呆癥大鼠模型的尿液代謝特點(diǎn)。以老年癡呆特征性的生物標(biāo)志物建立生脈散的藥效評(píng)價(jià)體系；通過經(jīng)典的行為學(xué)、腦組織病理學(xué)檢測(cè)及Aβ免疫組化等經(jīng)典方法評(píng)價(jià)了生脈散的干預(yù)作用。在干預(yù)有效性的前提下分析了生脈散體內(nèi)直接作用物質(zhì)；并且將這些物質(zhì)與生脈散明顯調(diào)節(jié)的老年癡呆癥生物標(biāo)記物進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)了生脈散預(yù)防老年癡呆癥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為生脈散干預(yù)老年癡呆癥的作用機(jī)理及預(yù)防老年癡呆新藥開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Morris 水迷宮（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）；Histostar組織包埋機(jī)（德國Thermo Fisher Scientific公司）；HM 340E石蠟切片機(jī)（德國Thermo公司）；BX 60研究型顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；DP 72顯微攝像系統(tǒng)（日本OLYMPUS公司）；Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)；995 超低溫冰箱（美國Thermo Scientific公司）。美國Waters AcquityTMUPLC液相色譜儀（四元梯度泵-在線真空脫氣機(jī)-自動(dòng)進(jìn)樣器-二極管陣列檢測(cè)器-柱溫箱）；美國Waters SynaptTM G2-Si 質(zhì)譜分析系統(tǒng)；MassLynx V4.1工作站；Sorvall ST 16R臺(tái)式離心機(jī)（美國Thermo Scientific公司）；KQ-500DB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Nichipet EX微量取樣器（100-1 000 μL、10-100 μL，日本NICHIRYO公司）；氮吹儀（美國Organomation公司）；Lab Dancer S25圓周試管振蕩器（德國IKA公司）；固相萃取柱SPE（Oasis HLB 3cc 60mg，美國Waters公司）；Thermo Scientific 995 超低溫冰箱（美國Thermo Scientific公司）。

1.2 藥品與試劑

全須生曬參Panax ginseng C. A. Mey.、麥冬Ophiopogon japonicas（Thunb.） Ker-Gawl.、五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill購于北京同仁堂藥店；無水氯化鋁（分析級(jí)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；D-半乳糖（合肥Biosharp生物科技公司）。

乙腈（色譜級(jí)，德國Merck公司）；甲醇（色譜級(jí)，美國Fisher公司）；蒸餾水（中國廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；甲酸（色譜級(jí)，中國天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；亮氨酸腦啡肽（美國SIGMA公司）；戊巴比妥鈉粉末（上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)站）；氯化鈉注射液（哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司）；實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析級(jí)。

1.3 給藥樣品的制備

1.3.1 生脈散溶液制備

根據(jù)生脈散最早用藥量記載：“生脈散：人參，五錢，麥門冬，三錢，五味子，一錢五分，白水煎，溫服”（明·汪機(jī)《醫(yī)學(xué)原理》），折合現(xiàn)代用藥劑量為：人參15.625 g、麥冬9.375 g、五味子4.688 g；根據(jù)國家中醫(yī)藥管理局《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》制定生脈散煎藥方法：按照原方劑量稱取3種藥材放入450 mL蒸餾水中浸泡1 h后，武火將混合液煮沸后調(diào)至文火保持微沸1 h，用紗布過濾并收集濾液；濾渣中再加入300 mL蒸餾水重復(fù)以上過程2次。將3次的濾液混合放置室溫后進(jìn)行冷凍干燥制備凍干粉。將適量生脈散凍干粉溶于蒸餾水中，配制成生藥濃度為0.53 g·mL-1的生脈散灌胃溶液，大鼠灌胃劑量為5.3 g·kg-1。

1.3.2 氯化鋁溶液制備

稱取氯化鋁粉末（AlCl3）0.28 g置于100 mL容量瓶中，加入蒸餾水至刻度，充分混勻，配置成2.8 mg·mL-1的氯化鋁溶液。

1.3.3 D-半乳糖溶液制備

稱取D-半乳糖（D-galactose，D-gal）0.63 g置于100 mL容量瓶中，加入蒸餾水至刻度，充分混勻，配置成6.3 mg·mL-1的D-半乳糖溶液。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

取Wistar大鼠，雄性，9周齡，體質(zhì)量260±20 g共40只，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：P00102004。室溫飼養(yǎng)，動(dòng)物自由攝食飲水。適應(yīng)環(huán)境一周后,先將動(dòng)物進(jìn)行Morris水迷宮初篩，去除潛伏期小于50 s和游泳姿勢(shì)不良者，將合格大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組10只，AD模型組10只，生脈散干預(yù)組10只。

2.2 造模方法

大鼠灌胃給予AlCl328 mg·kg-1，同時(shí)腹腔注射D-半乳糖63 mg·kg-1，共90天復(fù)制老年癡呆癥大鼠模型。

2.3 樣品采集

AD模型組和干預(yù)組于每天下午2∶00復(fù)制老年癡呆癥大鼠模型，干預(yù)組每天上午8∶00按生藥量給予生脈散凍干粉溶液5.3 g·kg-1，空白對(duì)照組每天給予等量生理鹽水；實(shí)驗(yàn)開始后，每天夜間將老年癡呆癥模型和給藥組及空白組大鼠于置于大鼠代謝籠中，次日早8∶00收集夜尿，共計(jì)90天?？瞻讓?duì)照組、老年癡呆癥模型組和生脈散干預(yù)組于實(shí)驗(yàn)第85天進(jìn)行持續(xù)6天的行為學(xué)評(píng)價(jià)（Morris水迷宮）；于實(shí)驗(yàn)第91天采集各組腦組織樣本進(jìn)行免疫組化和HE染色法分析，以及血清樣本進(jìn)行體內(nèi)成分分析。

2.4 免疫組化和蘇木精-伊紅染色檢測(cè)

按照HE染色和免疫組化方法步驟制備海馬病理組織切片，并在40和100倍鏡下采集照片。

收集得到的尿液樣品于-4℃，13 000 rpm離心15 min后取上層清液，蒸餾水稀釋一倍，混懸振蕩30 s后，0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液2 μL進(jìn)UPLC-G2-Si。色譜條件：樣品分離采用超快速高效液相色譜系統(tǒng)，流動(dòng)相A為0.1%甲酸乙腈，流動(dòng)相B為0.1%甲酸水；柱溫預(yù)設(shè)：45℃；樣品倉溫度預(yù)設(shè)：4℃；流速：0.4 mL·min-1；色譜儀流出液不經(jīng)分流直接注入質(zhì)譜儀進(jìn)行正負(fù)離子掃描分析；梯度洗脫程序見表1。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）：采用SynaptTMG2-Si 質(zhì)譜分析系統(tǒng)（高分辨四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀）；脫溶劑氣流量：800 L·h-1；脫溶劑氣溫度：450℃；錐孔反吹氣流量：50 L·h-1；離子源溫度：110℃；錐孔電壓：20 V；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；鎖定質(zhì)量溶液：采用美國Waters公司Lockspray校正系統(tǒng)進(jìn)行在線質(zhì)量校正，亮氨酸-腦啡肽（Leueine-Enkephalin，正離子模式：[M+H]+=556.277 1，負(fù)離子模式：[M-H]-=554.277 1），溶液濃度為1 ng·mL-1，流速為5 μL·min-1；質(zhì)量掃描范圍：m/z 50-1 000 Da，掃描時(shí)間0.2 s；以centriod模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集；工作站：MassLynx V4.1工作站。

表1 代謝組學(xué)分析色譜洗脫梯度表

表2 生脈散體內(nèi)成分分析色譜洗脫梯度表

2.6 血中移行成分?jǐn)?shù)據(jù)采集方法

取模型大鼠及藥物干預(yù)大鼠血清各2 mL，緩慢通過已活化的Waters OASIS固相萃取柱，先用純凈水6 mL洗柱，然后用甲醇6 mL洗脫，收集洗脫液氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)?00 μL乙腈定容，混懸震蕩60 s，離心（13 000 rpm，4℃，10 min）取上清液供UPLCHDMS分析。

色譜條件：流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水，B為0.1%甲酸乙腈；柱溫預(yù)設(shè)：45℃；樣品倉溫度預(yù)設(shè)：4℃；流速：0.5 mL·min-1；進(jìn)樣體積：3 μL；色譜儀流出液不經(jīng)分流直接注入質(zhì)譜儀進(jìn)行正負(fù)離子掃描分析。色譜條件見表2。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）：采用SynaptTM G2-Si 質(zhì)譜分析系統(tǒng)（高分辨四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀）；脫溶劑氣流量：750 L·h-1；脫溶劑氣溫度：350℃；錐孔反吹氣流量：50 L·h-1；離子源溫度：120℃；錐孔電壓：30 V；毛細(xì)管電壓： 2.8 kV（正離子），3.0 kV（負(fù)離子）；鎖定質(zhì)量溶液：采用美國Waters公司Lockspray校正系統(tǒng)進(jìn)行在線質(zhì)量校正，亮氨酸-腦啡肽（Leueine-Enkephalin，[M+H]+=556.277 1），溶液濃度為1 ng·μL-1，流速為5 μL·min-1；質(zhì)量掃描范圍：m/z 50-1 000 Da，掃描時(shí)間0.2 s；以centriod模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集；工作站：MassLynx V4.1工作站。

2.7 數(shù)據(jù)處理方法

2.7.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件處理，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.7.2 代謝組學(xué)分析

本文提出了基于磁開關(guān)的近方波脈沖Marx發(fā)生器技術(shù)路線，摒棄了傳統(tǒng)發(fā)生器中的氣體開關(guān)與觸發(fā)系統(tǒng)，利用磁開關(guān)磁場(chǎng)的同步控制，保證各級(jí)開關(guān)同步導(dǎo)通。同時(shí)，基于多倍頻電壓脈沖的疊加原理，使得發(fā)生器具備輸出方波脈沖的能力。

將質(zhì)譜采集到的空白對(duì)照組與老年癡呆癥模型組大鼠尿液數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行監(jiān)督模式的主成分分析（OPLSDA），計(jì)算出各個(gè)離子的能反映組內(nèi)聚類和組間分離的貢獻(xiàn)度VIP值，同時(shí)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，篩選出組間差異P＜0.05的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的離子作為候選離子并進(jìn)行元素匹配及二級(jí)鑒定。

2.7.3 血中移行成分鑒定

將質(zhì)譜采集到的老年癡呆癥模型組和干預(yù)組兩組血液樣本數(shù)據(jù)通過有監(jiān)督模式的OPLS-DA分析，對(duì)能夠引起組間差異的離子進(jìn)行聚焦。選擇平均相對(duì)含量在老年癡呆癥模型組較低甚至沒有，而在干預(yù)組中含量較高的離子作為老年癡呆癥大鼠模型口服生脈散后的血中移行成分分析的研究對(duì)象，再進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，最終獲得入血成分信息。

3 結(jié)果

3.1 生脈散對(duì)大鼠老年癡呆模型干預(yù)作用的行為學(xué)評(píng)價(jià)

在定位航行實(shí)驗(yàn)過程中，與空白對(duì)照組大鼠相比，老年癡呆癥模型組大鼠逃避潛伏期時(shí)間顯著延長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；與老年癡呆癥模型組大鼠相比，生脈散干預(yù)組大鼠逃避潛伏期時(shí)間顯著縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），具體結(jié)果見圖1A。

圖1 生脈散對(duì)大鼠老年癡呆癥模型干預(yù)作用的宏觀評(píng)價(jià)

在空間搜索實(shí)驗(yàn)中，與空白對(duì)照組大鼠相比，老年癡呆癥模型組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與老年癡呆癥模型組大鼠相比，生脈散干預(yù)組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），具體結(jié)果見圖1B。

3.2 生脈散對(duì)大鼠老年癡呆模型干預(yù)作用的病理學(xué)評(píng)價(jià)

腦組織HE染色結(jié)果顯示（如圖1C），模型復(fù)制第91天老年癡呆癥模型組與空白對(duì)照組相比，大鼠的海馬CA3區(qū)神經(jīng)元排列松散，數(shù)量減少，神經(jīng)元細(xì)胞核逐漸呈現(xiàn)固縮狀，胞漿深紫，核膜胞膜界限模糊，可見壞死神經(jīng)元。干預(yù)組與老年癡呆癥模型組相比，大鼠腦組織皮層及海馬CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列緊密整齊，層次清晰，數(shù)量較多，細(xì)胞體大而飽滿，核仁清楚。

腦組織Aβ1-40免疫組化結(jié)果顯示（如圖1D），模型復(fù)制第91天老年癡呆癥模型組與空白對(duì)照組相比，大鼠腦組織皮層及海馬CA3區(qū)出現(xiàn)明顯的Aβ1-40黃棕色陽性斑塊。陽性反應(yīng)物多聚集在神經(jīng)元胞體，未見較大的陽性斑塊積聚。生脈散干預(yù)組與老年癡呆癥模型組相比Aβ1-40黃棕色陽性斑塊面積明顯減少，通過對(duì)Aβ1-40蛋白的相對(duì)含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，其減少程度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（如圖1E）。

3.3 生脈散對(duì)大鼠老年癡呆模型代謝輪廓及生物標(biāo)記物的影響

通過對(duì)第90天模型與空白組大鼠尿液數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLSDA分析（圖2A），發(fā)現(xiàn)了42個(gè)具有顯著差異（P＜0.05）的離子并進(jìn)行鑒定（見表3）。通過分類并按VIP貢獻(xiàn)值排布（圖2B），將這些差異代謝產(chǎn)物作為反映老年癡呆模型的潛在生物標(biāo)志物；其次將空白對(duì)照組、老年癡呆癥模型組與干預(yù)組大鼠標(biāo)準(zhǔn)化處理后的尿液數(shù)據(jù)行非監(jiān)督型主成分分析（PCA），得到了反映各組大鼠尿液代謝差異變化的Score plot圖（圖2C），從圖中可以看出，老年癡呆癥模型組與空白對(duì)照組完全分離，同時(shí)干預(yù)組具有一定的回調(diào)趨勢(shì)。在已鑒定的42個(gè)反映老年癡呆模型的潛在生物標(biāo)志物的基礎(chǔ)上研究生脈散的干預(yù)作用，通過標(biāo)志物在各組中的相對(duì)含量研究發(fā)現(xiàn)生脈散能夠回調(diào)25個(gè)異常代謝產(chǎn)物的水平，其中有2個(gè)具有顯著性差異，7個(gè)具有極顯著性差異（圖2D）。利用KEGG、HMDB等相關(guān)代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫將老年癡呆模型的潛在生物標(biāo)志物建立代謝網(wǎng)絡(luò)，并以各標(biāo)志物的VIP值來評(píng)價(jià)其貢獻(xiàn)度（圖3A），同時(shí)將生脈散能夠回調(diào)的標(biāo)志物的VIP值乘以生脈散的相對(duì)含量回調(diào)率來評(píng)價(jià)生脈散的干預(yù)作用（圖3B），發(fā)現(xiàn)生脈散對(duì)氨基酸代謝、核酸代謝、脂類代謝、多巴胺代謝、碳水化合物代謝、能量代謝、有機(jī)酸代謝都有不同程度的調(diào)節(jié)作用。通過生脈散干預(yù)作用評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)其最主要影響了色氨酸代謝和脂類代謝。

3.4 生脈散干預(yù)大鼠老年癡呆模型的血中移行成分與代謝標(biāo)記物相關(guān)性研究

通過有監(jiān)督模式的OPLS-DA分析（圖4A），得到了平均相對(duì)含量在老年癡呆癥模型組較低甚至沒有，而在干預(yù)組中含量較高的離子（圖4B），共鑒定30個(gè)生脈散血中移行成分。采用PCMS分析方法，分別計(jì)算這30個(gè)血中移行成分與生脈散能夠顯著回調(diào)的老年癡呆潛在生物標(biāo)記物效應(yīng)的Pearson相關(guān)系數(shù)；本次實(shí)驗(yàn)設(shè)置0.9≤| r |≤1為極度正（負(fù)）相關(guān)。生脈散干預(yù)組的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果如圖4C，其中13個(gè)血中移行成分與9個(gè)尿液代謝產(chǎn)物極度相關(guān)。色氨酸代謝和脂質(zhì)代謝是老年癡呆模型的關(guān)鍵異常代謝網(wǎng)絡(luò)，生脈散可以明顯調(diào)節(jié)色氨酸異常代謝的3個(gè)標(biāo)志物。其中γ-五味子醇甲、五味子乙素和當(dāng)歸酰戈米辛H（Angeloylgomisin H）與5-甲氧基色醇成極度負(fù)相關(guān)；五味子醇甲與3-甲基二氧吲哚成極度正相關(guān)；人參皂苷RK3和戈米辛D與順-4-癸烯酸成極度正相關(guān)。

4 討論

在由于老年癡呆癥的疾病機(jī)制和生脈散的藥物成分都十分復(fù)雜，在生脈散預(yù)防老年癡呆發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究中，常規(guī)的藥物活性成分篩選和作用機(jī)制研究方法多為多成分-單指標(biāo)、單成分-單指標(biāo)或單成分-多指標(biāo)的研究模式。即使有多成分-多指標(biāo)的研究過程，一般也是預(yù)先限定的多個(gè)目標(biāo)成分或指定的檢測(cè)指標(biāo)。這種非開放式的研究模式在早期探索階段意義重大，但是隨著藥物分析技術(shù)的不斷進(jìn)步，人們需要利用這些新技術(shù)開發(fā)新的研究方法，更客觀、真實(shí)、全面地研究生脈散預(yù)防老年癡呆的多成分作用機(jī)制。因此本次實(shí)驗(yàn)在利用經(jīng)典的行為學(xué)和病理學(xué)驗(yàn)證了生脈散干預(yù)老年癡呆作用的背景下，采用方證代謝組學(xué)研究模式深入研究生脈散多成分的作用機(jī)制。首先通過代謝組學(xué)技術(shù)開放式尋找機(jī)體的評(píng)價(jià)指標(biāo)，客觀分析了老年癡呆模型組大鼠的尿液異常代謝產(chǎn)物，以此來評(píng)價(jià)生脈散的多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)作用。發(fā)現(xiàn)生脈散對(duì)老年癡呆模型大鼠的42個(gè)生物標(biāo)記物有不同程度的調(diào)節(jié)作用，其中色氨酸及脂質(zhì)代謝異常具有明顯的調(diào)節(jié)作用。從代謝組學(xué)角度闡明了生脈散的多靶點(diǎn)作用機(jī)理；同時(shí)利用血清藥物化學(xué)技術(shù)分析了生脈散的體內(nèi)入血成分，并將這些入血成分與生脈散明顯回調(diào)的生物標(biāo)記物進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)五味子木質(zhì)素類成分和人參皂苷類成分與色氨酸代謝和脂質(zhì)代謝異常極度相關(guān)，其中γ-五味子醇甲、五味子乙素和當(dāng)歸酰戈米辛H與5-甲氧基色醇成極度負(fù)相關(guān)；五味子醇甲與3-甲基二氧吲哚成極度正相關(guān)；人參皂苷RK3和戈米辛D與順-4-癸烯酸成極度正相關(guān)。這些相關(guān)性成分將作為生脈散干預(yù)老年癡呆的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證研究。

圖2 生脈散對(duì)大鼠老年癡呆癥尿液潛在代謝標(biāo)記物的干預(yù)作用研究

圖3 生脈散干預(yù)老年癡呆尿液潛在生物標(biāo)記物代謝網(wǎng)絡(luò)影響評(píng)價(jià)圖

表3 老年癡呆模型大鼠尿液潛在生物標(biāo)記物的具體信息表

綜上所述，本次實(shí)驗(yàn)首先宏觀評(píng)價(jià)了生脈散對(duì)老年癡呆大鼠模型干預(yù)作用。在明確藥效作用背景下，采用方證代謝組學(xué)技術(shù)，以老年癡呆癥的生物標(biāo)記物為基礎(chǔ)，建立生脈散抗老年癡呆生物藥效評(píng)價(jià)體系對(duì)生脈散進(jìn)行抗老年癡呆的多靶點(diǎn)評(píng)價(jià)。同時(shí)與生脈散的體內(nèi)入血成分相關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)了生脈散干預(yù)老年癡呆的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。為中藥方劑生脈散的預(yù)防老年癡呆藥效評(píng)價(jià)，以及中藥成分抗老年癡呆新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

圖4 生脈散的入血成分與大鼠老年癡呆癥尿液潛在代謝標(biāo)志物的相關(guān)性研究

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A Research for Evaluating the Effectiveness and Discovering the Pharmacodynamic Substances of Sheng Mai San (SMS) in the Treatment of Alzheimer’s Disease (AD)

Lu Shengwen, Kong Lin, Chu Hang, Han Ying, Han Jinwei, Liu Zhidong, Wang Xijun
(Research Center of Chinmedomics-State Administration of TCM-Laboratory of Metabolomics, National TCM Key Laboratory of Serum Pharmacochemistry, Sino-US Chinmedomics Technology Cooperation Center, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

The aim of this study was to evaluate the effectiveness and discover the pharmacodynamic substances of SMS in the treatment of AD. AD model rats were successfully established with the 90-day continuous intragastric administration of aluminium chloride and intraperitoneal injection of D-galactose. Morris water maze test, histopathological staining and immunohistochemical staining were adopted to evaluate the progress of AD in model rats and the efficacy of SMS. Metabolomic technology platform was used to reveal the potential biomarkers and the metabolic network of AD and the target spots of impacted metabolic pathways after the administration of SMS. As a result, it was found that SMS performed the regulatory effects on certain metabolic pathways, in which tryptophan and lipid metabolism were involved in the main metabolic pathways influenced by SMS. Serum pharmacochemical technologies of TCM were introduced to investigate the constituents absorbed into the blood after lavage administration of SMS. In conclusion, the constituents were associated with target spots of influenced metabolic pathways which elucidated the pharmacodynamic basis. The components of lignins and their metabolites and ginsenoside were the most relevant materials of AD associated with tryptophan and lipid metabolism, which may be the pharmacodynamic basis of AD playing therapeutic roles of SMS.

Chinmedomics, Sheng Mai San, Alzheimer's disease, tryptophan metabolism, lipid metabolism

10.11842/wst.2016.10.011

R285

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-09-19

修回日期：2016-10-19

＊ 國家自然科學(xué)基金委重點(diǎn)項(xiàng)目（81430093）：中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的系統(tǒng)分析方法學(xué)——中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究，負(fù)責(zé)人：王喜軍；科學(xué)技術(shù)部“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項(xiàng)（2015ZX09101043-011）：中藥經(jīng)典名方整合作用機(jī)制關(guān)鍵技術(shù)研究，負(fù)責(zé)人：王喜軍。

＊＊ 通訊作者：王喜軍，本刊編委，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥血清藥物化學(xué)及中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究。