基于中醫(yī)方證代謝組學(xué)的開(kāi)心散干預(yù)老年癡呆癥大鼠的效應(yīng)物質(zhì)動(dòng)態(tài)分析＊

初 航，盧盛文，孔 玲，韓 瑩，韓金偉，劉志東，張愛(ài)華，王喜軍

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心/國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥血清藥物化學(xué)重點(diǎn)研究室/中美中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)合作中心 哈爾濱 150040）

基于中醫(yī)方證代謝組學(xué)的開(kāi)心散干預(yù)老年癡呆癥大鼠的效應(yīng)物質(zhì)動(dòng)態(tài)分析＊

初 航，盧盛文，孔 玲，韓 瑩，韓金偉，劉志東，張愛(ài)華，王喜軍＊＊

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心/國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥血清藥物化學(xué)重點(diǎn)研究室/中美中醫(yī)方證代謝組學(xué)技術(shù)合作中心 哈爾濱 150040）

目的：本研究在開(kāi)心散干預(yù)氯化鋁聯(lián)合D-半乳糖誘導(dǎo)老年癡呆癥大鼠模型有效性的基礎(chǔ)上，揭示開(kāi)心散對(duì)老年癡呆癥（AD）不同階段干預(yù)作用的代謝物靶點(diǎn)，構(gòu)建開(kāi)心散體內(nèi)成分與內(nèi)源性生物標(biāo)記物的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，分析開(kāi)心散對(duì)AD發(fā)展過(guò)程干預(yù)作用的效應(yīng)物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化。方法：利用行為學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)模型復(fù)制進(jìn)程以及開(kāi)心散的干預(yù)作用；運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)和方法分析開(kāi)心散對(duì)AD大鼠模型不同階段干預(yù)作用的靶點(diǎn)；應(yīng)用UPLC-MS技術(shù)和MSE質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集模式，分別對(duì)開(kāi)心散體外化學(xué)成分和口服給藥后的血中移行成分進(jìn)行表征及鑒定；利用PCMS手段，構(gòu)建復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與內(nèi)源性生物標(biāo)記物的數(shù)理模型，發(fā)掘開(kāi)心散防治老年癡呆癥不同階段的效應(yīng)物質(zhì)。結(jié)果：給予AD大鼠開(kāi)心散溶液治療后，模型大鼠的認(rèn)知功能得到改善，其病理學(xué)進(jìn)程得以延緩。代謝組學(xué)研究表明，開(kāi)心散對(duì)AD模型不同階段標(biāo)記物的異常表達(dá)起到恢復(fù)作用，體現(xiàn)了開(kāi)心散干預(yù)老年癡呆癥多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)。結(jié)論：基于中醫(yī)方證代謝組學(xué)方法為開(kāi)心散減緩AD進(jìn)程研究提供了新的思路。

老年癡呆癥 開(kāi)心散 代謝組學(xué) 中醫(yī)方證代謝組學(xué)

“辨證論治”是中醫(yī)學(xué)的基本特點(diǎn)，“方證相應(yīng)”是中醫(yī)理論的精髓。中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是指中藥中含有的能夠表達(dá)藥物臨床療效的化學(xué)成分總稱[1]。由于中藥的化學(xué)成分復(fù)雜，而有單味中藥配伍的中藥復(fù)方（方劑）不同成分之間相互作用以及產(chǎn)生的變化更為復(fù)雜，想要揭示中藥復(fù)方中真正起效的成分成為了一道難題，而中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究成為了中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵性問(wèn)題[2]。中醫(yī)方證代謝組學(xué)是將中藥血清藥物化學(xué)和代謝組學(xué)有機(jī)結(jié)合，在解決證候生物標(biāo)記物的基礎(chǔ)上，建立方劑藥效生物評(píng)價(jià)體系，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)與臨床療效直接相關(guān)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，闡明作用機(jī)制的方法學(xué)體系[3]。

老年癡呆癥（Alzheimer's Disease，AD）又稱阿爾茲海默病，是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。老年癡呆癥不僅嚴(yán)重影響人類(lèi)的身體健康和生活質(zhì)量，同時(shí)也給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。AD是一種復(fù)雜性疾病，其發(fā)生發(fā)展是一種連續(xù)的病理生理過(guò)程，由于其發(fā)病的不可逆性，AD基礎(chǔ)和臨床研究的時(shí)間點(diǎn)應(yīng)該前移[4]。開(kāi)心散是中醫(yī)益智、安神定驚、治療健忘的基本方，是治療癡呆的經(jīng)典方劑?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果證明，開(kāi)心散四味藥材均能在不同程度上起到益智的作用，開(kāi)心散對(duì)老年癡呆癥的治療有多靶點(diǎn)、多方位的優(yōu)勢(shì)，但開(kāi)心散治療老年癡呆癥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制仍然不清楚。因此，有必要對(duì)開(kāi)心散干預(yù)老年癡呆癥的機(jī)制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行評(píng)價(jià)及探討。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

生曬參Panax ginseng C. A. Mey.、茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf、遠(yuǎn)志Polygala tenuifolia Willd.、石菖蒲Acorus tatarinowii Schott.均購(gòu)于北京同仁堂藥店。

無(wú)水氯化鋁（分析級(jí)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），D-半乳糖（合肥Biosharp生物科技公司），戊巴比妥鈉粉末（上海化學(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站），蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司），乙腈（色譜級(jí)，德國(guó)Merck公司），甲醇（色譜級(jí)，美國(guó)Fisher公司），甲酸（色譜級(jí)，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），亮氨酸腦啡肽（美國(guó)Sigma公司）；實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析級(jí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量260±20 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：P00102004。室溫飼養(yǎng)，動(dòng)物自由攝食飲水。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

Morris水迷宮（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）；AcquityTMUPLC液相色譜儀（四元梯度泵-在線真空脫氣機(jī)-自動(dòng)進(jìn)樣器-二極管陣列檢測(cè)器-柱溫箱）；SynaptTMG2-Si 質(zhì)譜分析系統(tǒng)（高分辨四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀）。

1.4 供試品制備

1.4.1 開(kāi)心散凍干粉的制備

按原方比例，即人參：茯苓：遠(yuǎn)志：石菖蒲=3：3：2：2，稱取藥材粗粉，混勻。用6倍量70%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h，合并濾液，濃縮，并用冷凍干燥法干燥，得疏松粉末[5]。

1.4.2 開(kāi)心散灌胃溶液的制備

取開(kāi)心散凍干粉溶于蒸餾水中，配制成生藥濃度為0.54 g·mL-1的開(kāi)心散灌胃溶液，以10 mL·kg-1的劑量灌胃治療。

1.4.3 開(kāi)心散體外成分分析樣品制備

取開(kāi)心散凍干粉適量，加入10倍量50%甲醇混勻，超聲10 min，在13 000 rpm、4℃條件下離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm的微孔濾膜。

1.4.4 開(kāi)心散體內(nèi)成分分析樣品制備

取空白血清和含藥血清各2 mL，緩慢通過(guò)已活化的Waters OASIS固相萃取柱，用甲醇3 mL洗脫，收集洗脫液氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)?00 μL甲醇定容，混懸震蕩60 s，在13 000 rpm、4℃條件下離心10 min，取上清液。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組及設(shè)計(jì)

將Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組10只，AD模型組1-4組各10只，開(kāi)心散干預(yù)（KXS）組1-4組各10只。AD模型組以及KXS組大鼠每日灌胃給予氯化鋁（AlCl3）28 mg·kg-1。同時(shí)腹腔注射D-半乳糖（D-galactose，D-gal），每日注射劑量為63 mg·kg-1，共90天。空白對(duì)照組每天給予等量生理鹽水。

空白對(duì)照組于實(shí)驗(yàn)第85天，AD模型1-4組、KXS組1-4組分別于實(shí)驗(yàn)第10、40、55、85天，進(jìn)行6天的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，并于行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行尿液、血液的采集。

2.2 Morris水迷宮行為學(xué)評(píng)價(jià)

2.2.1 定位航行實(shí)驗(yàn)

定位航行實(shí)驗(yàn)用于測(cè)量大鼠的學(xué)習(xí)能力，實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5天，從第1天起，每天于同一時(shí)間訓(xùn)練大鼠。首先將池水用奶粉攪拌成奶白色以便掩蓋平臺(tái)，訓(xùn)練時(shí)水面高出平臺(tái)2 cm；利用軟件將水迷宮分成4個(gè)象限，每天分別在四個(gè)象限的固定位置大鼠面向池壁放入水中，記錄其尋找并爬上平臺(tái)所需的時(shí)間（潛伏期），每次學(xué)習(xí)時(shí)限60 s；若大鼠在60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，須利用標(biāo)桿將其引至平臺(tái)，此時(shí)潛伏期記為60 s。

2.2.2 空間搜索實(shí)驗(yàn)

空間探索實(shí)驗(yàn)用于評(píng)價(jià)大鼠學(xué)會(huì)尋找平臺(tái)后對(duì)平臺(tái)空間位置記憶的能力，于定位航行實(shí)驗(yàn)后，在第6天撤除水下平臺(tái)，于4個(gè)象限內(nèi)隨機(jī)選取一入水點(diǎn)，記錄其在60 s內(nèi)跨過(guò)原平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)。

2.3 生物樣本采集及處理方法

尿液樣品于4℃，13 000 rpm離心15 min后取上層清液，蒸餾水稀釋一倍，振蕩，過(guò)0.22 μm的微孔濾膜。大鼠3%戊巴比妥鈉麻醉，取血清備用。

2.4 尿液代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集

色譜分析條件：色譜柱：ACQUITY UPLCTMHSST3 column（100 mm×2.1 mm i.d.，1.8 μm）；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸乙腈，B為0.1%甲酸水；柱溫預(yù)設(shè)：45℃；流速：0.4 mL·min-1；進(jìn)樣體積：2 μL；梯度洗脫程序?yàn)椋?-2.5 min，1%-11% A；2.5-4.5 min，11%-21% A；4.5-7.0 min，21%-40% A；7.0-8.5 min，40%-99% A；10.5-10.6 min，99%-1% A；再平衡1.5 min后采集下一樣品。質(zhì)譜分析條件：電噴霧離子源（ESI）；正負(fù)離子掃描模式：脫溶劑氣流量：800 L·h-1；脫溶劑氣溫度：450℃；離子源溫度：110℃；錐孔電壓：20.0 V；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；鎖定質(zhì)量溶液：采用美國(guó)Waters公司Lockspray校正系統(tǒng)進(jìn)行在線質(zhì)量校正，亮氨酸-腦啡肽（Leueine-Enkephalin，[M+H]+=556.277 1，[M-H]-=554.277 1），溶液濃度為1 ng·mL-1，流速為5 μL·min-1；質(zhì)量掃描范圍：m/z 50-1 000 Da，掃描時(shí)間0.2 s；工作站：MassLynx V4.1工作站。

2.5 開(kāi)心散體內(nèi)外化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)采集

色譜分析方法：色譜柱：ACQUITY UPLCTMC18 column（100 mm×2.1 mm i.d.，1.7 μm）；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸乙腈，B為0.1%甲酸水；柱溫預(yù)設(shè)：45℃；流速：0.4 mL·min-1；進(jìn)樣體積：3 μL。梯度洗脫程序?yàn)椋?-1 min，2%-20% A；1-4 min，20%-21% A；4-6.5 min，21%-30% A，；6.5-9.5 min，30%-35% A；9.5-14 min，35%-50% A；14-16 min，50%-52% A；16-16.5 min，52%-82% A；16.5-19min，82%-83% A；19-19.5 min，83%-100% A；19.5-20.0 min，2% A。質(zhì)譜分析方法：毛細(xì)管電壓正離子掃描為3.0 kV，負(fù)離子掃描為2.8 kV，脫溶劑溫度為350 ℃，采樣錐孔電壓為30 V，離子源溫度為110 ℃，脫溶劑氣流量為600 L·h-1。質(zhì)譜數(shù)據(jù)在全掃描方式下用MSE模式進(jìn)行采集，低碰撞能為6 V，高碰撞能為20-40 V，質(zhì)量掃描范圍為50-1 500 Da，掃描時(shí)間為0.2 s。

2.6 數(shù)據(jù)處理

2.6.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2.6.2 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理

將得到的尿液UPLC-MS數(shù)據(jù)輸入Progenesis QI 軟件進(jìn)行化合物鑒定和多變量統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)各組不同時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非監(jiān)督型主成分（Principal Components Analysis，PCA）分析。同時(shí)對(duì)各組所獲得信息數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較模型組和空白組各離子含量差別是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，篩選出這些差異離子（P＜0.05）作為潛在生物標(biāo)記物集合。對(duì)潛在的標(biāo)記物，將得到的保留時(shí)間和質(zhì)核比數(shù)據(jù)，結(jié)合軟件中化合物鑒定功能與代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)（HMDB）搜索，對(duì)這些差異離子進(jìn)行初步確認(rèn)。再通過(guò)UPLC-MS/MS技術(shù)對(duì)潛在的離子進(jìn)行二級(jí)數(shù)據(jù)掃描，通過(guò)碎片信息及其可能的裂解方式進(jìn)行匹配，鑒定或表征各潛在生物標(biāo)記物。

2.6.3 開(kāi)心散體內(nèi)外化學(xué)成分分析

運(yùn)用UNIFI天然產(chǎn)物整體解決方案，以UPLCMS采集的MSE數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，將高低碰撞能下獲得的準(zhǔn)分子離子和碎片離子與UNIFI中藥數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配，對(duì)藥材來(lái)源及入血的開(kāi)心散原型成分進(jìn)行快速解析。并對(duì)其入血后的代謝成分進(jìn)行表征，該軟件通過(guò)質(zhì)量短缺過(guò)濾技術(shù)（MDF）結(jié)合MassFragment TM模塊智能地進(jìn)行母藥和代謝產(chǎn)物的二級(jí)碎片解析，進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)，并給出詳細(xì)的化合物可能的生物代謝轉(zhuǎn)化及化學(xué)元素組成。

2.6.4 相關(guān)性分析

運(yùn)用代謝標(biāo)記物與血清化學(xué)成分相關(guān)性分析方法（Plotting of Correlation Between Marker Metabolites and Serum Constituents，PCMS）對(duì)血清中外源性開(kāi)心散成分與內(nèi)源性標(biāo)記物兩組變量關(guān)聯(lián)度分析，提取與內(nèi)源性標(biāo)記物高度關(guān)聯(lián)的開(kāi)心散入血成分作為防治AD的潛在效應(yīng)物質(zhì)。將開(kāi)心散入血成分群與生物標(biāo)記物含量變化矩陣導(dǎo)入PCMS軟件。實(shí)驗(yàn)設(shè)置0.7≤|r|≤0.75為高度正（負(fù)）相關(guān)，0.75≤|r|≤1為極度正（負(fù)）相關(guān)；入血成分與生物標(biāo)記物相關(guān)的個(gè)數(shù)的達(dá)到6個(gè)及以上，認(rèn)為該入血成分為潛在效應(yīng)物質(zhì)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 Morris水迷宮行為學(xué)評(píng)價(jià)

3.1.1 定位航行實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)

定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在訓(xùn)練第5天，與空白對(duì)照組大鼠相比，AD模型第4組大鼠的逃避潛伏期時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）。與模型組第4組大鼠相比，KXS第 4組大鼠逃避潛伏期時(shí)間顯著縮短（P＜0.05）。具體結(jié)果見(jiàn)圖1。

3.1.2 空間搜索實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)

空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組大鼠相比，模型第4組大鼠經(jīng)過(guò)有效區(qū)域次數(shù)有顯著差異（P＜0.05）。與模型第4組大鼠相比，KXS第4組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加（P＜0.01）。具體結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 開(kāi)心散對(duì)AD模型不同階段大鼠Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)的影響

圖2 開(kāi)心散對(duì)AD模型大鼠Morris水迷宮空間搜索實(shí)驗(yàn)的影響

3.2 代謝組學(xué)結(jié)果

圖3 空白組、AD模型組以及開(kāi)心散給藥組大鼠尿液PCA分析后的Score plot圖

對(duì)各組尿液樣本數(shù)據(jù)分別進(jìn)行PCA分析，發(fā)現(xiàn)在復(fù)制模型的進(jìn)程中，AD模型組數(shù)據(jù)輪廓開(kāi)始逐漸遠(yuǎn)離空白組，而開(kāi)心散給藥組有向正常對(duì)照組回調(diào)的趨勢(shì)。各階段PCA score-plot圖見(jiàn)圖3。對(duì)于所得化合物通過(guò)搜索代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)（HMDB），對(duì)差異離子（P＜0.05）進(jìn)行初步確認(rèn)。結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜碎片信息，鑒定或表征各潛在生物標(biāo)記物。根據(jù)以上步驟，AD造模過(guò)程第15天尿液中共鑒定出35個(gè)潛在的生物標(biāo)記物（表1），開(kāi)心散對(duì)其中31個(gè)具有調(diào)節(jié)作用；AD造模過(guò)程第45天尿液中共鑒定出48個(gè)潛在的生物標(biāo)記物（表2），開(kāi)心散對(duì)其中34個(gè)具有調(diào)節(jié)作用；AD造模過(guò)程第60天尿液中共鑒定出40個(gè)潛在的生物標(biāo)記物（表3），開(kāi)心散對(duì)其中29個(gè)具有調(diào)節(jié)作用；AD造模過(guò)程第90天尿液中共鑒定出 42個(gè)潛在的生物標(biāo)記物（表4），開(kāi)心散對(duì)其中22個(gè)具有調(diào)節(jié)作用。

續(xù)圖3 空白組、AD模型組以及開(kāi)心散給藥組大鼠尿液PCA分析后的Score plot圖

3.3 開(kāi)心散血中移形成分分析

利用UNIFI軟件結(jié)合中藥數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)開(kāi)心入血的原型成分以及藥物代謝產(chǎn)物。確認(rèn)了AD大鼠口服開(kāi)心散后血中移行46個(gè)成分原型成分（表5），其中14個(gè)來(lái)源于人參的人參皂苷類(lèi)成分，13個(gè)來(lái)源于茯苓的三萜酸類(lèi)成分，18個(gè)來(lái)源于遠(yuǎn)志的寡糖酯類(lèi)和呫噸酮類(lèi)成分，1個(gè)來(lái)源于石菖蒲。以及20個(gè)代謝產(chǎn)物（表6），其中1個(gè)來(lái)源于人參，14個(gè)來(lái)源于遠(yuǎn)志，5個(gè)來(lái)源于茯苓。

3.4 潛在效應(yīng)物質(zhì)分析

采用PCMS分析方法計(jì)算66個(gè)血中移形成分與AD發(fā)展不同階段效應(yīng)標(biāo)記物的相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)Heatmap圖（圖4）。開(kāi)心散干預(yù)的尿液生物標(biāo)記物與體內(nèi)顯效成分關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果顯示：第15天（圖4A）開(kāi)心散的血中移行成分中，18個(gè)為高度相關(guān)成分，其中，4個(gè)來(lái)源于茯苓（包括茯苓新酸 C，25-甲氧基茯苓新酸，去氫齒孔酮酸，3β,16α-二羥基羊毛甾-7,9(11),24-三烯-21-酸），3個(gè)來(lái)源于人參（包括丙二酰基人參皂苷Rb1，人參皂苷Ra2，丙二?；藚⒃碥誖d），11個(gè)來(lái)源于遠(yuǎn)志（包括乙酸苯酯，3-羥基-2,8-二甲氧基訕酮，6-羥基-1,2,3,7-四甲氧基訕酮，遠(yuǎn)志訕酮Ⅰ，1,7-二甲氧基-2,3-亞甲二氧基訕酮，6,8-二羥基-1,2,3-三甲氧基訕酮，1,2,3,7-四甲氧基訕酮，西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6，西伯利亞遠(yuǎn)志咕噸酮 A/B，遠(yuǎn)志訕酮Ⅲ葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物，去乙基遠(yuǎn)志訕酮 Ⅰ 葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物）；第45天（圖4B）的血中移行成分中，22個(gè)為高度相關(guān)成分。其中，7個(gè)來(lái)源于茯苓（包括茯苓新酸AM，茯苓新酸F，25-甲氧基茯苓新酸，去乙基茯苓新酸E代謝產(chǎn)物，去乙基茯苓新酸C代謝產(chǎn)物，去乙基土莫酸葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物，茯苓新酸F脫水代謝產(chǎn)物），9個(gè)來(lái)源于人參（包括人參皂苷Rb2，人參皂苷Rb1，人參皂苷Ra2，丙二酰基人參皂苷Rd，三七皂苷R1，20-O-葡萄糖基人參皂苷Rf，人參皂苷Rf，人參皂苷Ro，人參皂苷Rb1脫水代謝產(chǎn)物），6個(gè)來(lái)源于遠(yuǎn)志（包括乙酸苯酯，6-羥基-1,2,3,7-四甲氧基訕酮，6,8-二羥基-1,2,3-三甲氧基訕酮，E-3,4,5-三甲氧基肉桂酸脫水代謝產(chǎn)物，遠(yuǎn)志苷D脫水代謝產(chǎn)物，去乙基遠(yuǎn)志訕酮Ⅱ葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物）；第60天（圖4C）的

血中移行成分中，27個(gè)為高度相關(guān)成分，其中，6個(gè)來(lái)源于茯苓（茯苓新酸G、25-羥基茯苓新酸C、茯苓新酸B、茯苓新酸D脫水代謝產(chǎn)物、25-甲氧基茯苓新酸、去乙基茯苓新酸C代謝產(chǎn)物），5個(gè)來(lái)源于人參（丙二?；藚⒃碥誖c、人參皂苷Ra2，丙二?；藚⒃碥誖d，三七皂苷R1，人參皂苷Rb1脫水代謝產(chǎn)物），16個(gè)來(lái)源于遠(yuǎn)志（1,7-二甲氧基-2,3-亞甲二氧基訕酮、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A3、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A1、西伯利亞遠(yuǎn)志咕噸酮A/B、遠(yuǎn)志訕酮Ⅲ、α-D-（6-O-芥子酰基）-吡喃葡萄糖基（1→2）-β-D-（3-O-芥子?；?呋喃果糖、遠(yuǎn)志苷A、遠(yuǎn)志次皂苷、去乙基E-3,4,5-三甲氧基肉桂酸、去乙基E-3,4,5-三甲氧基肉桂酸葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物、遠(yuǎn)志訕酮Ⅲ葡萄糖醛酸化產(chǎn)物、遠(yuǎn)志訕酮Ⅰ葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物、去乙基遠(yuǎn)志訕酮Ⅱ葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物、6-羥基-1,2,3,7-四甲氧基訕酮葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物）；第90天（圖4D）的血中移行成分中，31個(gè)為高度相關(guān)成分。其中，10個(gè)來(lái)源于茯苓（包括茯苓新酸C、茯苓新酸B、16-脫氧茯苓新酸B、去氫土莫酸、土莫酸、25-甲氧基茯苓新酸、茯苓新酸D脫水代謝產(chǎn)物、去乙基茯苓新酸C，去乙基土莫酸葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物、去乙基茯苓新酸E），9個(gè)來(lái)源于人參（包括人參皂苷Rf，丙二?；藚⒃碥誖b1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Ra1、人參皂苷Ra2、三七皂苷R1、丙二酰基人參皂苷Rc），12個(gè)來(lái)源于遠(yuǎn)志（包括乙酸苯酯、遠(yuǎn)志訕酮Ⅰ、去乙基遠(yuǎn)志訕酮Ⅰ葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物、6,8-二羥基-1,2,3-三甲氧基訕酮葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物、去乙基遠(yuǎn)志苷D葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物、6-羥基-1,2,3,7-四甲氧基訕酮葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物、遠(yuǎn)志訕酮Ⅰ葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物、去乙基E-3,4,5-三甲氧基肉桂酸葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物、去乙基遠(yuǎn)志訕酮Ⅱ葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物、遠(yuǎn)志訕酮Ⅱ葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物、E-3,4,5-三甲氧基肉桂酸葡萄糖醛酸化的代謝產(chǎn)物、1,6,7-三羥基-2,3-二甲氧基訕酮葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物、去乙基E-3,4,5-三甲氧基肉桂酸）。以上表明在伴隨給藥劑量的增加，相關(guān)性成分增加，高度相關(guān)性成分增加。

表1 開(kāi)心散干預(yù)AD模型復(fù)制第15天大鼠尿液潛在生物標(biāo)志物回調(diào)趨勢(shì)表

表2 開(kāi)心散干預(yù)AD模型復(fù)制第45天大鼠尿液潛在生物標(biāo)志物回調(diào)趨勢(shì)表

表3 開(kāi)心散干預(yù)AD模型復(fù)制第60天大鼠尿液潛在生物標(biāo)志物回調(diào)趨勢(shì)表

表4 開(kāi)心散干預(yù)AD模型復(fù)制第90天大鼠尿液潛在生物標(biāo)志物回調(diào)趨勢(shì)表

表5 AD模型大鼠口服開(kāi)心散后血中移行成分（原型）

續(xù)表5

表6 AD模型大鼠口服開(kāi)心散后血中代謝產(chǎn)物

續(xù)表6

4 討論

在開(kāi)心散干預(yù)AD大鼠模型復(fù)制過(guò)程中，代謝物的異常表達(dá)得到回調(diào)，代謝通路的紊亂得到改善。在代謝層面驗(yàn)證了開(kāi)心散對(duì)AD模型疾病發(fā)展的的減緩作用[6]。現(xiàn)代藥理研究結(jié)果證明，開(kāi)心散四味藥材均能在不同程度上起到益智的作用，從而使開(kāi)心散起到益智、抗氧化、抗自由基損傷的效果。高度關(guān)聯(lián)的入血成分中，來(lái)源于君藥人參的人參皂苷原型成分最多，推測(cè)人參皂苷在體內(nèi)直接發(fā)揮其作用。人參皂苷Rb1對(duì)AD動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)記憶功能下降有明顯的改善[7]，并且對(duì)大腦皮層神經(jīng)元也有保護(hù)作用[8-10]。活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可釋放大量的神經(jīng)毒素因子，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞功能損傷甚至凋亡，而引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致AD。研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb2能夠降低小膠質(zhì)細(xì)胞活化對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元的損傷，保護(hù)神經(jīng)元[11,12]。三七皂苷R1對(duì)心血管系統(tǒng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)等均具有保護(hù)作用，還有抗炎及抗癌等作用[13]。而高度相關(guān)的血中藥物代謝產(chǎn)物中，多為遠(yuǎn)志中化學(xué)成分的代謝產(chǎn)物，推測(cè)遠(yuǎn)志中的成分多通過(guò)機(jī)體代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)生藥效。遠(yuǎn)志自古以來(lái)就是治療癡呆的常用藥物。現(xiàn)代研究證明，遠(yuǎn)志中的活性成分，如皂苷類(lèi)、寡糖酯類(lèi)、山酮類(lèi)化合物等可以通過(guò)改善膽堿能系統(tǒng)功能[14-16]、抗氧化清除自由基[17,18]、保護(hù)神經(jīng)元[19,20]等不同途徑對(duì)AD產(chǎn)生治療作用[21]。

圖4 AD模型大鼠尿液生物標(biāo)記物與血中移行成分相對(duì)峰面積關(guān)聯(lián)性分析Heatmap圖

續(xù)圖4 AD模型大鼠尿液生物標(biāo)記物與血中移行成分相對(duì)峰面積關(guān)聯(lián)性分析Heatmap圖

綜上所述，本研究利用UPLC-MS技術(shù)，結(jié)合中藥血清藥物化學(xué)方法和代謝組學(xué)的研究方法，分析表征開(kāi)心散體內(nèi)外成分，以及給藥后AD大鼠模型的行為學(xué)和代謝組學(xué)藥效評(píng)價(jià)，明確在干預(yù)AD模型大鼠有效性的前題下，分析發(fā)現(xiàn)入血的成分中多與造模引起的內(nèi)源性表達(dá)異常的脂類(lèi)標(biāo)記物表現(xiàn)出高度的關(guān)聯(lián)，推測(cè)開(kāi)心散可能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激從而改善 AD模型的疾病狀態(tài)，延緩AD的發(fā)展進(jìn)程。本研究的成功實(shí)施，為從開(kāi)心散體內(nèi)成分中篩選用于AD早期多靶點(diǎn)干預(yù)的有效成分組合奠定基礎(chǔ)，而中醫(yī)方證代謝組學(xué)是解決中藥有效性等相關(guān)科學(xué)問(wèn)題的新策略。

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Dynamic Analysis of the Effects of Pharmacodynamic Constituents of Kai Xin San on Alzheimer's Disease Rats Based on Chinmedomics

Chu Hang, Lu Shengwen, Kong Ling, Han Ying, Han Jinwei, Liu Zhidong, Zhang Aihua, Wang Xijun
(Research Center of Chinmedomics-State Administration of TCM-Laboratory of Metabolomics, National TCM Key Laboratory of Serum Pharmacochemistry, Sino-US Chinmedomics Technology Cooperation Center, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

The present study aimed at elucidating the therapeutic effects of Kai Xin San (KXS) on AD rat models induced by D-gal and AlCl3, and investigating its metabolic products of KXS and their functions using metabolomic technique by establishing the network relations between chemicals of KXS and endogenous biomarkers selected by metabolomics with the analyze of the dynamic changes of pharmacodynamic basis of KXS preventing AD. The typical behavior tests were adopted to evaluate the state of AD in model rats and the therapeutic effects of KXS. Metabolomic technologies were used to reveal the potential biomarkers of AD and the target spots after the administration of KXS. Serum pharmacochemistry of TCM was herein introduced to explore the constituents absorbed into the blood after lavage administration of KXS. The constituents, targets of the influenced metabolic pathways, can be determined as the pharmacodynamic basis at different pathogenic stages of AD. The effect of pharmacodynamic basis was verified, while multi-component and multi-target synergistic mechanism behind prevential and therapeutic effects of KXS in AD rats was elucidated in this study. AD rat models induced by AlCl3and D-gal received the intragastric administrated of KXS. As a result, the Morris water maze test showed that AlCl3and D-gal-induced learning disability and memory loss of the AD rats were mitigated within the administration of KXS. The metabonomics studies showed that the abnormal expressions of biomarkers of the rats at different stages of AD were regulated and restored featuring the multi-target and multi-path of the administration of KXS. In conclusion, Chinmedomics is an novel discipline for addressing the problem in the effects of Chinese materia medica and other related scientific issues.

Alzheimer's disease, Kai Xin San, metabonomics, Chinmedomics, biomarker

10.11842/wst.2016.10.006

R285

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-09-19

修回日期：2016-10-19

＊ 國(guó)家自然科學(xué)基金委重點(diǎn)項(xiàng)目（81430093）：中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的系統(tǒng)分析方法學(xué)--中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究，負(fù)責(zé)人：王喜軍；國(guó)家自然科學(xué)基金委青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81302905）：基于藥物代謝組學(xué)的開(kāi)心散防治老年癡呆癥的物質(zhì)基礎(chǔ)及機(jī)制研究，負(fù)責(zé)人：張愛(ài)華；黑龍江省科技廳自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（H2015038）：基于代謝組學(xué)策略研究開(kāi)心散治療AD的藥效物質(zhì)和作用機(jī)理，負(fù)責(zé)人：張愛(ài)華。

＊＊ 通訊作者：王喜軍，本刊編委，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥血清藥物化學(xué)及中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究。