基于代謝調(diào)控通路的京尼平苷干預(yù)陽黃證的作用靶標(biāo)研究＊

方 衡，張愛華，周小航，于靜波，王 亮，劉 暢，宋 琦，王喜軍

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥血清藥物化學(xué)重點研究室/中美中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)合作中心 哈爾濱 150040）

基于代謝調(diào)控通路的京尼平苷干預(yù)陽黃證的作用靶標(biāo)研究＊

方 衡，張愛華，周小航，于靜波，王 亮，劉 暢，宋 琦，王喜軍＊＊

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥血清藥物化學(xué)重點研究室/中美中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)合作中心 哈爾濱 150040）

目的：基于代謝調(diào)控通路技術(shù)對京尼平苷干預(yù)陽黃證小鼠進行研究，探究陽黃證的發(fā)病機制及京尼平苷對其干預(yù)作用的潛在效應(yīng)靶標(biāo)。方法：采用化學(xué)物質(zhì)、中藥及病理性肝損傷因素建立陽黃證動物模型，通過與臨床陽黃證患者尿液的生物標(biāo)記物相關(guān)聯(lián)，成功建立陽黃證動物模型。在此基礎(chǔ)上對生化指標(biāo)、病理觀察進行檢測，基于代謝組學(xué)技術(shù)挖掘京尼平苷干預(yù)陽黃證的作用靶標(biāo)。結(jié)果：與空白組相比，模型組小鼠谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、總膽汁酸含量升高，具有顯著性差異（P＜0.05）。堿性磷酸酶、直接膽紅素、丙二醛、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶含量升高，谷胱甘肽過氧化酶、超氧化物歧化酶含量降低；病理結(jié)果顯示，模型組小鼠肝組織成片狀壞死，肝細(xì)胞有水腫現(xiàn)象。對模型組小鼠尿液進行基于代謝調(diào)控的靶點分析，發(fā)現(xiàn)33個尿液生物標(biāo)記物與陽黃證的發(fā)生密切相關(guān)。其中，10個生物標(biāo)記物與臨床陽黃證患者生物標(biāo)記物變化一致，主要涉及酪氨酸代謝、?；撬岷蛠喤；撬岽x、谷胱甘肽代謝、戊糖和葡萄糖醛酸酯代謝、初級膽汁酸代謝等。進一步通過Ingenuity Pathway Analysis組學(xué)數(shù)據(jù)分析平臺成功預(yù)測京尼平苷干預(yù)陽黃證的5個作用靶點，即干擾素調(diào)節(jié)因子3、鳥氨酸脫羧酶抗酶1（OAZ1）、鳥氨酸脫羧酶1（ODC1）、解偶聯(lián)蛋白（UCP1）、Maf1調(diào)節(jié)劑（Maf1 regulator）。結(jié)論：本研究以中醫(yī)證候理論為指導(dǎo)，在對陽黃證形成本質(zhì)考察的基礎(chǔ)上，以中藥與肝損傷化學(xué)誘導(dǎo)劑結(jié)合的方法建立陽黃證動物模型，與臨床黃疸生物標(biāo)記物相關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)10個生物標(biāo)記物與陽黃證發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，京尼平苷可有效回調(diào)生物標(biāo)記物，通過代謝調(diào)控通路技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)京尼平苷干預(yù)陽黃證的5個潛在作用靶標(biāo)。本研究為陽黃證相關(guān)動物模型建立及中藥有效成分治療作用機制研究提供方法和依據(jù)。

代謝組學(xué) 京尼平苷 陽黃證 生物標(biāo)記物 作用靶點

代謝組學(xué)是一門新興的組學(xué)技術(shù)，采用高通量的檢測技術(shù)對生物系統(tǒng)內(nèi)所有小分子代謝產(chǎn)物進行非靶向性的全面分析，通過模式識別、專家系統(tǒng)、數(shù)據(jù)庫檢索等手段篩選并鑒定與疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的生物標(biāo)記物。這些具有代表性的小分子代謝產(chǎn)物可以用于臨床疾病的診斷，且生物標(biāo)記物涉及到的代謝通路可能為闡明發(fā)病機制及藥物作用靶點提供有力依據(jù)。此外，代謝組學(xué)與中醫(yī)藥的整體觀理論具有高度一致性，被廣泛應(yīng)用于闡明癥候的發(fā)病機制和方劑的藥效研究。

陽黃屬濕熱黃疸，黃疸首見于《內(nèi)經(jīng)》，依據(jù)患者的精神和食欲狀態(tài)，將黃疸分為黃疸和胃疸，指出目黃、身黃、小便黃為黃疸病的三大主要臨床癥狀，為后世認(rèn)識黃疸奠定了基礎(chǔ)。東漢醫(yī)家張仲景所著《傷寒雜病論》和《金匱要略》對陽黃證有比較詳細(xì)的論述。如《傷寒論》236條：“陽明病，發(fā)熱汗出者，此為熱越，不能發(fā)黃也；但頭汗出，身無汗，劑頸而還，小便不利，渴飲水漿者，此為瘀熱在里，身必發(fā)黃，茵陳蒿湯主之”。元·羅天益《衛(wèi)生寶鑒·發(fā)黃》中指出：“中陽偏盛，濕從熱化，濕熱為患，則為陽黃；中陽不足，濕從寒化，寒濕為患，則為陰黃”。進一步明確了陽黃與陰黃的病機，即陽黃證病機為濕熱阻滯。

現(xiàn)代研究表明，肝病患者多伴有黃疸[1-7]，闡明陽黃證的發(fā)病機制及相關(guān)藥物的作用機制將有助于指導(dǎo)臨床肝病診治的癥候理論研究和合理用藥。本課題組前期收集500例陽黃證患者尿液，并對其進行基于高通量技術(shù)的代謝組學(xué)分析，獲取44個尿液潛在生物標(biāo)記物，為陽黃證的臨床診斷及發(fā)病機制研究提供重要依據(jù)。

梔子為茜草科植物梔子的干燥成熟果實，2015版《中國藥典》收錄梔子具有清熱利濕，涼血解毒的功效，主治濕熱黃疸等疾病。京尼平苷為梔子的主要成分，近年來藥理研究表明，京尼平苷具有良好的保肝利膽功效[8-11]。本研究采用基于代謝調(diào)控通路技術(shù)對京尼平苷干預(yù)陽黃證小鼠的作用靶標(biāo)進行研究，為京尼平苷治療黃疸類疾病提供可靠依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 儀器

AcquityTM UPLC液相色譜儀（美國Waters公司）；SynaptTM G2Si-HDMS質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；MassLynx V4.1工作站（美國Waters公司）；Progenisis QI 1.0（美國Waters公司）；VX-Ⅱ多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技公司）；KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Basic/70VB0370半自動生化分析儀（法國Secomam公司）；紫外分光光度計（日本Shimadzu制作所）電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KDC-160HR型高速冷凍離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；SK-1型快速混勻器（江蘇金壇醫(yī)療器械廠）。

1.2 藥品和試劑

ALP試劑盒、ALT試劑盒、AST試劑盒、T-Bili試劑盒、D-Bili試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號分別是YZB/京0691-2010、YZB/京0694-2010、YZB/京0693-2010、YZB/京0096-2013、YZB/京0121-2013），KMAS試劑盒、T-SOD試劑盒、GSH-Px試劑盒、MDA試劑盒、γ-GT試劑盒、TBA試劑盒（南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號分別是20160719、20160721、20160715、20160723、20160726、20160725），α-萘異硫氰酸酯（上海晶純生化科技股份有限公司，批號：N106359），橄欖油（中糧食品營銷股份有限公司），干姜（同仁堂藥店哈爾濱分店），京尼平苷（中國生物制品檢定所，純度大于95%，批號：110749-200511）。蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料公司），冰醋酸（天津天力化學(xué)試劑公司），乙腈（色譜級，德國Merck公司），甲醇（色譜級，德國Merck公司），甲酸（色譜級，科密歐化學(xué)試劑公司），乙醇（北京化工廠），生理鹽水（實驗室自制），其他試劑均為分析級。

1.3 給藥樣品制備

1.3.1 制備干姜灌胃液

稱取干姜生藥材50.8 g，加入10倍量（即500 mL）蒸餾水浸泡1 h，大火煎煮至沸騰，小火煎煮1 h，紗布濾過，濾液置于燒杯中；再加入10倍量蒸餾水，重復(fù)以上過程兩次，合并3次濾液，濃縮至500 mL，-80℃冰箱凍存。每天融化15.6 mL濃縮液，加入104.4 mL蒸餾水稀釋，制成濃度為0.013 g·mL-1的干姜灌胃溶液；小鼠按體重以10 mL·kg-1比例灌胃。

1.3.2 制備乙醇灌胃液

量取3.125 mL無水乙醇，加入96.875 mL純凈水，混勻，配制成3.125%（v/v）乙醇溶液；小鼠按體重以10 mL·kg-1比例灌胃。

1.3.3 制備ANIT橄欖油溶液

分別稱取37.5、25 mg的ANIT粉末溶于25 mL橄欖油中，制成濃度為1.5、1 mg·mL-1的ANIT橄欖油灌胃液；小鼠按體重以10 mL·kg-1比例灌胃。

1.3.4 制備京尼平苷灌胃液

分別取京尼平苷標(biāo)準(zhǔn)品粉末336、168、84 mg，精密稱定，分別以28 mL的0.3%CMC溶液混懸，后溶于5.6 mL蒸餾水中，作為京尼平苷高（10 mg·mL-1）、中（5 mg·mL-1）、低劑量（2.5 mg·mL-1），小鼠分別以生藥量100、50、25 mg·kg-1作為高、中、低劑量進行灌胃。

2 實驗動物分組及給藥

清潔級雄性Babl/c小鼠，體重20±2 g，遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（遼）2015-0001。飼養(yǎng)溫度24±2℃，濕度65%-75%，12 h蔽光，12 h光照，自由攝食飲水。按體重完全隨機分成7組，即空白1組（Control 1）、空白2組（Control 2）、模型1組（M 1）、模型2組（M 2）、高劑量京尼平苷組（GH）、中劑量京尼平苷組（GM）、低劑量京尼平苷組（GL）。實驗前于代謝籠適應(yīng)飼養(yǎng)一周，空白1組和2組灌胃給予生理鹽水和橄欖油。模型1組和2組及給藥組給予0.13 g·kg-1的干姜溶液和0.25 g·kg-1的乙醇溶液，連續(xù)14天，第15天灌胃給予15 mg·kg-1的ANIT橄欖油溶液，第16天上午灌胃給予10 mg·kg-1的ANIT橄欖油溶液，實驗第16天下午開始各給藥組連續(xù)7天灌胃給予京尼平苷低中高藥物。

2.1 樣品采集

每天每組每只小鼠收集尿樣，凍存于-80℃冰箱。實驗第17天早空白1組和模型1組小鼠摘眼球采集血樣；實驗第23天早空白2組、模型2組及各給藥組小鼠摘眼球采集血樣，離心（4℃，3 000 r·min-1，10min）分離血清，凍存于-80℃冰箱；同時取肝臟稱重，保存在10%福爾馬林溶液和-80℃冰箱中備用。

2.2 臨床化學(xué)及組織病理學(xué)檢測

按試劑盒說明操作檢測血清堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine Transaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate Aminotransferase，AST）、直接膽紅素（Direct Bilirubin，D-Bili）、總膽紅素（Total Bilirubin，T-Bili）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（Gamma-Glutamyl Transpeptidase，γ-GT）、總膽汁酸（Total Bile Acid，TBA）和組織谷胱甘肽過氧化酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（Malonyl Dialdehyde，MDA）、總超氧化物歧化酶（Total Superoxide Dismutase，T-SOD）。小鼠采血后，立即摘取肝臟，蒸餾水洗凈殘血，10%福爾馬林溶液固定24 h后，乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，切片，展平，脫蠟，HE染色，脫水，封片，供組織病理學(xué)觀察使用。

2.3 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集

樣品分析前室溫解凍，取小鼠原濃度尿液與蒸餾水1∶4（v/v）混溶，渦旋10 s，離心（4℃，13 000 r·min-1，10 min），取上清液供UPLC分析。色譜柱：ACQUITY UPLCTM HSS T3（100 mm×2.1 mm i.d.，1.8 μm）（美國Waters公司）；流動相A：0.1%甲酸乙腈溶液，流動相B：0.1%甲酸水溶液；柱溫；40℃；進樣量：2 μL；梯度洗脫程序見表1。質(zhì)譜條件：正離子掃描模式下毛細(xì)管電壓3 000 V；錐孔電壓30 V；離子源溫度：110℃；提取錐孔電壓5.0 V；脫溶劑氣溫度350℃；錐孔氣流量50 L·h-1；脫溶劑氣流量800 L·h-1。準(zhǔn)確質(zhì)量測定采用亮氨酸-腦啡肽（[M+H]+=556.277 1）溶劑為鎖定質(zhì)量溶液。質(zhì)量掃描范圍：m/z 50 - 1 200。負(fù)離子掃描模式下毛細(xì)管電壓2 500 V；錐孔電壓30 V；離子源溫度：110℃；提取錐孔電壓5.0 V；脫溶劑氣溫度350℃；錐孔氣流量50 L·h-1；脫溶劑氣流量800 L·h-1。準(zhǔn)確質(zhì)量測定采用亮氨酸-腦啡肽（[M-H]-=554.261 5）溶劑為鎖定質(zhì)量溶液。質(zhì)量掃描范圍：m/z 50 - 1 200。

2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007對空白1組和模型1組的所有數(shù)據(jù)進行獨立樣本t檢驗，以組間P＜0.05表示具有顯著性差異，P＜0.01表示具有極顯著性差異，數(shù)據(jù)以（± s）表示。

2.5 陽黃證小鼠尿液代謝輪廓及生物標(biāo)記物分析

為了更全面地研究在陽黃證小鼠代謝輪廓中起關(guān)鍵性作用的內(nèi)源性物質(zhì)，揭示代謝圖譜的特征變化，進而深入挖掘和闡明陽黃證小鼠的代謝機制，本研究在對不同組小鼠尿液正負(fù)離子掃描分析的基礎(chǔ)上，一方面應(yīng)用ProgenesisTM QI數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對空白1組、模型1組尿液的代謝輪廓數(shù)據(jù)進行非監(jiān)督

表1 尿液樣品UPLC流動相梯度洗脫方法

圖1 空白1組、模型1組、空白2組、模型2組和京尼平苷給藥組小鼠組織病理學(xué)結(jié)果（×100）

3.3 代謝組學(xué)研究

對比正負(fù)離子模式下采集的空白1組及模型1組小鼠尿液數(shù)據(jù)可知，兩組小鼠尿液成分具有巨大差異，將造模第16天小鼠尿液代謝輪廓數(shù)據(jù)導(dǎo)入Progenesis QI軟件進行數(shù)據(jù)預(yù)處理過程，進一步利用EZinfo軟件對空白組和模型組進行主成分分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：模型組小鼠尿液與空白組顯著分離，且組內(nèi)聚集良好，提示模型組小鼠體內(nèi)代謝已經(jīng)發(fā)生巨大變化。進一步通過有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析，獲取到具有統(tǒng)計學(xué)差異的小分子代謝產(chǎn)物（圖2）。鎖定符合上述標(biāo)準(zhǔn)的潛在生物標(biāo)記物，以G2Si-HDMS/MS模式精確采集相應(yīng)離子的二級裂解信息，根據(jù)HMDB及KEGG等數(shù)據(jù)庫對已獲得的母離子及碎片離子信息最終確定標(biāo)記物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。進一步通過MetaboAnalyst 3.0通路富集分析、HMDB、KEGG等相關(guān)代謝數(shù)據(jù)庫檢索共發(fā)掘33個代謝物，涉及22個代謝通路，包括酪氨酸代謝、?；撬岷蛠喤；撬岽x、泛醌等萜醌的生物合成、谷胱甘肽代謝、苯基丙氨酸代謝、酪氨酸代謝、色氨酸代謝、硫胺素代謝、維生素C代謝、葉酸碳庫代謝、維生素B6代謝、苯基丙氨酸代謝、泛酸和輔酶A的生物合成、葉酸代謝、戊糖和葡萄糖醛酸酯代謝、β-丙氨酸代謝、乙醛酸鹽代謝、淀粉和蔗糖代謝、氨酰tRNA生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、色氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、初級膽汁酸代謝（圖3、圖4）。這33個小分子代謝產(chǎn)物中有10個與臨床黃疸證患者的生物標(biāo)記物分子結(jié)構(gòu)相同[12]，分別為腎上腺素（Epinephrine）、葡萄糖酸（Gluconic acid）、5-甲氧基色氨酸（5-Methoxytryptophan）、L-r-谷氨酰-L-亮氨酸（L-gamma-glutamyl-L-leucine）、L-b-天冬氨酰-L-苯丙氨酸（L-beta-aspartyl-L-phenylalanine）、5,6-二氫尿苷（5,6-Dihydrouridine）、N-甲酰-L蛋氨酸（N-Formyl-L-methionine）、犬尿喹啉酸（Kynurenic acid）、3b,16α-二羥基雄甾烯酮硫酸鹽（3b,16α-Dihydroxyandrostenone sulfate）、Vanillactic acid。而且，這些標(biāo)記物存在于黃疸證的關(guān)鍵代謝通路，如酪氨酸代謝、戊糖-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換、半胱氨酸和蛋氨酸代謝等，由此證明本次建立的陽黃證動物模型與臨床陽黃證具有高度的一致性。

圖2 空白組與模型組的高通量代謝輪廓及模式識別分析

3.4 利用Ingenuity Pathway Analysis技術(shù)預(yù)測京尼平苷的作用靶點

Ingenuity Pathway Analysis（IPA）是一體化的在線整合分析軟件，其運算完全基于Ingenuity Knowledge Base收集的生命科學(xué)數(shù)據(jù)庫的大數(shù)據(jù)云計算，有助于理解在基因、蛋白質(zhì)、化學(xué)物質(zhì)和藥物等各種分子的屬性及其分子之間相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。本次實驗所得33個生物標(biāo)記物經(jīng)京尼平苷干預(yù)后均具有一定回調(diào)趨勢，將其屬性及相應(yīng)變量帶入IPA軟件中分析，可有效、直觀的獲取京尼平苷干預(yù)陽黃證的潛在作用靶點（圖5）。通過分析發(fā)現(xiàn)京尼平苷干預(yù)陽黃證小鼠的主要作用靶點主要為干擾素調(diào)節(jié)因子3（Interferon Regulatory Factor 3，IRF3）、鳥氨酸脫羧酶抗酶1（Ornithine decarboxylase enzymes 1，OAZ1）、鳥氨酸脫羧酶1（Ornithine Decarboxylase 1，ODC1）、解偶聯(lián)蛋白（Uncoupling Protein 1，UCP1）、Maf1調(diào)節(jié)劑（Maf1 Regulator）。

圖3 京尼平苷干預(yù)陽黃證模型小鼠代謝通路圖

圖4 空白2組、模型2組和京尼平苷給藥組小鼠尿液潛在生物標(biāo)記物變化

4 討論

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，通過核磁共振和色譜、質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)為主的分析技術(shù)獲得代謝圖譜數(shù)據(jù)，在此基礎(chǔ)上借助化學(xué)計量學(xué)工具和模式識別軟件轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的信息，用以考察生物體系受刺激或擾動前后小分子代謝產(chǎn)物的動態(tài)變化，研究生物體系代謝網(wǎng)絡(luò)，揭示疾病發(fā)生發(fā)展的動態(tài)過程及挖掘特異性生物標(biāo)志物或標(biāo)志群，為疾病診斷、治療、甚至藥物的設(shè)計提供指導(dǎo)[13-22]。

本研究中模型組小鼠尿液潛在生物標(biāo)記物主要涉及22個代謝網(wǎng)路，這些代謝網(wǎng)絡(luò)涉及到的代謝機制都與陽黃證的發(fā)病機制極其相關(guān)。本次陽黃證動物模型研究中共計發(fā)掘33個潛在尿液生物標(biāo)記物；與臨床陽黃證證患者的尿液生物標(biāo)記物比對發(fā)現(xiàn)，有10個小分子代謝產(chǎn)物完全一致，且這些標(biāo)記物處于黃疸的關(guān)鍵代謝通路，如酪氨酸代謝、戊糖、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換、半胱氨酸和蛋氨酸代謝等，由此證明本次建立的陽黃證動物模型與臨床陽黃證具有高度的一致性。

京尼平苷為中藥材梔子的有效成分，在消化道內(nèi)經(jīng)腸道內(nèi)β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21）作用下水解成京尼平[23]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有保肝利膽、降血糖、神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護和對大鼠慢性前列腺炎的治療作用等。GSH-Px是臨床檢測機體抗過氧化能力的常用指標(biāo)之一，具有抗氧化作用和解毒作用。Kuo W H[24]等發(fā)現(xiàn)京尼平苷可以提高大鼠肝細(xì)胞中GSH S轉(zhuǎn)移酶活性及GSH-Px活性，進而保護受損肝細(xì)胞。本研究結(jié)果表明，與空白2組相比，MH2組小鼠體內(nèi)GSH-Px活性降低，給予低中高不同劑量的京尼平苷后，小鼠體內(nèi)GSH-Px活性成上升趨勢，由氰基氨基酸代謝網(wǎng)絡(luò)可知，京尼平苷在腸道內(nèi)經(jīng)β-葡萄糖苷酶代謝生成京尼平，此過程可能由于腸道菌群為代謝京尼平苷而大量產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶，使其在腸道內(nèi)代謝其他物質(zhì)的也同步加速進行，最終代謝產(chǎn)生大量的甘氨酸，而甘氨酸是內(nèi)還原型谷胱甘肽合成所需物質(zhì)之一，大量的甘氨酸可以加速機體產(chǎn)生還原型谷胱甘肽，用于消除體內(nèi)由于過氧化而導(dǎo)致的炎性反應(yīng)，起到修復(fù)受損肝細(xì)胞的作用。

圖5 京尼平苷干預(yù)陽黃證小鼠的網(wǎng)絡(luò)靶點預(yù)測分析

本研究利用代謝組學(xué)技術(shù)研究京尼平苷對陽黃證小鼠的干預(yù)作用。在基于中醫(yī)證候理論認(rèn)識的基礎(chǔ)上，以中藥結(jié)合化學(xué)結(jié)合誘導(dǎo)膽汁淤積肝損傷的化學(xué)物質(zhì)作為造模因素建立陽黃證動物模型，經(jīng)高通量的數(shù)據(jù)采集及數(shù)據(jù)處理最終發(fā)現(xiàn)33個尿液生物標(biāo)記物，給予不同劑量京尼平苷后都能給予很好的回調(diào)，使生物標(biāo)記物的含量回歸接近空白組水平，

在陽黃證相關(guān)代謝網(wǎng)絡(luò)中，有效調(diào)節(jié)谷胱甘肽代謝等關(guān)鍵代謝通路?；谝陨蠑?shù)據(jù)，通過IPA組學(xué)分析系統(tǒng)對鑒定的標(biāo)記物進行靶點預(yù)測分析，結(jié)合代

表3 陽黃證小鼠尿液生物標(biāo)記物鑒定結(jié)果

1 Suthar, P P, Bumiya R G, Patel K, et al. Incidental diagnosis of liver tuberculosis in a patient with jaundice. Bmj Case Reports, 2015, pii: bcr2014206866.

2 Tang X, Yang C, Gu Y, et al. Structural basis for the neutralization and genotype specificity of hepatitis E virus. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011,108(25):10266-10271.

3 Friedman L S, Gee M S, Misdraji J. Case records of the MassachusettsGeneral Hospital. Case 39–2010. A 19-year-old woman with nausea, jaundice, and pruritus.N. Engl J Med, 2010,363(26):2548-2557.

4 Selmi C, Bowlus C L, Gershwin M E, et al. Primarybiliary cirrhosis. Lancet, 2011,377:1600-1609.

5 Tschopp, S, Brucker R. Aching joints and jaundice. Lancet, 2003,361(9359):750.

6 Arias I M. New genetics of inheritable jaundice and cholestatic liver disease. Lancet, 1998,352(9122):82-83.

7 Premawardhena A, Fisher C A, Fathiu F, et al. Genetic determinants of jaundice and gallstones in haemoglobin E beta thalassaemia. Lancet, 2001,357(9297):1945-1946.

8 Zhang A, Sun H, Yuan Y, et al. An in vivo analysis of the therapeutic and synergistic properties of Chinese medicinal formula Yin-Chen-Hao-Tang based on its active constituents. Fitoterapia, 2011,82(8):1160-1168.

9 Wang X, Sun H, Zhang A, et al. Pharmacokinetics screening formulticomponents absorbed in the rat plasma after oral administration traditional Chinese medicine formula Yin-Chen-Hao-Tang by ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization/ quadrupole-time-of-flight mass spectrometry combined with pattern recognition methods. Analyst, 2011,136(23):5068-5076.

10 Yang D, Yang J, Shi D, et al. Scoparone potentiates transactivation of the bile salt export pump gene and this effect is enhanced by cytochrome P450 metabolism but abolished by a PKC inhibitor. Br J Pharmacol, 2011,164(5):1547-1557.

11 Wang X, Zhang A, Yan G, et al. Metabolomics and Proteomics Annotate Therapeutic Properties of Geniposide: Targeting and Regulating Multiple Perturbed Pathways. Plos One, 2013, 8(8):800-802.

12 Wang X, Zhang A, Han Y, et al. Urine Metabolomics Analysis for Biomarker Discovery and Detection of Jaundice Syndrome in Patients With Liver Disease. Mol Cell Proteomics, 2012,11(8):370-380.謝物及上游靶標(biāo)的含量及生物學(xué)意義，解釋京尼平苷對陽黃證小鼠干預(yù)作用機制，為京尼平苷治療陽黃證提供可靠依據(jù)。

13 Wang X, Zhang A, Sun H. Power of metabolomics in diagnosis and biomarker discovery of hepatocellular carcinoma. Hepatology, 2013,57(5):2072-2077.

14 Patti GJ, Yanes O, Siuzdak G. Innovation:Metabolomics: the apogee of the omics trilogy. Nat Rev Mol Cell Biol, 2012,13(4):263-269.

15 Laursen L. Interdisciplinary research: Big science at the table. Nature, 2010, 468(7327): S2-S4.

16 Zenobi R. Single-Cell Metabolomics: Analytical and Biological Perspectives. Science, 2013, 342(6163): 1201-1210.

17 Sun H, Wang M, Zhang A, et al. UPLC-Q-TOF-HDMS analysis of constituents in the root of two kinds of Aconitum using a metabolomics approach. Phytochem Anal, 2013,24(3):263-276.

18 Dong H, Zhang A, Sun H, et al. Ingenuity pathways analysis of urine metabolomics phenotypes toxicity of Chuanwu in Wistar rats by UPLCQ-TOF-HDMS coupled with pattern recognition methods. Mol Biosyst, 2012, 8(4):1206-1221.

19 Wang X, Wang H, Zhang A, et al. Metabolomics study on the toxicity of aconite root and its processed products using ultra performance liquidchromatography/electrospray-ionization synapt high-definition mass spectrometry coupled with pattern recognition approach and ingenuity pathways analysis. J Proteome Res, 2012, 11(2):1284-1301.

20 Sun H, Ni B, Zhang A, et al. Metabolomics study on Fuzi and its processed products using ultra-performance liquid-chromatography/ electrospray-ionization synapt high-definition mass spectrometry coupled with pattern recognition analysis. Analyst, 2012,137(1):170-185.

21 Masaru Tomita, Kenjiro Kami. Systems Biology, Metabolomics, and Cancer Metabolism. Science, 2012,336(6084):990-991.

22 Pearce E L, Poffenberger M C, Chang C H, et al. Fueling Immunity: Insights into Metabolism and Lymphocyte Function. Science, 2013,342(6155):1242454.

23 Gong G, Zheng Z, Liu H, et al. Purification and characterization of a β-glucosidase from aspergillus niger and its application in the hydrolysis of geniposide to genipin. J Microbiol Biotechnol, 2014,24:788-794.

24 Kuo W H, Chou F P, Young S C, et al. Geniposide activates GSH S-transferase by the induction of GST M1 and GST M2 subunits involving the transcription and phosphorylation of MEK-1 signaling in rat hepatocytes. Toxicol Appl Pharmacol, 2005,208(2):155-162.

An Exploration in the Action Targets for the Avail of Geniposide Against Yang Huang Syndrome Based on the Regulation of Metabolic Pathways

Fang Heng, Zhang Aihua, Zhou Xiaohang, Yu Jingbo, Wang Liang, Liu Chang, Song Qi, Wang Xijun
(Research Center of Chinmedomics-State Administration of TCM-Laboratory of Metabolomics, National TCM Key Laboratory of Serum Pharmacochemistry, Sino-US Chinmedomics Technology Cooperation Center, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

The present study aimed at exploring the targets and the pathogenesis of the avail of geniposide against Yang Huang syndrome (YHS) using metabolic technologies. YHS mouse model was established by three methods, including chemicals, Chinese materia medica and pathologic hepatic injury. On this basis, the biomarkers of YHS, various biochemical indexes and pathology observation were adopted to evaluate the modeling of YHS. Compared with the control group, it was found that the contents of ALT, AST, T-Bili and TBA were successfully increased in the model group with significant statistical differences (P＜0.05). The levels of ALP, D-Bili, MDA and γ-GT were up-regulated, while the levels of GSH-Px and T-SOD were down-regulated. Besides, pathological observation indicated regional patchy necrosis and hepatic edema emerged in the model mice. Involving metabolic profiling analysis, a total of 33 urinary biomarkers were identified in the model mice, which all associated with YHS, and among which 10 biomarkers were identified that they shared the same structure with the biomarkers of YHS. These biomarkers were chiefly involved in tyrosine metabolism, taurine and hypotaurine metabolism and glutathione metabolism, pentose and glucuronate metabolism, and primary bile acid metabolism. With the global omics analysis of IPA software, we predicted 5 targets engaged in the avail of geniposide against YHS, including OAZ1, ODC1, UCP1 and Maf1 regulator. In conclusion, this study successfully established the YHS mouse model based on the guidance of traditional Chinese medical theory and the essential characteristics of YHS. 10 biomarkers shared the same structure with those of YHS, which played critical roles in the process of the metabolism of YHS. Strikingly, these biomarkers were recovered to the normal levels after the adminstration of geniposide. The aforesaid descriptions indicated that the establishment of the YHS model showed a high consistency with clinical YHS patients. Geniposide may perform favorable efficacy with the aforementioned biomarkers or pathways.

Metabolomics, geniposide, Yang Huang syndrome, biomarker, target

10.11842/wst.2016.10.009

R285.5

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-09-19

修回日期：2016-10-20

＊ 國家自然科學(xué)基金委重點項目（81430093）：中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的系統(tǒng)分析方法學(xué)——中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究，負(fù)責(zé)人：王喜軍；科學(xué)技術(shù)部“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2015ZX09101043-011）：中藥經(jīng)典名方整合作用機制關(guān)鍵技術(shù)研究，負(fù)責(zé)人：王喜軍。

＊＊ 通訊作者：王喜軍，本刊編委，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥血清藥物化學(xué)及中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究。