利用血液代謝組學(xué)研究關(guān)黃柏生物堿對(duì)慢性非細(xì)菌性前列腺炎模型大鼠的干預(yù)作用＊

孫 暉，李先娜，張 穎，李瑞芳，岳姝崎，張愛華，王喜軍

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心/國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥血清藥物化學(xué)重點(diǎn)研究室/中美中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)合作中心 哈爾濱 150040）

利用血液代謝組學(xué)研究關(guān)黃柏生物堿對(duì)慢性非細(xì)菌性前列腺炎模型大鼠的干預(yù)作用＊

孫 暉，李先娜，張 穎，李瑞芳，岳姝崎，張愛華，王喜軍＊＊

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心/國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥血清藥物化學(xué)重點(diǎn)研究室/中美中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)合作中心 哈爾濱 150040）

目的：本研究應(yīng)用行為學(xué)、組織病理學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)研究關(guān)黃柏生物堿對(duì)慢性非細(xì)菌性前列腺炎（Chronic Nonbacterial Prostatitis，CNP）的干預(yù)作用，從血液代謝組學(xué)角度闡釋關(guān)黃柏生物堿對(duì)CNP模型大鼠體內(nèi)代謝水平的影響及其作用機(jī)制。方法：通過對(duì)關(guān)黃柏進(jìn)行分離純化得到含量較高的關(guān)黃柏生物堿富集物，采用前列腺注射辣椒素的方法制備CNP模型大鼠，應(yīng)用UPLC-Triple TOF-MS/MS聯(lián)用技術(shù)建立CNP血液代謝組學(xué)研究方法，鑒定CNP生物標(biāo)記物及代謝通路，確定關(guān)黃柏生物堿對(duì)CNP干預(yù)作用的代謝途徑。結(jié)果：確定了與CNP密切相關(guān)的18個(gè)生物標(biāo)記物及14個(gè)代謝通路。關(guān)黃柏生物堿通過對(duì)花生四烯酸代謝、甘油磷脂代謝、嘌呤代謝等代謝通路的調(diào)節(jié)，可顯著對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)及12個(gè)CNP生物標(biāo)記物產(chǎn)生回調(diào)作用。結(jié)論：關(guān)黃柏生物堿可以有效干預(yù)CNP的發(fā)生與發(fā)展，本研究為抗CNP藥物的研究與開發(fā)提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

關(guān)黃柏 生物堿 代謝組學(xué) 慢性非細(xì)菌性前列腺炎

近幾年，中醫(yī)藥對(duì)疾病的診療效果被越來越多的國(guó)內(nèi)外學(xué)者所關(guān)注[1-3]，但由于缺少科學(xué)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)闡釋中醫(yī)藥治療疾病的作用機(jī)理，制約了中醫(yī)藥現(xiàn)代化的發(fā)展進(jìn)程。代謝組學(xué)將先進(jìn)的分析技術(shù)平臺(tái)與多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析相結(jié)合，通過對(duì)機(jī)體整體代謝輪廓的改變進(jìn)行分析，科學(xué)地闡釋中醫(yī)藥對(duì)疾病的治療效果及其作用機(jī)制，為中藥現(xiàn)代化發(fā)展提供科學(xué)的研究理念與技術(shù)方法[4-9]。

慢性非細(xì)菌性前列腺炎（Chronic Nonbacterial Prostatitis，CNP）是男性泌尿系統(tǒng)常見疾病之一，隸屬于中醫(yī)學(xué)的“精濁”、“白淫”、“淋證”范疇，其發(fā)病原因與腎氣虧虛、濕熱下注、瘀血阻止等病因相關(guān)[10,11]。關(guān)黃柏為蕓香科植物黃檗Phellodendron amurense Rupr.的干燥樹皮，具有清熱燥濕、瀉火解毒，除骨蒸、退虛熱的功效[12-14]。研究顯示關(guān)黃柏對(duì)骨關(guān)節(jié)炎、前列腺癌等相關(guān)疾病有顯著的治療效果[15-17]，結(jié)果充分證實(shí)了關(guān)黃柏作為傳統(tǒng)道地藥材治療腎陰虛相火亢盛及濕熱下注之痹癥的科學(xué)價(jià)值。然而關(guān)黃柏研究過多集中于化學(xué)成分及藥效研究，缺乏對(duì)其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制的深入闡釋[18]。文獻(xiàn)記載生物堿作為關(guān)黃柏主要有效成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等藥理作用[19-22]。本研究采用前列腺注射辣椒素的方法制備CNP模型大鼠，探究關(guān)黃柏生物堿對(duì)CNP的干預(yù)作用及其作用機(jī)制，為關(guān)黃柏治療CNP的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及CNP新藥開發(fā)提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司，型號(hào)：UVmini-1240）；分析天平（瑞士梅特勒公司，型號(hào)：PB1501-N型）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司，型號(hào)：Rotavapor R-3）；低溫超高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：Sorvall ST 16R）；液相色譜儀（美國(guó)AB Sciex公司，型號(hào)：ekspert ultra LC）；質(zhì)譜分析系統(tǒng)（美國(guó)AB Sciex公司，型號(hào)：Triple TOF）；色譜柱（美國(guó)Waters公司，型號(hào)：ACQUITYTM UPLC HSS T3）；研究型顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號(hào)BX60）；Waters Progenesis?QI（美國(guó)Waters公司，型號(hào)：LITR134789504）；MassLynx V4.1工作站（美國(guó)Waters公司，型號(hào)：720001408EN）；微量取樣器（日本NICHIRYO公司，型號(hào)：Nichipet EX）。

1.2 藥品與試劑

關(guān)黃柏Phellodendron amurense Rupr.（哈爾濱世一堂藥店，批號(hào)：140702），該藥材經(jīng)檢測(cè)符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。97%辣椒素（美國(guó)阿拉丁工業(yè)公司，批號(hào)：V107237）；吐溫80（天津市博迪化工有限公司，批號(hào)：津 Q/HG 3020-85）；甲酰胺（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：140915）；伊文思藍(lán)（上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：JK2513）；95%乙醇（北京試劑廠，批號(hào)：140921）；鹽酸小檗堿對(duì)照品（西安開來生物工程有限公司，批號(hào)：140701）； D151型陽離子交換樹脂（天津海光化工有限公司）；乙腈（德國(guó)Merck公司，批號(hào)：1491530121）；甲酸（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140812）；甲醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：140215）；蒸餾水（廣州屈臣氏，批號(hào)：20140506）。

1.3 樣品的制備

1.3.1 關(guān)黃柏生物堿的純化和富集

關(guān)黃柏粗粉500 g，加入10倍量70%乙醇回流提取3次，每次60 min，濾過，濾液置于分液漏斗中，加入乙酸乙酯萃取2次，合并水層溶液，減壓干燥，得關(guān)黃柏提取物。關(guān)黃柏提取物粉末加蒸餾水定容至1 000 mL，4 000 r·min-1離心10 min，上清液作為預(yù)處理藥液上樣至活化好的D151型陽離子樹脂，控制交換流速為1倍柱體積（BV）·h-1進(jìn)行吸附上樣，加入蒸餾水洗脫至無色，再加入50%乙醇洗脫除雜，最后用含5%鹽酸的70%乙醇以2.5 BV·h-1流速洗脫，收集9 BV洗脫液，將收集的洗脫液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，水浴揮干，減壓干燥得生物堿富集物。

1.3.2 辣椒素溶液的制備

精密稱定辣椒素23.472 g溶于10%乙醇溶液，10%吐溫80及80%生理鹽水溶液，配置成1 000 μmol·L-1辣椒素溶液。

2 試驗(yàn)方法

2.1 關(guān)黃柏生物堿及其富集物含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定鹽酸小檗堿對(duì)照品25 mg，置于250 mL容量瓶中，甲醇定容，即得對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

精密稱定3批關(guān)黃柏提取物200 mg、關(guān)黃柏生物堿富集物25 mg，置于250 mL容量瓶中，甲醇定容，即得關(guān)黃柏提取物供試品溶液和關(guān)黃柏生物堿富集物供試品溶液。

2.1.3 測(cè)定方法

精密吸取1 mL供試品溶液及對(duì)照品溶液置于分液漏斗中，加入pH 4.0的緩沖液7.5 mL，溴酚藍(lán)酸性染料溶液1.5 mL，振搖1 min，靜置10 min后加入氯仿10 mL，振搖1 min，靜置15 min，取下層溶液在UVmini-1240紫外可見分光光度計(jì)上于414.5 nm處測(cè)定吸光度。另取1.0 mL蒸餾水按上述方法進(jìn)行操作作為空白對(duì)照溶液。

2.1.4 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 mL置于10 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，精密吸取1.0 mL于分液漏斗中，按2.1.3項(xiàng)下測(cè)定方法進(jìn)行操作，在414.5 nm處測(cè)定吸光度值，以吸光度A值為縱坐標(biāo)，濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

重復(fù)性考察：平行制備6份關(guān)黃柏提取物供試品溶液，按2.1.3項(xiàng)下測(cè)定方法進(jìn)行操作，在414.5 nm處測(cè)定吸光度值并計(jì)算RSD值。

穩(wěn)定性考察：精密吸取1 mL供試品溶液，按2.1.3項(xiàng)下測(cè)定方法分別于0、1、2、6、12 h測(cè)定414.5 nm處測(cè)定吸光度。

加樣回收實(shí)驗(yàn)：精密稱定已知含量關(guān)黃柏生物堿提取物粉末適量與容量瓶中，加入一定體積對(duì)照品溶液，按2.1.3項(xiàng)下測(cè)定方法進(jìn)行操作，在414.5 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算回收率及RSD值。

2.2 動(dòng)物分組與給藥

雄性Wistar大鼠（清潔級(jí)），體質(zhì)量250±10 g，飼養(yǎng)溫度24±3℃，濕度65%-75%，自由攝食飲水，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK黑2015014。按照體重隨機(jī)分為空白組（KB）、模型組（MOD）、關(guān)黃柏生物堿給藥組（SWJ）每組10只。精密稱取關(guān)黃柏生物堿富集物適量，溶于0.5%CMC溶液中，配置成含關(guān)黃柏生物堿濃度為5.5 mg·mL-1灌胃溶液（給藥劑量以藥典記載人服用關(guān)黃柏臨床4倍劑量及經(jīng)測(cè)定關(guān)黃柏中生物堿含量換算關(guān)黃柏生物堿富集物給藥量），以10 mL·kg-1大鼠質(zhì)量給予灌胃溶液，空白組給予等體積CMC-Na溶液。給藥7天后，模型組和關(guān)黃柏生物堿給藥組大鼠制備CNP模型。造模方法：3%戊巴比妥鈉0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，腹部中下部切開小口，兩葉前列腺各注射0.1 mL辣椒素溶液，縫合?？瞻捉M為假手術(shù)組，腹部切開后，不注射辣椒素溶液，直接進(jìn)行縫合。

2.3 生物樣品采集與處理

造模第二天用3%戊巴比妥鈉0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，每組隨機(jī)選取5只大鼠，以50 kg·kg-1劑量股靜脈注射伊文思藍(lán)溶液，30 min后取大鼠前列腺，稱重，用于前列腺蛋白滲出量測(cè)定。另取剩余5只大鼠麻醉后，剝離出前列腺，剝離的新鮮前列腺組織放入生理鹽水中洗去血漬和污漬，用濾紙吸干，置福爾馬林中用于組織病理學(xué)檢測(cè)。

Wistar大鼠用3%戊巴比妥鈉0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，靜置20 min后4 000 r·min-1的條件下離心15 min，取血漿樣品2 mL，精密加入甲醇-乙醇（1：1）溶液8 mL，震蕩15 min，超聲3 min，13 000 r·min-1的條件下離心20 min；取上清液過0.22 μm濾膜，供UPLC-Triple TOF-MS/MS分析，用于血液代謝組學(xué)檢測(cè)。

2.4 行為學(xué)及組織病理學(xué)研究

2.4.1 經(jīng)典行為學(xué)研究

大鼠行為學(xué)觀察用來檢測(cè)模型大鼠注射辣椒素后是否出現(xiàn)疼痛癥狀，造模清醒后30 min內(nèi)，每10 min記錄大鼠閉眼及活動(dòng)狀態(tài)。閉眼評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：5分即完全睜開，1分即完全閉眼。移動(dòng)評(píng)分：5分即四周不?；顒?dòng)，1分即完全不動(dòng)。各組得分經(jīng)SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.4.2 前列腺蛋白滲出量的評(píng)價(jià)

伊文思藍(lán)染色的前列腺組織稱重后置于3 mL甲酰胺中，室溫靜置72 h后提取組織中伊文思藍(lán)，取出前列腺組織，溶液于4℃、12 000 r·min-1的條件下離心20 min在UVmini-1240紫外可見分光光度計(jì)上于620 nm處測(cè)定吸光度，染料含量以μg·g-1（濕重）表示。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：精密稱定伊文思藍(lán)粉末10 mg置于 1 000 mL容量瓶中，甲酰胺定容，配置濃度為0.01 mg·mL-1溶液。精密吸取1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL于10 mL容量瓶中，用甲酰胺定容，配置濃度為1、3、5、7、9 μg·mL-1。于620 nm處測(cè)定吸光度A值，制作伊文思藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.3 病理組織學(xué)評(píng)價(jià)

前列腺組織置于中性福爾馬林溶液中固定，將固定后的前列腺組織切成適宜大小后進(jìn)行梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片后進(jìn)行HE染色，最終樹脂封片。光學(xué)顯微鏡下觀察前列腺組織形態(tài)學(xué)變化。

2.5 血液代謝組學(xué)研究

2.5.1 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集

血漿樣品預(yù)處理后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，取上清液供UPLC-Triple TOF-MS/MS分析。色譜條件Waters ACQUITY UPLCTMHSS T3色譜柱（2.1 mm ×100 mm，1.8 μm）；流速0.4 mL·min-1；柱溫45℃；流動(dòng)相0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脫條件：0-2.0 min，1%-65% A；2.0-8.0 min，65%-90%A；8.0-9.0 min，90%-99% A；樣品室溫度4℃；進(jìn)樣量6 μL。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI），正、負(fù)離子（ESI+、ESI-）兩種模式采集數(shù)據(jù)。正離子模式質(zhì)譜條件：離子源氣簾氣流速（CUR）：30 L·min-1；離子源霧化氣流速（GS1）：55 L·min-1；離子源脫溶劑氣流速（GS2）：55 L·min-1；離子源電壓（ISVF）：5 500 V；解簇電（DP）：100.0 V；碰撞能（CE）：10.0 V；離子源溫度（TEM）：600℃。負(fù)離子模式質(zhì)譜條件：離子源氣簾氣流速（CUR）：30 L·min-1；離子源霧化氣流速（GS1）：55 L·min-1；離子源脫溶劑氣流速（GS2）：55 L·min-1；離子源電壓（ISVF）：-4 000 V；解簇電（DP）：-100.0 V；碰撞能（CE）：-10.0 V；離子源溫度（TEM）：600℃。質(zhì)量掃描范圍m/z：50-1 000。

2.5.2 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理

利用Progensis QI對(duì)所獲得血液數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析，進(jìn)一步將所得預(yù)處理數(shù)據(jù)導(dǎo)入Marker Lynx軟件，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（Principal Components Analysis，PCA），觀察造模后大鼠體內(nèi)代謝輪廓所發(fā)生的改變。進(jìn)一步對(duì)模型組與空白組血液代謝輪廓進(jìn)行正交偏最小二乘分析（Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis，OPLSDA），獲得能夠反映組間貢獻(xiàn)率的VIP-plot和S-plot圖。對(duì)所獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，選擇P＜0.05且VIP值大于1的內(nèi)源性標(biāo)記物作為CNP潛在生物標(biāo)記物。通過HMDB、KEGG、MetPA等數(shù)據(jù)庫對(duì)潛在生物標(biāo)記物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析及代謝通路拓?fù)浞治?，最終確定與CNP密切相關(guān)的潛在生物標(biāo)記物與相關(guān)代謝通路。

圖1 鹽酸小檗堿對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 統(tǒng)計(jì)方法

使用SPSS V19.0數(shù)據(jù)軟件包對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,即±s表示。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 總生物堿含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

3 結(jié)果

3.1 關(guān)黃柏生物堿富集物含量測(cè)定

采用酸性染料比色法測(cè)定關(guān)黃柏提取物中關(guān)黃柏生物堿的含量，經(jīng)方法學(xué)考察可知回歸方程為Y=5.757 1X-0.036 6，R2=0.999，加樣回收率為102.3%及RSD=1.6%，重復(fù)性RSD=1.3%，12 h內(nèi)穩(wěn)定性好，為關(guān)黃柏提取物中生物堿的質(zhì)量控制提供了一個(gè)可行的方法，詳見圖1、表1。關(guān)黃柏總生物堿含量測(cè)定結(jié)果顯示關(guān)黃柏提取物總生物堿含量為12.34%、關(guān)黃柏生物堿富集物總生物堿含量為66.32%，詳見表2。

3.2 慢性非細(xì)菌性前列腺炎模型的評(píng)價(jià)

3.2.1 行為學(xué)研究

行為學(xué)研究結(jié)果顯示，模型組大鼠注射辣椒素后，出現(xiàn)疲倦、閉眼、縮尾等由于疼痛而引起的行為學(xué)表現(xiàn)，導(dǎo)致模型組大鼠眼動(dòng)得分與活動(dòng)得分明顯低于空白組（P＜0.01），詳見表3、圖2。實(shí)驗(yàn)過程中，所有大鼠均可自由活動(dòng)，未見死亡。

3.2.2 前列腺蛋白滲出量研究

伊文思藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=0.075X+0.017，R2=0.998（圖3A），線性關(guān)系良好，為各組前列腺蛋白滲出量測(cè)定提供了一個(gè)可行的含量測(cè)定方法。結(jié)果顯示模型組前列腺蛋白滲出量明顯高于空白組（P＜0.01），詳見表4、圖3B，表明模型組大鼠前列腺組織中神經(jīng)源性血漿外滲增加，前列腺出現(xiàn)損傷。

3.2.3 組織病理學(xué)研究

組織病理學(xué)結(jié)果顯示：空白組前列腺腺泡分布均勻，炎性細(xì)胞零星散在，間質(zhì)不擴(kuò)張水腫；模型組前列腺腺泡大小不一、間質(zhì)水腫、結(jié)締組織明顯增生、血管擴(kuò)張充血、主要表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等炎性細(xì)胞侵潤(rùn)為主的慢性炎癥。研究結(jié)果表明，慢性非細(xì)菌性前列腺炎大鼠模型復(fù)制成功，詳見圖4A、圖4B。

3.3 關(guān)黃柏生物堿對(duì)慢性非細(xì)菌性前列腺炎模型大鼠的干預(yù)作用研究

3.3.1 行為學(xué)研究

行為學(xué)研究結(jié)果可以看出（見表3、圖2），模型組眼動(dòng)得分與活動(dòng)得分明顯低于空白組（P＜0.01），給予關(guān)黃柏生物堿后可明顯增加大鼠眼動(dòng)和活動(dòng)次數(shù)，給藥組眼動(dòng)得分與活動(dòng)得分顯著高于模型組（P＜0.01）。結(jié)果表明，關(guān)黃柏生物堿給藥可以有效抑制慢性前列腺炎模型的發(fā)生與發(fā)展。

3.3.2 前列腺蛋白滲出量研究

按照本文3.2.2項(xiàng)建立的伊文思藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)空白組、模型組、關(guān)黃柏生物堿給藥組前列腺蛋白滲出量進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果顯示模型組前列腺蛋白滲出量明顯高于空白組（P＜0.01），關(guān)黃柏生物堿可顯著減少前列腺蛋白滲出量，關(guān)黃柏生物堿給藥組與模型組比較有極顯著性差異（P＜0.01），詳見表4。

3.3.3 組織病理學(xué)研究

組織病理學(xué)結(jié)果顯示：關(guān)黃柏生物堿給藥組前列腺腺泡大小基本一致，血管無充血，炎癥細(xì)胞散在分布，淋巴細(xì)胞少見，詳見圖4C。

表3 各組大鼠在造模后的行為學(xué)比較結(jié)果表（n=10）

表4 前列腺血漿蛋白滲出量比較結(jié)果

圖2 各組大鼠在造模后的行為學(xué)比較結(jié)果圖

圖3 前列腺蛋白滲出量研究結(jié)果

圖4 各實(shí)驗(yàn)組病理組織HE染色結(jié)果

3.3.4 血液代謝組學(xué)研究

PCA得分圖可見空白組與模型組體內(nèi)代謝輪廓明顯分離，結(jié)果提示，模型組大鼠體內(nèi)代謝輪廓發(fā)生明顯擾動(dòng)間接預(yù)示著CNP的發(fā)生與發(fā)展，詳見圖5A、圖5B。進(jìn)一步對(duì)兩組大鼠血液代謝輪廓數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA分析，得到能夠反映組間貢獻(xiàn)率的S-plot和VIP-plot圖，對(duì)所獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，篩選P＜0.05且VIP值大于1的潛在內(nèi)源性生物標(biāo)記物，詳見圖5C、圖5D。通過參照文獻(xiàn)及HMDB和Metlin等數(shù)據(jù)檢索平臺(tái)對(duì)潛在內(nèi)源性標(biāo)記物MS/MS數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，共鑒定18個(gè)潛在內(nèi)源性生物標(biāo)記物，主要涉及14個(gè)代謝通路，詳見表5、圖6。

通過對(duì)實(shí)驗(yàn)第9天空白組、模型組、關(guān)黃柏高劑量給藥組大鼠血液代謝輪廓進(jìn)行PCA分析，結(jié)果顯示，關(guān)黃柏高劑量給藥組大鼠血液代謝輪廓明顯遠(yuǎn)離模型組且靠近空白組。結(jié)果表明關(guān)黃柏生物堿可明顯回調(diào)CNP模型大鼠體內(nèi)代謝輪廓至健康狀態(tài)，進(jìn)一步預(yù)示關(guān)黃柏生物堿對(duì)CNP的發(fā)生與發(fā)展起到干預(yù)作用，詳見圖7A、圖7B。以造模成功后的所獲得的18個(gè)生物標(biāo)記物為標(biāo)準(zhǔn)，分析口服關(guān)黃柏生物堿后大鼠體內(nèi)生物標(biāo)記物的含量變化趨勢(shì)。結(jié)果表明關(guān)黃柏生物堿可回調(diào)12個(gè)生物標(biāo)記物（圖7-C），主要調(diào)節(jié)10個(gè)代謝通路，包括甘油磷脂代謝、苯丙氨酸代謝、氨酰-tRNA生物合成、花生四烯酸代謝、酪氨酸代謝、亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝、脂肪酸代謝、嘌呤代謝、類固醇激素的合成。

表5 CNP模型生物標(biāo)記物結(jié)構(gòu)鑒定信息表

圖5 模型組與空白組模式識(shí)別分析圖譜

圖6 MetPA代謝路徑分析

4 討論

圖7 模型組、空白組、關(guān)黃柏生物堿給藥組模式識(shí)別分析圖譜

慢性非細(xì)菌性前列腺炎（CNP）是男性泌尿系統(tǒng)常見疾病之一，具有發(fā)病率高、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜等特點(diǎn)。本研究基于辣椒素致CNP大鼠模型，通過運(yùn)用行為學(xué)、組織病理學(xué)和代謝組學(xué)等研究方法，對(duì)辣椒素致CNP大鼠模型進(jìn)行模型評(píng)價(jià)研究并揭示關(guān)黃柏生物堿對(duì)慢性CNP的干預(yù)作用。結(jié)果表明大鼠前列組腺注射辣椒素的方法復(fù)制CNP大鼠模型成功。行為學(xué)結(jié)果顯示關(guān)黃柏生物堿可顯著回調(diào)CNP模型大鼠的眼動(dòng)和活動(dòng)評(píng)分同時(shí)減少前列腺蛋白滲出量。組織病理學(xué)結(jié)果顯示給藥組前列腺腺泡大小基本一致，血管無充血，炎癥細(xì)胞散在分布，淋巴細(xì)胞少見。結(jié)果表明關(guān)黃柏生物堿對(duì)CNP的發(fā)生和發(fā)展起到明顯的干預(yù)作用。

利用血液代謝組學(xué)研究方法對(duì)口服給予關(guān)黃柏生物堿后CNP模型大鼠血液代謝輪廓進(jìn)行分析，初步表征18個(gè)與CNP密切相關(guān)的潛在生物標(biāo)記物，主要涉及14個(gè)代謝通路。文獻(xiàn)報(bào)道花生四烯酸代謝與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，其在炎癥的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[23]。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠血液中二十四碳六烯酸、11,12-環(huán)氧二十碳三烯酸體內(nèi)表達(dá)水平異常，預(yù)示著大鼠體內(nèi)大量花生四烯酸解離，致使非?；ㄉ南┧岷推渌惢ㄉ岷吭黾樱M(jìn)而促使炎癥的產(chǎn)生。氨基酸是蛋白質(zhì)的組成單位，同時(shí)也是嘌呤、嘧啶等激素生物合成的前體物質(zhì)，纈氨酸在模型組中含量降低，推測(cè)其可能由于CNP模型大鼠體內(nèi)氨基酸代謝發(fā)生紊亂進(jìn)而導(dǎo)致支鏈氨基酸水平下降[24]。研究顯示生物體內(nèi)甘油磷脂代謝的異常預(yù)示著機(jī)體內(nèi)炎性微環(huán)境的產(chǎn)生，模型組酪氨酸、苯乙酰胺、溶血磷脂酰膽堿、肉毒堿在大鼠血中表達(dá)水平異常，預(yù)示著體內(nèi)炎癥因子釋放導(dǎo)致基質(zhì)膜損傷，干預(yù)了體內(nèi)膜磷脂膽堿代謝，影響細(xì)胞膜完整性。血清中的尿酸由黃嘌呤和次黃嘌呤在黃嘌呤氧化還原酶的作用下氧化產(chǎn)生，其具有抗氧化能力，可以阻止炎性環(huán)境的發(fā)展進(jìn)程[25-27]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M尿酸體內(nèi)表達(dá)水平異常，表明機(jī)體內(nèi)自由基活性增強(qiáng)，致使組織細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷。通過對(duì)口服給予關(guān)黃柏生物堿后大鼠體內(nèi)代謝輪廓進(jìn)行分析，結(jié)果表明在18個(gè)CNP潛在生物標(biāo)記物中，關(guān)黃柏生物堿能不同程度調(diào)節(jié)12種異常代謝物的水平向正常狀態(tài)逆轉(zhuǎn)，使其內(nèi)源性代謝物的水平得到改善。主要涉及甘油磷脂代謝、苯丙氨酸代謝、花生四烯酸代謝、酪氨酸代謝、嘌呤代謝等代謝通路。

綜上所述，通過對(duì)關(guān)黃柏生物堿干預(yù)CNP進(jìn)行系統(tǒng)的藥理學(xué)研究，結(jié)果表明關(guān)黃柏生物堿可以有效地干預(yù)CNP的發(fā)生與發(fā)展。首次確定了關(guān)黃柏生物堿干預(yù)CNP的生物標(biāo)記物，明確了其作用機(jī)制，為發(fā)現(xiàn)臨床有效且毒副作用小的抗CNP藥物提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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A Metabolomic Study on the Intervention Effect of Phellodenron Amurense Rupr. Alkaloid Protects Against Chronic Nonbacterial Prostatitis In Rats

Sun Hui, Li Xianna, Zhang Ying, Li Ruifang, Yue Shuqi, Aihua Zhang, Wang Xijun
(Sino-US Chinmedomics Technology Cooperation Center, National TCM Key Laboratory of Serum Pharmacochemistry, Research Center of Chinmedomics-State Administration of TCM-Laboratory of Metabolomics, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

This study aimed to analyze the effecacy of Phellodendron amurense Rupr. (GHB) alkaloid on chronic nonbacterial prostatitis (CNP) in rats. Metabolomic experiments, including behavioral test and tissue pathological approaches were performed to interpret the effectiveness and action of GHB alkaloid against CNP. Through separated and purified GHB alkaloid, a higher concentration of total alkaloid was obtained in this study. CNP model rats were established by means of intraprostatic injection of capsaicin. UPLC-Triple TOF-MS/MS technique was utilized for the establishment of blood metabolomics method of rats, the identification of CNP potential biomarkers and relative pathways. And then the mechanism behind the action of GHB alkaloid against CNP was explained. As a result, 14 potential biomarkers and 14 pathways which were closely related to CNP in aggregate were found out. GHB alkaloid improved the activity scores and the prostate protein exudation of CNP model rats. As the complicated regulation of arachidonic acid metabolism, glycerophospholipid metabolism, purine metabolism and any other pathways, alkaloid succesfully mediated 12 CNP potential biomarkers to the normal levels. In conclusion, it was the first experiment to evaluate the effect and clarify the mechanism behindmetabolic pathway of Phellodendron amurense Rupr. alkaloid against CNP, which was proved by the fact that Phellodendron amurense Rupr. alkaloid effectively prevented the development of CNP with the provision of scientific experimental data for anti-CNP drug studies.

Phellodendron amurense Rupr., alkaloid, metabolomics, chronic nonbacterial prostatitis

10.11842/wst.2016.10.010

R285

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-09-02

修回日期：2016-10-11

＊ 國(guó)家自然科學(xué)基金委重點(diǎn)項(xiàng)目（81430093）：中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的系統(tǒng)分析方法學(xué)——中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究，負(fù)責(zé)人：王喜軍；科學(xué)技術(shù)部“重大新藥創(chuàng)制”國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2015ZX09101043-011）：中藥經(jīng)典名方整合作用機(jī)制關(guān)鍵技術(shù)研究，負(fù)責(zé)人：王喜軍；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81173500）：基于知柏地黃丸配伍環(huán)境的關(guān)黃柏治療腎陰虛相火亢盛的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，負(fù)責(zé)人：孫暉。

＊＊ 通訊作者：王喜軍，本刊編委，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥血清藥物化學(xué)及中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究。