基于中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)的六味地黃丸干預(yù)腦癱大鼠模型研究＊

李秋菊，王 萍，王美佳，康舒宇，張 也，張愛華，王喜軍

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥血清藥物化學(xué)重點(diǎn)研究室/中美中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)合作中心 哈爾濱 150040）

基于中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)的六味地黃丸干預(yù)腦癱大鼠模型研究＊

李秋菊，王 萍，王美佳，康舒宇，張 也，張愛華，王喜軍＊＊

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥血清藥物化學(xué)重點(diǎn)研究室/中美中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)合作中心 哈爾濱 150040）

目的：本研究基于中醫(yī)方證代謝組學(xué)理論和技術(shù)平臺(tái)，研究六味地黃丸（LW）對(duì)腦癱大鼠模型的干預(yù)作用。方法：研究采用延遲剖宮產(chǎn)手術(shù)方法復(fù)制缺氧缺血腦癱（HICP）大鼠模型，利用經(jīng)典行為學(xué)方法對(duì)HICP模型和LW的干預(yù)作用進(jìn)行評(píng)價(jià)；最后借助中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)揭示了HICP模型大鼠尿液的潛在生物標(biāo)記物與LW干預(yù)HICP模型體內(nèi)顯效成分的相關(guān)性。結(jié)果：研究表明LW通過調(diào)節(jié)HICP模型大鼠機(jī)體的糖類代謝、氨基酸代謝、核苷酸代謝和甾體激素類生物合成四大類代謝途徑，進(jìn)而有效改善HICP模型大鼠的運(yùn)動(dòng)能力，并確定LW的入血成分中6-O-甲基梓醇、莫諾苷、丹皮酚原苷、毛蕊花苷、獐牙菜苷脫水的代謝產(chǎn)物為干預(yù)HICP大鼠模型的潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。本證實(shí)了中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)可以成為闡明中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的有力手段。

中醫(yī)方證代謝組學(xué) 缺氧缺血腦癱 六味地黃丸 藥效物質(zhì)基礎(chǔ) 代謝物 中醫(yī)藥 中藥血清藥物化學(xué) 代謝組學(xué)

2012年，本團(tuán)隊(duì)將中藥血清藥物化學(xué)與代謝組學(xué)有機(jī)整合，提出并建立中醫(yī)方證代謝組學(xué)（Chinmedomics）研究策略[1]，為全面揭示中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了新的思路與方法[2,3]。滋陰補(bǔ)腎的經(jīng)典名方六味地黃丸（Liu Wei Di Huang Wan，LW），于《小兒藥證直訣》中首創(chuàng)，最初是用于治療小兒的“五遲、五軟”證[4]。小兒因先天腎精虧虛導(dǎo)致的發(fā)育遲緩癥被稱為“五遲、五軟”證,表現(xiàn)為立遲、行遲、語遲、齒遲、發(fā)遲以及手軟、足軟、肌肉軟、口軟、頭項(xiàng)軟[5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，小兒腦癱歸屬于“五遲、五軟”證的范疇[6]。然而目前LW對(duì)“五遲、五軟”證起到干預(yù)作用的化學(xué)成分以及這些成分對(duì)機(jī)體代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)作用仍尚不清楚，所以本研究以LW治療小兒“五遲、五軟”證的經(jīng)典療效為切入點(diǎn)，在缺氧缺血腦癱（Hypoxic-Ischemic Cerebral Palsy，HICP）大鼠模型的基礎(chǔ)上，進(jìn)行LW的中醫(yī)方證代謝組研究。

1 材料

1.1 儀器

電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；美國Waters AcquityTMUPLC液相色譜儀（四元梯度泵-在線真空脫氣機(jī)-自動(dòng)進(jìn)樣器-二極管陣列檢測(cè)器-柱溫箱）；美國Waters SynaptTMHDMS 質(zhì)譜分析系統(tǒng)；MassLynx V4.1工作站；氮吹儀（美國Organomation公司）。

1.2 藥品與試劑

熟地黃、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉、牡丹皮，六味中藥材購于北京同仁堂哈爾濱藥店。

乙腈（色譜級(jí)，德國Merck公司）；甲醇（色譜級(jí)，美國Fisher公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；甲酸（色譜級(jí)，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；亮氨酸腦啡肽（美國Sigma公司）；乙醚（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）。

1.3 藥液的制備

1.3.1 六味地黃丸給藥樣品的制備

依據(jù)2015版《中國藥典》，同時(shí)為了全面地檢出中藥血清移行成分，引導(dǎo)后續(xù)實(shí)驗(yàn)開展，并按照大鼠劑量和人體劑量的折算關(guān)系，將成人口服LW的一日劑量折合成本實(shí)驗(yàn)中大鼠的LW低劑量，將成人口服LW一日劑量的5倍折合成本實(shí)驗(yàn)中大鼠的LW中劑量，將成人口服LW一日劑量的10倍折合成本實(shí)驗(yàn)中大鼠的LW高劑量。根據(jù)上述依據(jù)，按比例取六味中藥材并充分混合，10倍量甲醇中浸泡30 min后，超聲提取40 min，重復(fù)3次，合并濾液，減壓濃縮，得到LW提取液濃膏。向濃膏中加入事先配制好的0.5%的CMC-Na溶液充分混懸，制備成含生藥量0.81 g·mL-1混懸液，即為L(zhǎng)W高劑量，并逐級(jí)稀釋成0.405 g·mL-1，即為L(zhǎng)W中劑量，以及0.081 g·mL-1，LW低劑量，配置好的藥液4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 六味地黃丸供試品溶液的制備

按比例稱取6味中藥材，共計(jì)12.5 g，加入10倍量甲醇125 mL，超聲30 min，于4℃、13 000 rpm離心10 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液備用，供進(jìn)樣分析。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)已明確預(yù)產(chǎn)期的妊娠SD雌性大鼠25只，體質(zhì)量250±20 g，購置于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物安全性評(píng)價(jià)中心，許可證號(hào)P00102004。

2 方法

2.1 模型復(fù)制

本實(shí)驗(yàn)采用瑞典學(xué)者Bjelke[7]在1991年首次提出的延遲剖宮產(chǎn)手術(shù)法，結(jié)合李星兒等[8]對(duì)該模型的改良方法，復(fù)制本研究的先天性HICP模型大鼠。取12只臨產(chǎn)的大鼠打開腹腔后用4個(gè)止血鉗分別夾閉雙側(cè)子宮角血管，夾閉10 min時(shí)，立即從子宮取出新生大鼠，用棉簽對(duì)新生大鼠進(jìn)行術(shù)后搶救，最終成活100只；另取3只臨產(chǎn)的大鼠僅進(jìn)行剖宮產(chǎn)手術(shù)，不用止血鉗夾閉子宮角血管進(jìn)行延遲，最終得到27只成活的新生大鼠；剩余10只臨產(chǎn)大鼠需至少提前1天自然分娩。

2.2 動(dòng)物分組與給藥

共分為5組，即僅行剖宮產(chǎn)手術(shù)得到的仔鼠隨機(jī)選取20只作為假手術(shù)對(duì)照組（Control，C）；行延遲剖宮產(chǎn)手術(shù)得到的新生大鼠隨機(jī)選取80只并平均分成4組即模型組（Modle，M），LW低劑量給藥組（LWL）、LW中劑量給藥組（LWM）、LW高劑量給藥組（LWH），（保證雌雄比例1：1）。各給藥組大鼠每天給予相應(yīng)劑量LW提取液灌胃，對(duì)照組與模型組給予蒸餾水灌胃。由于前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用延遲剖宮產(chǎn)手術(shù)復(fù)制的HICP模型大鼠在49日齡內(nèi)處于研究設(shè)計(jì)需要的病理狀態(tài)，所以最終的給藥時(shí)間為從大鼠21日齡離乳到大鼠49日齡，共計(jì)28天，給藥量為10 mL·kg-1。

2.3 術(shù)后飼養(yǎng)

研究選取自然分娩的10只母鼠作為代乳鼠，先將其取出置于另一鼠籠中，并將其所產(chǎn)仔鼠全部丟棄，然后將上述五組新生大鼠標(biāo)記好組別每窩10只分別埋入每只代乳鼠籠里的墊料中，充分接觸，待20 min后將代乳鼠放回原籠中即可。

2.4 生物樣品的收集與制備

從新生大鼠21日齡開始，尿液樣本每隔七天收集一次，采集后于4℃，13 000 rpm，離心10 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液供UPLCHDMS分析；血液樣本于最后一次給藥后1 h內(nèi)進(jìn)行采集，并于4℃，3 500 rpm離心10 min分離血清，并采用甲醇沉淀法即用6倍量甲醇進(jìn)行蛋白沉淀。

2.5 行為學(xué)方法檢測(cè)

依照李曉捷等[9]給出的腦癱動(dòng)物的神經(jīng)行為學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)中的HICP模型大鼠的自身情況分別選取懸吊實(shí)驗(yàn)、斜坡實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和拒俘反應(yīng)實(shí)驗(yàn)對(duì)各組大鼠成長(zhǎng)階段的行為能力進(jìn)行考察。

2.6 尿液代謝組學(xué)測(cè)試方法

色譜柱：Waters ACQUITY UPLCTMHSS T3（2.1 mm ×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸乙腈，B為0.1%甲酸水；梯度洗脫程序?yàn)?-2.5 min，1%-11%A，2.5-4.5 min，11%-25% A，4.5-8 min，25%-60%A，8-8.5 min，60%-99%A。質(zhì)譜條件：正離子模式下毛細(xì)管電壓2.6 kV，樣品錐孔電壓30 V，提取錐孔電壓3.0 V，脫溶劑氣溫度300℃，脫溶劑氣流量600 L·h-1；負(fù)離子模式下毛細(xì)管電壓2.0 kV，樣品錐孔電壓35 V，提取錐孔電壓3.5 V，脫溶劑氣溫度200℃，脫溶劑氣流量600 L·h-1。

2.7 六味地黃丸體內(nèi)外成分檢測(cè)方法

為避免分析結(jié)果的無效重疊，本次正負(fù)離子模式以及體內(nèi)外樣品均采用一套分析條件，即色譜柱：Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸乙腈，B為0.1%甲酸水；梯度洗脫程序?yàn)?-2 min，10%-35%A，2-3 min，35%-60%A，3-6 min，60%-80%A，6-8.5 min，80%-99%A。質(zhì)譜條件：毛細(xì)管電壓：2.8 kV；錐孔采樣電壓：35 V；錐孔提取電壓：3.2 V；去溶劑氣溫度：300℃；去溶劑氣流量：600 L·h-1；離子源溫度：110℃。質(zhì)譜數(shù)據(jù)在Continuum全掃描方式下應(yīng)用MS E模式進(jìn)行采集。

2.8 數(shù)據(jù)處理

2.8.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

測(cè)得數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行兩因素方差（two-way ANOVA）分析，多組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 各組大鼠行為學(xué)分析

2.8.2 生物標(biāo)記物分析

將所得尿液代謝組學(xué)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Waters Progenesis QI軟件，結(jié)合Ezinfo 2.0軟件對(duì)大鼠尿液代謝輪廓進(jìn)行分析，再應(yīng)用QI軟件中Identify Compounds鑒定成分模塊，對(duì)HICP模型大鼠尿液潛在生物標(biāo)記物在Human Metabolome Database＊（HMDB）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相關(guān)檢索，最終利用Masslynx 4.1軟件Massfragment模塊對(duì)圈定的生物標(biāo)記物進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)驗(yàn)證。

2.8.3 血中移行成分分析

分別采用UNIFI軟件對(duì)LW體內(nèi)外成分進(jìn)行直觀比較以及Masslynx 4.1軟件中的Metabolynx模塊對(duì)LW干預(yù)HICP模型大鼠有效狀態(tài)下的血中移行成分進(jìn)行分析。

2.8.4 相關(guān)性分析

運(yùn)用血清化學(xué)成分與代謝標(biāo)記物相關(guān)性分析法（Plotting of Correlation between Marker Metabolites and Serum Constituents，PCMS），對(duì)LW入血成分譜與效應(yīng)標(biāo)記物進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，將LW入血成分群與潛在生物標(biāo)記物含量變化矩陣導(dǎo)入PCMS軟件，設(shè)定相關(guān)系數(shù)（r）1和2均為0.7，運(yùn)算后導(dǎo)出相關(guān)分析結(jié)果Heatmap圖，以0.7≤r≤1作為潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)篩選標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過進(jìn)一步篩選圈定干預(yù)HICP模型的潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 結(jié)果

3.1 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果

各組大鼠行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果（見圖1），與假手術(shù)對(duì)照組相比，HICP模型組大鼠表現(xiàn)為在玻璃棒上懸吊的時(shí)間較短，在斜坡上完成調(diào)轉(zhuǎn)頭向上的時(shí)間較長(zhǎng)，30 s內(nèi)的活動(dòng)較少，且很容易被抓取，且通過兩因素方差分析發(fā)現(xiàn)，HICP模型組大鼠在斜坡、曠場(chǎng)和拒俘實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出顯著性差異，說明延遲剖宮產(chǎn)手術(shù)能夠影響新生大鼠整體行為能力；但隨著LW給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，HICP模型大鼠的各項(xiàng)行為能力都有所改善，與模型組相比，3個(gè)給藥組大鼠在斜坡和拒俘實(shí)驗(yàn)中顯示出了顯著性差異，說明口服LW能夠一定程度上提高HICP模型大鼠的整體行為能力。

3.2 代謝組學(xué)分析結(jié)果

在給藥第0天即大鼠21日齡時(shí)，對(duì)假手術(shù)對(duì)照組與模型組代謝輪廓進(jìn)行分析，得到相應(yīng)的得分圖（圖2-1）和S&VIP-plot圖（圖2-2），最終表征了HICP模型大鼠尿液中20個(gè)潛在生物標(biāo)記物（見表1和2），并進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)記物主要通過影響腦神經(jīng)中樞和腎臟功能兩方面進(jìn)一步擾動(dòng)糖類代謝、氨基酸代謝、核苷酸代謝、煙酸和煙酰胺代謝、甾體激素類生物合成五大代謝途徑。

對(duì)LW給藥第28天時(shí)5組大鼠代謝輪廓進(jìn)行PCA及PLS-DA分析，得到相關(guān)尿液代謝輪廓得分圖（見3-1和圖3-2），結(jié)果表明口服LW使得HICP模型大鼠尿液代謝譜發(fā)生明顯變化，顯示LW各給藥組的代謝輪廓較模型組更加接近假手術(shù)對(duì)照組，且LW給藥組能夠通過調(diào)節(jié)的代謝經(jīng)路包括糖類代謝、氨基酸代謝、核苷酸代謝和甾體激素類生物合成四大類代謝途徑回調(diào)HICP模型大鼠尿液20個(gè)潛在生物標(biāo)記物中的13個(gè)，具體含量變化圖（見圖4）。

圖2 LW給藥第0天即新生大鼠21日齡時(shí)假手術(shù)對(duì)照組與模型組大鼠尿液代謝物S&VIP-plot圖

3.3 六味地黃丸血中移行成分分析

利用UPLC-HDMS技術(shù)對(duì)LW干預(yù)HICP有效狀態(tài)下的血中移行成分進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)了20個(gè)血中顯效成分；包括14個(gè)LW體外原型成分及6個(gè)代謝產(chǎn)物，詳細(xì)信息見表3和表4。

3.4 潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究

采用PCMS分析方法計(jì)算20個(gè)色譜峰與HICP模型大鼠尿液潛在生物標(biāo)記物的相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見分析熱圖（見圖5）。進(jìn)一步對(duì)PCMS處理得到的結(jié)果進(jìn)行總體歸納，顯效成分在不同劑量組中與生物標(biāo)記物高度相關(guān)的個(gè)數(shù)達(dá)到9個(gè)及以上，認(rèn)為該顯效成分為與HICP生物標(biāo)記物高度相關(guān)成分。最終圈定了5個(gè)成分，分別為：6-O-甲基梓醇、莫諾苷、丹皮酚原苷、毛蕊花苷、獐牙菜苷脫水的代謝產(chǎn)物，均為L(zhǎng)W干預(yù)HICP模型的潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

表1 正離子模型下HICP模型大鼠尿液中潛在生物標(biāo)記物的具體信息表

表2 負(fù)離子模型下HICP模型大鼠尿液中潛在生物標(biāo)記物的具體信息表

圖3 LW不同劑量干預(yù)HICP模型大鼠尿液代謝輪廓Score plot圖

圖4 LW干預(yù)HICP模型大鼠尿液中潛在生物標(biāo)記物的含量變化圖

表3 基于直觀比較法LW的血中移行成分鑒定結(jié)果（即原型入血成分）

表4 基于Metabolynx數(shù)據(jù)處理方法的血中移行成分鑒定結(jié)果（藥物代謝物入血成分）

圖5 LW血中移行成分與HICP模型尿液潛在生物標(biāo)記物相關(guān)性分析熱圖

4 討論

中醫(yī)理論中，腎和腦從屬于一個(gè)系統(tǒng)，兩者在生理上相互滋補(bǔ)，在病理上相互影響[10]，而小兒稚陽純氣，無須益火，所以宋代太醫(yī)丞錢乙首創(chuàng)了滋補(bǔ)腎陰的名方六味地黃丸用于治療小兒的“五遲、五軟”證。依據(jù)此理論，本研究選擇現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中臨床表現(xiàn)與“五遲、五軟”證相近的小兒腦癱動(dòng)物模型作為研究對(duì)象。相關(guān)文獻(xiàn)中記載缺氧缺血腦癱模型是最常用的小兒腦癱模型，然而延遲剖宮產(chǎn)手術(shù)法較頸動(dòng)脈結(jié)扎法不僅操作簡(jiǎn)單，可一次性獲得大量模型大鼠，最重要的是能夠高度模擬人類新生兒因?qū)m內(nèi)窘迫而致缺氧缺血腦癱的病理進(jìn)程以及符合“五遲、五軟”證的中醫(yī)病機(jī)。因此，最終我們采用延遲剖宮產(chǎn)手術(shù)法復(fù)制HICP模型。

續(xù)圖5 LW血中移行成分與HICP模型尿液潛在生物標(biāo)記物相關(guān)性分析熱圖

目前臨床上診斷小兒腦癱，主要依靠其特征性的臨床表現(xiàn)，故經(jīng)典的神經(jīng)行為學(xué)檢驗(yàn)是評(píng)價(jià)腦癱動(dòng)物模型的重要手段，本研究分別從肌力、身體協(xié)調(diào)性、空間適應(yīng)能力和情感行為能力4個(gè)方面對(duì)LW給藥前后大鼠的行為進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。又由于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組大鼠在每個(gè)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)參差不齊，所以本實(shí)驗(yàn)又采用行為學(xué)總分的方法更直觀的對(duì)5組大鼠的整體行為能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。行為學(xué)結(jié)果表明了延遲剖宮產(chǎn)手術(shù)成功地復(fù)制了大鼠缺氧缺血腦癱模型，同時(shí)說明了LW能夠在一定程度上改善HICP模型大鼠的整體行為能力。

本研究借助代謝組學(xué)技術(shù)平臺(tái)，從分子水平描述了HICP模型的病理狀態(tài)，以及LW通過滋陰補(bǔ)腎的作用調(diào)節(jié)HICP模型大鼠的腎臟功能，進(jìn)而改善大腦神經(jīng)中樞以及身體各方面機(jī)能的作用機(jī)制，涉及四大類代謝途徑包括：糖類代謝通路、氨基酸代謝通路、核苷酸代謝通路、甾體激素類合成。其中，糖類代謝通路又包括能量代謝和氨基糖苷類代謝，而氨基糖苷類代謝異常，N-乙酰神經(jīng)氨酸經(jīng)腎臟消除減少則會(huì)造成唾液酸堆積[11,12]，從而引起小兒腦癱癥的發(fā)生。結(jié)果顯示HICP模型大鼠給予LW后，體內(nèi)過量的N-乙酰神經(jīng)氨酸減少，表明LW可能通過提高腎臟對(duì)N-乙酰神經(jīng)氨酸的消除作用從而有效改善小兒腦癱的癥狀。

續(xù)圖5 LW血中移行成分與HICP模型尿液潛在生物標(biāo)記物相關(guān)性分析熱圖

氨基酸代謝又包括酪氨酸、色氨酸以及精氨酸和脯氨酸代謝。其中MHPG-SO4是腦中去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE）硫酸化的代謝物。NE是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的神經(jīng)介質(zhì)，它對(duì)體內(nèi)許多生理活動(dòng)具有調(diào)節(jié)作用[13]。前期研究表明，精神抑郁癥患者血清中MHPG-SO4的表達(dá)水平明顯低于健康群體[14]，這可能是造成本研究中HICP模型組較假手術(shù)對(duì)照組在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和拒俘反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)較差的原因，而HICP模型大鼠給予LW后MHPG-SO4相對(duì)含量增加，空間適應(yīng)能力和情感行為能力有所增強(qiáng)，表明LW可能通過調(diào)節(jié)HICP模型大鼠體內(nèi)MHPG-SO4的含量，從而有效改善HICP模型大鼠的行為能力。

核苷酸代謝中包括嘌呤核苷酸代謝和嘧啶核苷酸代謝，其中嘌呤核苷酸體內(nèi)的終產(chǎn)物尿酸是臨床上用于診斷腎臟功能的重要指標(biāo)[15]。同時(shí)，尿酸的甲基衍生物，3-甲基尿酸和1,3-二甲基尿嘧啶可以作為嘌呤核苷酸代謝異常以及泌尿系統(tǒng)結(jié)石的標(biāo)志[16,17]。本研究結(jié)果中HICP模型大鼠尿液中尿酸、黃嘌呤核苷酸、3-甲基尿酸和1,3-二甲基尿嘧啶的含量明顯高于假手術(shù)對(duì)照組，而LW各給藥組大鼠尿液中以上各項(xiàng)指標(biāo)含量明顯低于HICP模型組，提示LW可能通過增強(qiáng)體內(nèi)嘌呤核苷酸分解代謝能力以及某些腎臟功能從而緩解HICP模型大鼠的病理狀態(tài)。

甾體激素類合成代謝中雄烯二酮減低會(huì)導(dǎo)致男性發(fā)育遲緩造成侏儒癥[18,19]。研究結(jié)果中HICP模型大鼠尿液中雄甾烯二酮的含量較假手術(shù)組偏低，這可能是造成模型組大鼠較對(duì)照組發(fā)育遲緩的原因。而LW正是通過改善大鼠體內(nèi)的甾體激素類合成從而促進(jìn)HICP模型大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育。

通過行為學(xué)和代謝組學(xué)結(jié)果闡明了LW對(duì)HICP模型干預(yù)作用的基礎(chǔ)上，利用中藥血清藥學(xué)化學(xué)的理論和方法，對(duì)LW干預(yù)HICP模型有效狀態(tài)下的體內(nèi)直接作用成分進(jìn)行分析，最終發(fā)現(xiàn)了20個(gè)入血成分，又通過PCMS軟件，建立LW體內(nèi)直接作用成分“譜”對(duì)生物標(biāo)記物“效”的關(guān)系，即提取與內(nèi)源性生物標(biāo)記物高度相關(guān)的外源性中藥成分，并最終篩選出6-O-甲基梓醇、莫諾苷、丹皮酚原苷、毛蕊花苷、獐牙菜苷脫水的代謝產(chǎn)物為L(zhǎng)W干預(yù)HICP模型潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究借助中醫(yī)方證代謝組學(xué)理論和技術(shù)，表明六味地黃通過調(diào)節(jié)機(jī)體的糖類代謝、氨基酸代謝、核苷酸代謝和甾體激素類生物合成四大類代謝途徑，有效改善缺氧缺血的病理狀態(tài)，從而干預(yù)小兒腦癱發(fā)生發(fā)展的病理過程。并通過PCMS軟件篩選出LW干預(yù)HICP模型潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)即6-O-甲基梓醇、莫諾苷、丹皮酚原苷、毛蕊花苷、獐牙菜苷脫水的代謝產(chǎn)物。中醫(yī)方證代謝組學(xué)理論是揭示中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的有力手段。

1 Wang X, Zhang A, Sun H. Future perspectives of Chinese medical formulae: Chinmedomics as an effector. OMICS, 2012,16:414-421.

2 王喜軍.中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的系統(tǒng)方法學(xué)-中醫(yī)方證代謝組學(xué).中國中藥雜志,2015,40(1):13-17.

3 劉琦,趙宏偉,張愛華,等.基于中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究男仕膠囊治療腎陽虛證的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制.中國中醫(yī)藥雜志,2016,41(11):1-14.

4 王萍,王喜軍.六味地黃丸研究現(xiàn)狀.中醫(yī)藥信息,2013,30(3):163-165.

5 魏自太.五遲五軟臨證述要.浙江中醫(yī)雜志,2012,6(3):16-17.

6 王雪峰.五遲、五軟、五硬與腦癱.中國中西醫(yī)結(jié)合兒科學(xué),2009,1(2):153-155.

7 Bjelke B, Andersson K, Ogren S O, et al. Asphyctic lesion: Proliferation of tyrosine hydroxylase-immunoreactive nerve cell bodies in the rat substantia nigra and functional changes in dopamine neurotransmission. Brain Res, 1991, 543(1): 1-9.

8 李星兒,袁青,唐純志,等.延遲5分鐘剖宮產(chǎn)造全腦缺氧缺血新生大鼠模型.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2012,20(4):21-25.

9 李曉捷,高晶,孫忠人.宮內(nèi)感染致早產(chǎn)鼠腦癱動(dòng)物模型制備及其鑒定的實(shí)驗(yàn)研究.中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2004,19(12):885-889.

10 牛曉梅.中醫(yī)對(duì)新生兒缺氧缺血性腦病的認(rèn)識(shí)及治療展望.現(xiàn)代中醫(yī)藥,2004,2(3):56-58.

11 Blix G, Lindberg E, Odin L, et al. Studieds on sialic acids. Acta Soc Med Upsaliensis, 1956, 61: 1.

12 Varho T T, Alajoki L E, Posti K M, et al. Phenotypic spectrum of Salla disease, a free sialic acid storage disorder. Pediatr Neurol, 2002, 26(4): 267-273.

13 Lee S H, Sung H J, Ok S H. Lipid emulsions enhance the norepinephrine-mediated reversal of local anesthetic-induced vasodilation at toxic doses. Yonsei Med J, 2013, 54(6): 1524-1532.

14 Hoaki Y, Nishikawa T, Ida Y, et al. Effect of haloperidol administration on serum MHPG-SO4 levels in chronic schizophrenics. Kurume Med J,1981, 28(3): 197-200.

15 Morris G S, Simmonds H A, Davies P M. Use of biological fluids for the rapid diagnosis of potentially lethal inherited disorders of human purine and pyrimidine metabolism. Biomed Chromatogr, 1986, 1(3): 109-118.

16 Okabayashi Y, Yamamoto I, Komatsuzaki Y. A rare case of nephrocalcinosis in the distal tubules caused by hereditary renal hypouricemia three months after kidney transplantation. Nephrology (Carlton), 2016, 12.

17 Safranow K. Identification and quantitation of purine derivatives in urinary calculi as markers of abnormal purine metabolism by using high-performance liquid chromatography (HPLC). Ann Acad Med Stetin, 2000, 46: 35-49.

18 葉泉,張利.小兒侏儒癥治驗(yàn).四川中醫(yī),1992,2:56-58.

19 Kovac J R, Pan M, Arent S, et al. Dietary adjuncts for improving testosterone levels in hypogonadal males. Am J Mens Health, 2016, 10(6): NP109-NP117.

Impacts of Liu Wei Di Huang Wan (LW) on a Rat Model of Cerebral Palsy Based on Chinmedomics

Li Qiuju, Wang Ping, Wang Meijia, Kang Shuyu, Zhang Ye, Zhang Aihua, Wang Xijun
(Research Center of Chinmedomics-State Administration of TCM-Laboratory of Metabolomics / National TCM Key Laboratory of Serum Pharmacochemistry / Sino-US Chinmedomics Technology Cooperation Center, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

This study aimed to explore the pharmacodynamic material basis of Liu Wei Di Huang Wan (LW) in the rat model of cerebral palsy and its mechanism based on the theory and technological platform of Chinmedomics. The delayed cesarean operation was performed to establish the rat model of hypoxic-ischemic cerebral palsy (HICP) and ensued the evaluation of the model with classical behavior and the administration of LW. At last, the correlation between the potential biomarkers of HICP was computed and the markedly component of LW in vivo was explored by the technologies of chinmedomics. It was found that four categories of metabolic pathways of HICP rats were regulate within the administration of LW, involving carbohydrate metabolism, amino acid metabolism, nucleotide metabolism and steroid hormone synthesis biological metabolic, to promote motor ability of HICP rats. It was determined that 6-O-methylcatalpol, morroniside, verbascose, paeonolide, and the dehydrated metabolite of Sweroside were the potential pharmacodynamic materials of LW in its treatment of HICP. It was concluded that chinmedomics was a powerful method of clarifing the pharmacodynamic materials of Chinese materia medica.

Chinmedomics, hypoxic-ischemic cerebral palsy, Liu Wei Di Huang Wan, pharmacodynamic materials, metabolites, traditional Chinese medicine, serum pharmacochemistry of Chinese materia medica, metabolomics

10.11842/wst.2016.10.008

R285

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-09-19

修回日期：2016-10-17

＊ 國家自然科學(xué)基金委重點(diǎn)項(xiàng)目（81430093）：中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的系統(tǒng)分析方法學(xué)——中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究，負(fù)責(zé)人：王喜軍；科學(xué)技術(shù)部“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項(xiàng)（2015ZX09101043-011）：課題名稱：中藥經(jīng)典名方整合作用機(jī)制關(guān)鍵技術(shù)研究，負(fù)責(zé)人：王喜軍；國家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目（81473584）：基于新生大鼠腦癱模型的六味地黃丸治療“五遲”、“五軟”證的作用機(jī)理及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，負(fù)責(zé)人：王萍。

＊＊ 通訊作者：王喜軍，本刊編委，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥血清藥物化學(xué)及中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究。