基于中醫(yī)方證代謝組學(xué)的男仕口服液治療腎陽虛證的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機理研究＊

張愛華，劉 琦，趙宏偉，孫 暉，周小航，南 洋，孔 玲，關(guān) 瑜，鄒士玉，馬中華，王喜軍＊＊

（1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥血清藥物化學(xué)重點研究室/中美中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)合作中心 哈爾濱 150040；2. 無限極（中國）有限公司 廣州 510623）

基于中醫(yī)方證代謝組學(xué)的男仕口服液治療腎陽虛證的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機理研究＊

張愛華1，劉 琦1，趙宏偉2，孫 暉1，周小航1，南 洋1，孔 玲1，關(guān) 瑜1，鄒士玉2，馬中華2，王喜軍1＊＊

（1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥血清藥物化學(xué)重點研究室/中美中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)合作中心 哈爾濱 150040；2. 無限極（中國）有限公司 廣州 510623）

目的：基于中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)分析男仕口服液干預(yù)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的腎陽虛證大鼠模型內(nèi)源性代謝生物標(biāo)記物的變化趨勢，探索男仕口服液入血成分與其治療腎陽虛證過程的相關(guān)代謝物及代謝通路的相關(guān)性，挖掘男仕口服液發(fā)揮治療作用的體內(nèi)直接作用物質(zhì)及作用機理。方法：檢測大鼠“下丘腦-垂體-靶器官軸”各激素水平并觀察相應(yīng)靶器官的組織形態(tài)學(xué)，評價男仕口服液對腎陽虛證的作用效果；利用模式識別分析各組大鼠尿液代謝譜，研究男仕口服液對腎陽虛證生物標(biāo)記物影響，同時在顯效基礎(chǔ)上分析其入血成分與腎陽虛證生物標(biāo)記物群的相關(guān)性，確定其發(fā)揮治療作用的潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。結(jié)果：模型大鼠血清的CRH、CORT、T3、T4、T和尿17-OHCS含量顯著下降；男仕口服液可顯著提升血清中CRH、CORT、T3、T4、cAMP和尿中17-OHCS水平，調(diào)節(jié)類固醇激素的生物合成、色氨酸代謝和酪氨酸代謝；PCMS相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)男仕口服液顯效劑量下與代謝標(biāo)記物高度相關(guān)的入血成分主要為：水晶蘭苷、沒食子酸、雞矢藤苷、莫諾苷葡萄糖醛酸化產(chǎn)物、甜菊苷C、甜菊雙糖苷，這些成分是男仕口服液治療腎陽虛證的藥效關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)。結(jié)論：本研究運用中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)建立了“腎陽虛證代謝標(biāo)記物-男仕口服液體內(nèi)直接作用物質(zhì)-藥效關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)”的分析模式，發(fā)現(xiàn)水晶蘭苷、沒食子酸、雞矢藤苷等成分通過改善多個代謝途徑（激素合成途徑、酪氨酸代謝中激素合成與釋放途徑等），從整體上糾正代謝輪廓的改變，體現(xiàn)了男仕口服液治療腎陽虛證的多途徑、多靶點、整體調(diào)節(jié)的作用特點。該研究為基于臨床有效性的創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

中醫(yī)方證代謝組學(xué) 腎陽虛證 男仕口服液 代謝標(biāo)記物 藥效物質(zhì)基礎(chǔ)

中醫(yī)方證代謝組學(xué)（Chinmedomics）[1，2]，是將中藥血清藥物化學(xué)和代謝組學(xué)有機結(jié)合，在研究證候生物標(biāo)記物的基礎(chǔ)上，建立方劑藥效生物評價體系，發(fā)現(xiàn)并確定中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為中醫(yī)證本質(zhì)的研究、中藥方劑現(xiàn)代研究、中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、中藥產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化發(fā)展和創(chuàng)新藥物設(shè)計提供有效的研究方法[3-6]，已經(jīng)廣泛用于中藥或方劑有效成分的挖掘研究中[7-9]。

男仕口服液是由何首烏、巴戟天、熟地黃、枸杞子、大棗、核桃和金櫻子等組成的補腎陽的方劑，具有溫補腎陽之效。其方劑組成已被證實對皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的腎陽虛證模型大鼠的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂、緩解虛寒之證具有改善作用，且明確了其可以有效回調(diào)黃尿酸、3-甲氧基腎上腺素等腎陽虛證生物標(biāo)記物[10]。其中，腎陽虛證模型采用糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂的癥狀，模型穩(wěn)定，可重復(fù)，并很好地模擬了腎陽虛證的臨床表現(xiàn)[11]，已經(jīng)成為評價方劑的補腎陽作用的經(jīng)典模型[12-14]。

目前，男仕口服液治療腎陽虛證的關(guān)鍵藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。因此，本研究采用中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)，分析男仕口服液對腎陽虛證生物標(biāo)記物的影響，探索與腎陽虛證本質(zhì)密切相關(guān)的生物標(biāo)記物、代謝通路及男仕口服液對這些標(biāo)記物的調(diào)節(jié)作用，并在男仕口服液發(fā)揮治療作用基礎(chǔ)上分析其入血成分群與腎陽虛證生物標(biāo)記物的相關(guān)性，最終確定其發(fā)揮治療作用的有效成分，為其創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)的臨床有效性研究提供方法學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Waters Acquity TM UPLC 液相色譜儀（美國Waters集團(tuán)公司）；Waters Synapt TM High Definition MS（HDMS/MS）System 質(zhì)譜儀（美國Waters集團(tuán)公司）；MassLynx V4.1工作站（美國Waters集團(tuán)公司）；KDC-160HR 型高速低溫離心機（科大創(chuàng)新股份公司）；VX-Ⅱ多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）；全自動組織包埋機（美國Thermo HistoStar公司）；2145型切片機（德國·佧公司）；r-911全自動放免計數(shù)儀（中國科技大學(xué)實業(yè)總公司）；酶標(biāo)儀（美國PerkinElmer公司）；DP72型顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；BX60型顯微鏡照相系統(tǒng)（日本OLYMPUS公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SL-1000XLS型移液器（上海梅特勒·托利多儀器有限公司）規(guī)格：100-1000μL；PB1501-N型電子分析天枰（上海梅特勒·托利多儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

男仕口服液（無限極有限公司，批號：20130716）；皮質(zhì)酮（Corticosterone，CORT）放免試劑盒放免試劑盒（北京華英生物有限公司，批號：20140406）、促腎上腺皮質(zhì)激素（Adrenocorticotropic Hormone，ACTH）放免試劑盒（北京華英生物有限公司，批號：20140401）、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（Corticotropin Releasing Hormone，CRH）（北京華英生物有限公司，批號：20140406）；三氟甲狀原氨酸（Tri-fluorothyronine 3，T3）放免試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所，批號：20140305）、睪酮（Testosterone，T）放免試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所，批號：20140305）、甲狀腺素（Thyroxine 4，T4）放免試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所，批號：20140305）；17-羥基類固醇（17-hydroxy Corticosteroid，17-OHCS）（南京建成生物工程研究所，批號：20140414）、環(huán)磷酸腺苷（cyclic Adenosine Monophosphate，cAMP）活性分析試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20140320）、環(huán)磷酸鳥苷（cyclic Guanosine Monophosphate，cGMP）活性分析試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20140425）；橄欖油（注射級，科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20131206）；皮質(zhì)酮（美國SIGMA技術(shù)有限公司，批號：C2505）；亮氨酸腦啡肽（美國SIGMA技術(shù)有限公司，批號：L9133）；乙腈色譜級（德國Merck技術(shù)有限公司）；甲酸（色譜級，美國SIGMA技術(shù)有限公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料公司）。

1.3 給藥樣品的制備

1.3.1 制備皮質(zhì)酮橄欖油溶液

稱取600 mg皮質(zhì)酮，置于組織研磨器中，向組織研磨器中加入20 mL橄欖油，充分研磨后10 min后，再量取40 mL橄欖油置于皮質(zhì)酮油溶液中，充分混勻。轉(zhuǎn)移到廣口瓶中，充分均質(zhì)10 min，即得10 mg·mL-1皮質(zhì)酮橄欖油溶液。

1.3.2 制備男仕口服液

取男仕口服液500 mL[9]，減壓濃縮至200 mL左右，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度線，充分混勻，即得。

1.3.3 制備男仕口服液體外成分分析樣本

取男仕口服液2 mL，加入蒸餾水8 mL進(jìn)行稀釋后于4℃，13 000 r·min-1離心15 min，取上清液過0.22 μm濾膜，即得。

1.3.4 制備男仕口服液體內(nèi)成分分析樣本

取大鼠空白血清及給藥血清各1.0 mL，加入4%磷酸50 μL，混懸震蕩30 s后超聲處理1 min，然后上樣到預(yù)先以2 mL甲醇、2 mL水活化平衡好的SPE柱上，分別以0.5 mL水淋洗，淋洗液棄去，再以1 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，于35℃下氮氣流吹干，殘渣用200 μL 80%甲醇溶液復(fù)溶，超聲處理1 min，混懸震蕩30 s后，于4℃、13 000 rpm條件下離心10 min，取上層清液過0.22 μm濾膜，即得。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組與給藥

清潔級雄性Wistar大鼠24只，體重250±10 g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)溫度25±3℃，濕度65%-75%，12 h避光，12 h光照，自由攝食飲水；完全隨機法分為空白組、模型組和男仕口服液組，每組各8只?？瞻捉M大鼠每天按0.01 mL·kg-1體重皮下注射橄欖油液21天，復(fù)制腎陽虛證大鼠模型[15]，然后每天以0.1 mL·kg-1體重灌胃蒸餾水，連續(xù)14天；模型組和男仕口服液組大鼠每天0.01 mL·kg-1體重皮下注射皮質(zhì)酮橄欖油液21天，復(fù)制腎陽虛證大鼠模型，之后模型組大鼠每天按0.1 mL·kg-1體重灌胃蒸餾水，連續(xù)14天，男仕口服液組大鼠每天按0.1 mL·kg-1體重灌胃男仕口服液，連續(xù)14天。

2.2 實驗樣本收集

各組大鼠于實驗第35天收集累積12 h尿液樣本，并經(jīng)離心處理后凍存于-80℃冰箱。空白組和男仕口服液組大鼠在實驗第35天藥物灌胃后30 min尾靜脈采血2 mL用于體內(nèi)外成分分析；同時各組均于實驗結(jié)束（第35天）時對每只大鼠進(jìn)行腹主動脈采集血樣，按照試驗程序處理獲取血清，在4℃、3 000 r·min-1條件下離心處理10 min以獲得血清；下丘腦、垂體、腎上腺和甲狀腺在大鼠全身灌注4%多聚甲醛溶液后，取出固定備用。

2.3 臨床化學(xué)及組織病理學(xué)指標(biāo)檢測

按試劑盒說明操作檢測血清CRH、CORT、ACTH、T3、T4、T血漿cAMP 和cGMP、尿17-OHCS；按照HE染色方法步驟制備下丘腦、垂體、腎上腺和甲狀腺的病理組織切片，并在200倍鏡下采集照片。

2.4 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集

將尿液樣本水浴解凍后，加入蒸餾水稀釋5倍后，在13 000 rpm、4℃條件下離心10 min，上清液過0.22 μm濾膜，按照表1的色譜條件與表2的質(zhì)譜條件進(jìn)行UPLC-HDMS檢測法采集尿液樣本數(shù)據(jù)，所用色譜柱型號：ACQUITY UPLCTMHSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm i.d., 1.8 μm）。

2.5 男仕口服液體內(nèi)外成分?jǐn)?shù)據(jù)采集

將男仕口服液體外樣本供試品溶液、空白血清和給藥血清樣本供試液取大鼠空白血清及給藥血清各1 mL，加入4%磷酸混懸震蕩1 min超聲2 min，上樣到預(yù)先以2 mL甲醇、2 mL水活化平衡好的SPE柱上，分別以1mL水淋洗，淋洗液棄去，再以1 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，于35℃下氮氣流吹干，殘渣用100 μL流動相復(fù)溶，超聲處理1 min，混懸震蕩30s后，在4℃、13 000 rpm條件下離心處理10 min，取上層清液，進(jìn)樣3 μL供UPLC-HDMS分析具體條件按照表3的色譜條件、表4的質(zhì)譜條件進(jìn)行UPLCHDMS血液樣本數(shù)據(jù)采集，所用色譜柱型號：ACQUITY UPLCTMHSS T3（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm）。

表1 大鼠尿液樣品UPLC流動相梯度洗脫方法

表2 大鼠尿液樣本HDMS質(zhì)譜條件

表3 男仕口服液體內(nèi)外供試品溶液UPLC流動相梯度洗脫方法

表4 男仕口服液體內(nèi)外供試品溶液HDMS質(zhì)譜采集條件

3 數(shù)據(jù)處理方法

3.1 統(tǒng)計學(xué)分析

3.2 男仕口服液對腎陽虛證生物標(biāo)記物的影響

將所采集到的大鼠尿液代謝輪廓質(zhì)譜數(shù)據(jù)全部導(dǎo)入Progenisis QI軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)降維和獲取離子信息矩陣信息，進(jìn)一步利用EZinfo 2.0軟件模塊對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分（Principal Components Analysis，PCA）分析，得到二維和三維PCA得分圖，反映各組聚類程度，直觀觀察男仕口服液對整體代謝輪廓的影響。進(jìn)一步對模型組與空白組大鼠的尿液代謝輪廓質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（Orthonal Partial LeastSquare-Discriminate Analysis，OPLSDA），利用Predictionset模塊可以將男仕口服液質(zhì)譜數(shù)據(jù)引入差異分析結(jié)果中，最終得到了PCA得分評價分?jǐn)?shù)，其中空白組評價分?jǐn)?shù)以“+1”表示，模型組評價分?jǐn)?shù)以“-1”表示，男仕口服液評價分?jǐn)?shù)為-1到+1之間的數(shù)值，最終以得分分布情況量化男仕口服液對腎陽虛證大鼠整體尿液代謝輪廓的影響。在此基礎(chǔ)上，分析男仕口服液對本課題組前期工作所明確的腎陽虛證尿液生物標(biāo)記物[10,16,17]的回調(diào)效果，用于闡明男仕口服液治療腎陽虛證的作用機制。

3.3 入血成分鑒定

利用Ezinfo 2.0中模式識別方法，首先將男仕口服液體內(nèi)外成分質(zhì)譜數(shù)據(jù)（空白血清和含藥血清）進(jìn)行PCA分析，在正、負(fù)離子模式下可以獲得由于外源藥物引入在血液中產(chǎn)生的成分差異，使得未給藥組即空白組與給藥組的血清樣品集合相互分離；再進(jìn)行有監(jiān)督的正交偏最小二乘法-判別分析，挖掘兩組間差異數(shù)據(jù)，得到對分組貢獻(xiàn)大小的離子相關(guān)S-plot及VIP圖。收集對組間離散貢獻(xiàn)較高的（VIP值＞2）目標(biāo)離子，并且滿足含藥血清數(shù)據(jù)中存在（響應(yīng)值值不為0）而空白血清中不存在（響應(yīng)值為0）的離子作為潛在男仕口服液入血成分，最終以男仕口服液體外樣本質(zhì)譜信息對這些離子進(jìn)行二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)化合物數(shù)據(jù)庫（HMDB、KEGG、Pubchem等）進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，獲得入血成分信息。

3.4 藥效關(guān)鍵物質(zhì)成分分析

運用血清化學(xué)成分與代謝標(biāo)記物相關(guān)性

善明顯（圖1-A）。

圖1 男仕口服液治療腎陽虛證的作用效果的代謝組學(xué)評價體系圖

4.3 代謝組學(xué)研究

從圖1-D、圖1-E可以發(fā)現(xiàn)，模型組與空白組在PCA得分圖二維空間上仍處于不同空間位置，而經(jīng)口服男仕口服液治療14天后，男仕口服液組大鼠PCA得分圖在空間上處于遠(yuǎn)離模型組而靠近空白組的位置，表明男仕口服液具有調(diào)節(jié)發(fā)生偏離的代謝輪廓向健康大鼠代謝輪廓的作用效果，從Predictionset預(yù)測圖（圖1-F）可以發(fā)現(xiàn)男仕口服液組整體回調(diào)趨向于空白組得分，表明男仕口服液具有良好的治療效果。

表6 腎陽虛動物模型生物標(biāo)記物詳表

在皮質(zhì)酮誘導(dǎo)腎陽虛模型大鼠尿液30個生物標(biāo)記物中（表6、圖1-C），男仕口服液可回調(diào)其中12個標(biāo)記物進(jìn)行，分別為：黃尿酸、3-亞甲二氧基吲哚、煙酰胺、3-甲氧基腎上腺素、胞嘧啶、胸苷、羥苯基乙酰甘氨酸、3β,17α,21-三羥基孕烯醇酮、酪胺、鳥嘌呤、11β,21-二羥基-5β-孕甾烷-3,20-二酮、氫化肉桂酸，由PCA分析得分圖也可以發(fā)現(xiàn)，通過對生物標(biāo)記物的有效調(diào)整，男仕口服液組大鼠向著遠(yuǎn)離模型組方向并轉(zhuǎn)向空白組方向聚集，有效回調(diào)腎陽虛證模型大鼠的代謝軌跡發(fā)生發(fā)展的趨勢。

4.4 顯效狀態(tài)下男仕口服液的入血成分分析

利用正交偏最小二乘模式識別的方法對比分析了空白組、給藥組大鼠血清的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，從中找出對兩組大鼠血清中男仕口服液的入血成分（圖2-A、圖2-B），按照預(yù)先設(shè)置的標(biāo)準(zhǔn)共鑒定30個入血成分，全部在負(fù)離子條件下檢出，詳細(xì)信息見表7、圖2-C，其中24個為原型成分，6個為代謝產(chǎn)物。其中，代謝產(chǎn)物源于何首烏的有4-羥基苯甲醛、阿魏酰酪胺、二苯乙烯苷的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物以及6-甲氧基-2-乙?；?3-甲基-1,4-萘醌-8-O-β-D葡萄糖苷甲基化產(chǎn)物；源于山茱萸的有莫諾苷葡萄糖醛酸化產(chǎn)物；源于金櫻子的有23-羥基萎陵菜酸的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。其中，原型成分有源于何首烏的2,3,5,4'-四羥基芪-2,3-葡萄糖苷、二苯乙烯苷、2-羥基，1-甲氧基蒽醌；源于巴戟天的有水晶蘭苷、銹色洋地黃醌醇、2,5-莰烷二醇、1-甲氧基-2-羥基蒽醌、雞屎藤苷、大黃酸；源于山茱萸的有馬錢子苷、莫諾忍冬苷、咖啡酸、斷氧馬錢子苷、葡糖二酸單內(nèi)酯、沒食子酸、蘋果酸；源于枸杞的有羥基桂皮酸、色氨酸；源于金櫻子的有檸檬酸、23-羥基萎陵菜酸；源于核桃的沒食子酸。另外，還有甜味劑的甜葉菊苷A、B、C、甜葉菊苷和甜葉菊雙糖苷。

4.5 藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究

采用PCMS分析方法，分別計算30個色譜峰的相對峰面積與其對應(yīng)腎陽虛效應(yīng)大小的皮爾遜相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見Heatmap圖（圖2-D）。利用相關(guān)系數(shù)判斷相關(guān)關(guān)系的密切程度，通常認(rèn)為：0.65＜| r |≤1呈顯著相關(guān)。圖2-D橫坐標(biāo)為30個生物標(biāo)記物，縱坐標(biāo)為30個入血成分，其中黑色為入血成分與生物標(biāo)記物極度負(fù)相關(guān)，藍(lán)色為入血成分與生物標(biāo)記物高度負(fù)相關(guān)，紅色為入血成分與生物標(biāo)記物極度正相關(guān)，粉色為入血成分與生物標(biāo)記物高度正相關(guān)，綠色為入血成分與生物標(biāo)記物低度正相關(guān)和低度負(fù)相關(guān)。從圖2-D可以得出，男仕口服液體內(nèi)入血30個化學(xué)成分中有6個相關(guān)峰滿足絕對相關(guān)系數(shù)值| r |大于0.65的篩選條件，為男仕口服液治療腎陽虛證的關(guān)鍵藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，分別為水晶蘭苷、沒食子酸、雞矢藤苷、莫諾苷葡萄糖醛酸化產(chǎn)物、甜菊苷C、甜菊雙糖苷，這些成分主要來源于方中何首烏、巴戟天和熟地黃。

5 討論

腎陽虛患者體內(nèi)類固醇激素含量會出現(xiàn)異常[18-21]，在本實驗中皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的大鼠腎陽虛模型中類固醇含量較空白組均表現(xiàn)出不同程度的差異，類固醇合成途徑發(fā)生紊亂。實驗組大鼠類固醇代謝通路中的3β,17α,21-三羥基-孕酮的回調(diào)現(xiàn)象表明，男仕口服液組對類固醇代謝有修復(fù)作用；激素水平恢復(fù)正常狀態(tài)水平，提示著神經(jīng)內(nèi)分泌軸的靶器官的功能恢復(fù)正常；由腎上腺等HE染色切片觀察到其分泌細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)至正常狀態(tài)，可驗證激素水平的回調(diào)與其分泌細(xì)胞的完整性密不可分。

腎陽虛證患者在臨床表現(xiàn)出精神萎靡等癥狀，這是神經(jīng)系統(tǒng)抑制的表現(xiàn)，而色氨酸代謝與神經(jīng)系統(tǒng)是密不可分的[22,23]。犬尿氨酸是這個途徑的中央化合物，既可以轉(zhuǎn)化成神經(jīng)保護(hù)劑犬尿酸，又可以轉(zhuǎn)換成神經(jīng)毒劑喹啉酸[24]。在許多神經(jīng)退行性疾?。ㄅ两鹕?、亨廷頓氏和阿爾茨海默?。d癇、多發(fā)性硬化癥、肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥、抑郁癥等均可觀察到這些內(nèi)源性的化合物的平衡被打破[25,26]。因此，維持正常的大腦功能需要足夠量的犬尿氨酸代謝途徑的代謝產(chǎn)物（犬尿酸、4,6-二羥基喹啉、黃尿酸、2-氨基粘糠酸-6-半醛等），而預(yù)防這個通路的損害可能會減弱一些神經(jīng)紊亂性疾病的病理過程。由皮質(zhì)酮誘導(dǎo)大鼠后發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠色氨酸代謝通路中的黃尿酸、4,6-二羥基喹啉、2-氨基粘糠酸-6-半醛含量均較正常組大鼠降低，表明腎陽虛證大鼠色氨酸代謝已經(jīng)明顯發(fā)生紊亂，是造成腎陽虛證大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制的直接原因，其中黃尿酸是代謝產(chǎn)物色氨酸代謝的終端產(chǎn)物，其含量的異常與腎損傷、腎毒性有關(guān)[27,28]；而男仕口服液對色氨酸途徑起修復(fù)作用主要體現(xiàn)在其可以回調(diào)黃尿酸、3-甲基二氫吲哚、5-（γ-羰基-γ-氧代丙基）-4,6-二羥基吡物標(biāo)志物，它是從代謝綜合征進(jìn)展為糖尿病和動脈粥樣硬化性心血管疾病的重要致病機制，已有報導(dǎo)發(fā)現(xiàn)糖尿病人尿液中煙尿酸含量高于非糖尿病人，而本實驗研究發(fā)現(xiàn)，模型組煙尿酸含量明顯升高，表明腎陽虛模型大鼠的糖代謝和能量代謝發(fā)生紊亂，是導(dǎo)致模型大鼠出現(xiàn)身體蜷縮畏冷的主要原因之一，給予男仕口服液后煙尿酸的含量升高，表明其可以增強機體糖代謝進(jìn)而恢復(fù)能量代謝途徑。

圖2 顯效狀態(tài)下男仕口服液潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究

續(xù)圖2 顯效狀態(tài)下男仕口服液潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究

表7 男仕口服液入血成分一級質(zhì)譜信息表

續(xù)表7

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，酪氨酸是參與合成并分泌甲狀腺素的主要原料之一，故其可以作為腎陽虛證標(biāo)記物[29]，直接影響甲狀腺素由腺泡經(jīng)過上皮細(xì)胞分泌到細(xì)胞外的過程；而且，酪氨酸通過脫羧反應(yīng)生成一種痕量單胺——酪胺，可作為神經(jīng)遞質(zhì)，具有促進(jìn)兒茶酚胺類成分去甲腎上腺素和腎上腺素釋放的作用，但酪胺并不直接激活腎上腺素受體，它可以作為腎上腺素攝取系統(tǒng)和單胺氧化酶的底物，延長腎上腺素能神經(jīng)遞質(zhì)的傳導(dǎo)行為[30,31]，促進(jìn)腎上腺素的分泌。因此，酪氨酸及其代謝物酪胺的體內(nèi)代謝水平反映了甲狀腺和腎上腺分泌細(xì)胞分泌激素的能力。本實驗中酪氨酸代謝通路中，乙酰-L-酪氨酸、酪胺、4-羥基苯乙酰谷氨酸出現(xiàn)異常，表明酪氨酸代謝通路的平衡被打破，酪氨酸代謝通路出現(xiàn)異常。男仕口服液給藥后，大鼠的酪胺和4-羥基苯乙酰谷氨酸有強烈的回調(diào)趨勢，表明男仕口服液可調(diào)節(jié)酪氨酸代謝通路，進(jìn)而改善甲狀腺和腎上腺相應(yīng)激素的合成與分泌。

嘧啶是DNA和RNA的基本組成部分，可以完成許多生物功能，特別是調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，儲存和轉(zhuǎn)移能量，形成輔酶并對磷脂及糖代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)。在嘧啶代謝循環(huán)的眾多代謝物中，胞苷是由胞嘧啶經(jīng)嘧啶核苷磷酸化酶作用代謝而來，并由胞苷脫氨酶催化代謝為尿苷。經(jīng)過磷酸化作用，尿苷轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，接著生成脫氧尿苷，進(jìn)而生成dUMP，dTMP和胸腺嘧啶核苷，胸腺嘧啶核苷又在胸腺嘧啶核苷磷酸化酶的作用下生成胸腺嘧啶＊＊ http∶//www.kegg.jp/kegg-bin/highlight_pathway?scale=1.0&map=map00240&keyword=Pyrimidine%20metabolism。而一些研究報道稱，當(dāng)機體遭遇腎臟病變時，胸腺嘧啶核苷磷酸化酶的活性表達(dá)水平有明顯差異，從而影響嘧啶代謝[32,33]。本實驗發(fā)現(xiàn)，腎陽虛證大鼠鳥嘌呤含量升高，表明鳥嘌呤發(fā)生堆積，經(jīng)鳥嘌呤生成尿酸的途徑發(fā)生影響，會導(dǎo)致尿酸經(jīng)腎臟排出量降低[34]，表明由皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的腎陽虛證大鼠的腎臟系統(tǒng)發(fā)生病變是導(dǎo)致嘌呤代謝紊亂的原因之一[35]。而從胞嘧啶到脫氧胞苷最終生成胸苷這一代謝通路的代謝物在腎陽虛證大鼠尿中一致性降低，表明腎陽虛證大鼠的嘧啶代謝發(fā)生明顯抑制，而男仕口服液可通過升高胞嘧啶水平進(jìn)而提升胸苷含量，同時也促進(jìn)了鳥嘌呤的代謝，減輕了腎臟的損傷程度。

因此，經(jīng)男仕口服液可通過顯著回調(diào)黃尿酸、羥乙基苯乙酰甘氨酸、酪氨酸等內(nèi)源性代謝物，進(jìn)而調(diào)節(jié)類固醇激素的生物合成途徑、色氨酸代謝通路中神經(jīng)遞質(zhì)合成途徑和酪氨酸代謝通路中的神經(jīng)遞質(zhì)和激素的合成與分泌途徑，使得腎陽虛證逆轉(zhuǎn)并向正常狀態(tài)轉(zhuǎn)歸，從代謝組學(xué)視角揭示了男仕口服液對腎陽虛證治療的整體過程。

本研究從經(jīng)典的臨床化學(xué)、病理學(xué)和代謝組學(xué)層面明確男仕口服液治療腎陽虛證的物質(zhì)基礎(chǔ)，利用中藥血清藥物化學(xué)方法分析口服男仕口服液后的體內(nèi)直接作用物質(zhì)，這些化學(xué)成分是參與其治療腎陽虛證的關(guān)鍵成分群，因此，結(jié)合腎陽虛證內(nèi)源性代謝生物標(biāo)記物的變化規(guī)律，建立并完善血清中外源性中藥成分與內(nèi)源性標(biāo)記物兩組變量關(guān)聯(lián)度PCMS分析方法，提取與內(nèi)源性標(biāo)記物高度關(guān)聯(lián)的外源性中藥化學(xué)成分信息，最終共尋得高度關(guān)聯(lián)的6個成分，分別為水晶蘭苷、沒食子酸、雞矢藤苷、莫諾苷葡萄糖醛酸化產(chǎn)物、甜菊苷C、甜菊雙糖苷，主要來源于方中何首烏、巴戟天和熟地黃三味中藥，為男仕口服液治療腎陽虛證的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

綜上所述，男仕口服液通過調(diào)節(jié)類固醇激素合成途徑、色氨酸代謝途徑和神經(jīng)遞質(zhì)合成途徑治療腎陽虛證，影響了黃尿酸、3-亞甲二氧基吲哚、煙酰胺、3-甲氧基腎上腺素、胞嘧啶、胸苷、羥苯基乙酰甘氨酸、3β,17α,21-三羥基孕烯醇酮、酪胺、鳥嘌呤、11β,21-二羥基-5β-孕甾烷-3,20-二酮、氫化肉桂酸等關(guān)鍵代謝標(biāo)記物的指標(biāo)水平，其治療腎陽虛證的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)是水晶蘭苷、沒食子酸、雞矢藤苷、莫諾苷葡萄糖醛酸化產(chǎn)物、甜菊苷C、甜菊雙糖苷。

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A Research of Chinmedomics on the Pharmacodynamic Basis of Nanshi Oral Liquid and Its Mechanism Behind the Efficacy on Kidney-Yang Deficiency Syndrome

Zhang Aihua1, Liu Qi1, Zhao Hongwei2, Sun Hui1, Zhou Xiaohang1, Nan Yang1, Kong Ling1, Guan Yu1, Zou Shiyu2, Ma Zhonghua2, Wang Xijun1
(1. Research Center of Chinmedomics-State Administration of TCM-Laboratory of Metabolomics / National TCM Key Laboratory of Serum Pharmacochemistry / Sino-US Chinmedomics Technology Cooperation Center, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China;
2. Infinite Pole China Co., Ltd., Guangzhou 510623, China)

This study aimed to explore the constituents migrating to blood and the correlation between the metabolites and metabolic pathways and find out the therapeutic basis and its mechanism behind the efficacy of Nanshi oral liquid (NSOL) by observing the changes of endogenous metabolic biomarkers closely related to kidney-yang deficiency syndrome (KYDS) induced by the administration of corticosterone. The hormone expressions in the hypothalamus-pituitary-target organs axes were detected, while the histomorphology of all target organs was observed to judge the efficacy of NSOL on the KYDS models. Then the serum and urine samples were analyzed using pattern recognition analysis for the verification of the impacts of the biomarkers related to NSOL on the KYDS models. Using the effective dose of NSOL, the correlation between the main constituents migrating to blood and the biomarkers were analyzed and finally confirmed the potential therapeutic basis. It was found that the levels of CRH, CORT, T3, T4, T in the blood and 17-OHCS in the urine significantly decreased, while the hypothalamus-pituitary-target organs axes were inhibited. The contents of CRH, CORT, T3, T4, cAMP in serum and 17-OHCS in the urine significantly increased with the administration of NSOL, and the biosynthesis of steroid hormone and the metabolisms of tryptophan and tyrosine were regulated. PCMS analysis showed that scandoside, monotropeine, gallic acid, stevioside C, steviolbioside and morroniside glucuronide conjugation were the main constituents migrating to blood which positively or negatively correlated with biomarkers under the effective dose, which were deemed as the pharmacodynamic substances of NSOL. In conclusion, technologies of Chinmedomics were adopted to successfully establish the analysis model of “KYDS markers of constituents migrating to blood under effective dose-pharmacodynamic basis of NSOL in vivo”, indicated that scandoside, monotropeine and gallic acid in NSOL improved various metabolic pathways (hormone synthesis pathways, hormone synthesis and release pathway in tyrosine metabolism, etc.) and integrally regulated the metabolic profilings. It was demonstrated that the treatment of NSOL for KYDS featuring the corresponding between“formula” and “syndrome” in traditional Chinese medicine and reflecting its multi-path and multi-target and overall regulation. This study laid a foundation for the discovery of new medications based on their efficacy in clinic.

Chinmedomics, kidney-yang deficiency syndrome, Nanshi oral liquid, metabolic biomarker, pharmacodynamic basis

10.11842/wst.2016.10.007

R285.5

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-09-19

修回日期：2016-10-12

＊ 國家自然科學(xué)基金委重點項目（81430093）：中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的系統(tǒng)分析方法學(xué)——中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究，負(fù)責(zé)人：王喜軍；科學(xué)技術(shù)部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2015ZX09101043-011）：中藥經(jīng)典名方整合作用機制關(guān)鍵技術(shù)研究，負(fù)責(zé)人：王喜軍；黑龍江省普通本科高等學(xué)校青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃（UNPYSCT-2015118）：基于方證代謝組學(xué)的金匱腎氣丸治療腎陽虛證的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機理研究，負(fù)責(zé)人：張愛華。

＊＊ 通訊作者：王喜軍，本刊編委，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究。