沉香DNA提取方法及種質(zhì)資源聚類分析研究＊

鐘志敏，吳文如＊＊，賴小平＊＊，張桂芳，黃 松

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院 廣州 510006；2. 東莞廣州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院 東莞 523808）

Zhong Zhimin1, Wu Wenru1, Lai Xiaoping1, Zhang Guifang1, Huang Song2

(1.School of Chinese Materia Medica, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China;

2. Dongguan Mathematical Engineering Academy of Chinese Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Dongguan 523808, China)

沉香DNA提取方法及種質(zhì)資源聚類分析研究＊

鐘志敏1，吳文如1＊＊，賴小平1＊＊，張桂芳1，黃 松2

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院 廣州 510006；2. 東莞廣州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院 東莞 523808）

目的：分別建立適用于提取不同類型沉香樣品（葉片、干燥枝條、藥材）DNA的方法，通過ITS2序列對沉香藥材進行種質(zhì)資源聚類分析。方法：根據(jù)沉香葉片、干燥枝條、藥材的組織差異，分別采用試劑盒法和優(yōu)化的CTAB法提取DNA；利用紫外分光光度儀、瓊脂糖凝膠電泳、PCR擴增及ITS2序列測定來檢測DNA的純度、濃度及可用性，以比較不同DNA提取方法的效率；將樣品測序結(jié)果與從GenBank下載的沉香屬（Aquilaria spp.）、擬沉香屬（Gyrinops spp.），及沉香藥材常見混偽品的ITS2序列，進行聚類分析。結(jié)果：優(yōu)化的CTAB法提取得到的DNA純度比試劑盒法稍低，但濃度更高。兩種方法所提沉香總DNA 進行ITS2序列的PCR擴增成功率和測序成功率均為100%。ITS2序列能準確鑒別出4個沉香混偽品和2個擬沉香物種，且15個沉香樣品ITS2序列與Aquilaria subintegra（泰國）、Aquilaria sinensis（中國）、Aquilaria crassna（柬埔寨、泰國）三個沉香物種均100%相似。結(jié)論：本研究中的兩種DNA提取方法均可用于沉香DNA條形碼研究；優(yōu)化CTAB法比試劑盒法更適用于藥材DNA 的提取，該方法為有關(guān)中藥材DNA的提取提供了參考；ITS2序列可為沉香種質(zhì)資源的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析提供必要的實驗依據(jù)。

CTAB法 試劑盒法 DNA條形碼 ITS2 聚類分析

據(jù)2015版《中國藥典》記載，沉香（Aquilariae Lignum Resinatum）是瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg含有樹脂的木材，其味辛、苦，性微溫，具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘等功效。沉香是中國、日本、印度及其他東南亞國家的傳統(tǒng)名貴藥材和天然香料，其在藥用、精油、香料等方面的市場需求量巨大，原材料遠銷中東、日韓、歐美等國家和地區(qū)。沉香物種來源豐富，從南亞次大陸的東北部到印度尼西亞群島、巴布年亞新幾內(nèi)亞群島，分布著至少20余種的沉香屬植物，均可產(chǎn)沉香[1-3]。中國沉香藥材可分為國產(chǎn)和進口兩類，國產(chǎn)沉香唯一法定基源為瑞香科沉香屬植物白木香[4]；進口沉香來源較多，其中以奇楠沉香最為貴重，但其品種來源不明[5]。由于不同品種、等級、產(chǎn)區(qū)的沉香價格差異極大，市場上以劣充好或以假亂真的現(xiàn)象十分嚴重，按傳統(tǒng)的鑒別檢驗標準，難以判斷沉香藥材的基源植物和真?zhèn)蝺?yōu)劣，故沉香藥材的質(zhì)量評價難度較大。

為更好地保護和利用沉香屬植物資源及其物種的多樣性，國內(nèi)外研究學(xué)者在沉香形態(tài)學(xué)表型多樣性[6，7]、細胞水平染色體多樣性[7-9]、生化水平等位酶多樣性[10]等方面開展了大量研究。近年來，DNA條形碼技術(shù)被逐漸應(yīng)用到沉香的物種鑒定及遺傳進化分析中[11-14]，并取得了良好效果。高曉霞[13]、劉少烽[14]、邵敏[15]等利用改良CTAB法或PTB法從不同來源的沉香中成功提取到DNA。然而，沉香藥材種類繁多，一些樹脂含量高、經(jīng)過高溫干燥處理或者年代久遠的沉香藥材DNA的提取效果仍然很不理想。

本研究根據(jù)沉香葉片、干燥枝條、商品藥材組織形式及所含成分的種類和含量的不同，分別采用試劑盒法和優(yōu)化CTAB法提取三類沉香樣品（葉片、干燥枝條、藥材），以期建立適于提取不同類型沉香樣品DNA的最佳方法，以滿足其DNA條形碼研究的需要；并將樣品測序結(jié)果與GenBank中已有沉香屬物種、擬沉香屬物種、及沉香藥材常見混偽品的ITS2序列進行比對分析和種質(zhì)資源聚類分析，鑒定本實驗沉香樣品的種質(zhì)來源，并嘗試從分子水平上鑒定沉香藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

沉香葉片和干燥枝條采自廣州中醫(yī)藥大學(xué)藥圃時珍山和藥王山，經(jīng)中藥鑒定學(xué)教研室吳文如副教授鑒定其原植物為瑞香科白木香Aquilaria sinensis（Lour.）Glig，用70%乙醇消毒和無菌水沖洗晾干后，-20℃保存；國產(chǎn)和進口沉香藥材分別從國內(nèi)外藥材市場購買，硅膠干燥器中保存（表1）。

表1 供試沉香材料

1.2 主要儀器

BSA224S電子分析天平（德國ViBRA 公司），Water Bath SY-1210恒溫水浴鍋（美國Crystal 公司），IKA?VORTEX GENIUS 3渦旋混勻機（美國Barnstead公司），BCD-260WDBD超低溫冰箱（丹麥Arctiko 公司），5424DQ261173臺式高速離心機（德國Eppendorf 公司），Centrifuge 5424R臺式冷凍高速離心機（德國Eppendorf 公司），Power PacTMBasic水平電泳儀（美國BioRad 公司），Thermo Cycler Block 5020PCR 擴增儀（美國BioRad 公司），NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計（美國Thermo 公司），Tanon 2500凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）。

1.3 主要試劑

Goldview 電泳染料（日本TaKaRa 公司，批號：D1210），PrimeSTAR?HS（Premix）（日本TaKaRa公司，批號：#A4101A），DNeasy Plant Mini Kit（德國Qiagen 公司，批號NO.145017297）、Plant Genomic DNA Kit（北京天根生化科技有限司，批號：#03825）、CTAB（美國Amresco 公司）；其余均為國產(chǎn)分析純試劑；引物由華大生物科技有限公司合成。

1.4 操作方法

1.4.1 采用優(yōu)化CTAB-A法提取沉香葉片基因組DNA

（1）稱取沉香新鮮葉片100 mg，加入0.01 g PVP-40，液氮研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)入2 mL離心管；（2）加入1 000 μL DNA洗滌液[100 mmol·L-1Tris-HCl（pH=8.0），0.14 mol·L-1NaCl，20 mmol·L-1EDTA]和1%的β-巰基乙醇，渦旋1 min，4℃，12 000 rpm·min-1，離心10 min，棄上清；（3）按步驟（2）重復(fù)操作兩次；（4）加入700 μL 65℃預(yù)熱的2%CTAB提取液[100 mmol·L-1Tris-HCl（pH=8.0），1.4 mol·L-1NaCl，20 mmol·L-1EDTA，3%CTAB（m/ v）]，渦旋1 min，65℃水浴30 min；（5）加入700 μL酚：氯仿：異戊醇（體積比為=25∶24∶1），渦旋30 s，室溫，12 000 rpm·min-1，離心10 min；（6）取上清，按步驟（5）重復(fù)一次；（7）取上清，加等體積氯仿：異戊醇（體積比為=24∶1），渦旋30 s，室溫，12 000 rpm·min-1，離心10 min；（8）取上清，加等體積預(yù)冷異丙醇，輕輕混勻，挑出絮狀物，用70%乙醇洗滌兩次，再用無水乙醇洗滌一次，室溫風干，50 μL TE溶解，-20℃保存。

1.4.2 采用優(yōu)化CTAB-B法提取沉香干燥枝條基因組DNA

（1）取干燥枝條50 mg，液氮研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)入2 mL離心管；（2）加入700 μL 65℃預(yù)熱的2%CTAB提取液[100 mmol·L-1Tris-HCl（pH=8.0），1.4 mol·L-1NaCl，20 mmol·L-1EDTA，3%CTAB（m/v）]，10 μL 1%PVP-40，2 μL 1%的β-巰基乙醇，渦旋1 min，65℃水浴60 min；（3）室溫，12 000 rpm·min-1，離心10 min，取上清，加入等體積的Tris-飽和酚，渦旋30 s，12 000 rpm·min-1，離心10 min；（4）取上清，加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇（體積比為=25∶24∶1），渦旋30 s，室溫，12 000 rpm·min-1，離心10 min；（5）取上清，加等體積氯仿∶異戊醇（體積比為=24∶1），渦旋30 s，室溫，12 000 rpm·min-1，離心10 min；（6）按步驟（5）重復(fù)操作一次；（7）加入1/10體積3 mol·L-1醋酸鈉和2.5倍體積無水乙醇，-20℃沉淀2 h；（8）室溫，12 000 rpm·min-1，離心10 min，用70%乙醇洗滌兩次，再用無水乙醇洗滌一次，室溫風干，50 μL TE溶解，-20℃保存。

1.4.3 采用優(yōu)化CTAB-C法提取沉香藥材基因組DNA

（1）取沉香藥材粉末50 mg，液氮研磨，加入0.01 g PVP-40，2 μL蛋白酶K（20 mg·mL-1），35 μL 20% SDS，2 μL 1M DTT和500 μL DNA洗滌液[100 mmol·L-1Tris-HCl（pH=8.0），0.14 mol·L-1NaCl，20 mmol·L-1EDTA]，繼續(xù)在液氮條件下研磨2 min，轉(zhuǎn)入2 mL離心管，用1 mL DNA洗滌液清洗研缽并將清洗液倒入離心管，室溫，12 000 rpm·min-1，離心10 min；（2）棄上清，加入1 000 μL DNA洗滌液和2 μL 1M DTT，渦旋1 min，4℃，12 000 rpm·min-1，離心10 min，棄上清；（3）同1.4.1步驟（3）-（7）；（4）取上清，加等體積預(yù)冷異丙醇，輕輕混勻，-20℃沉淀2 h；（5）室溫，12 000 rpm·min-1，離心10 min，用70%乙醇洗滌兩次，再用無水乙醇洗滌一次，室溫風干，20 μL TE溶解，-20℃保存。

1.4.4 試劑盒法

（1）參照Plant Genomic DNA Kit試劑盒說明書提取沉香葉片、干燥枝條、藥材基因組DNA；（2）參照DNeasy Plant Mini Kit試劑盒說明書提取沉香藥材基因組DNA。

1.5 ITS2序列擴增體系和程序

擴增體系和程序參照Prime STAR?HS（Premix）說明書并進行優(yōu)化。葉片和干燥枝條樣品擴增體系為50 μL：Prime STAR?HS（Premix） 25 μL； 正向引物ITS2 S2F[16]（5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT- 3’）、反向引物ITS2 S3R[16]（5‘- GACGCTTCTCCAGACTACAAT- 3’）各 0.7 μL（20 μmol·L-1）；模板 DNA 2 μL；無菌去離子水定容到 50 μL。藥材樣品的擴增體系為50 μL：Prime STAR?HS（Premix） 25 μL； 正反向引物（20 μmol·L-1）各 0.8 μL；模板 DNA 6 μL；無菌去離子水定容到 50 μL。葉片和干燥枝條樣品擴增程序：94℃預(yù)變性 2 min；98℃變性10 s，55℃退火 10 s，72℃延伸30 s，40 次循環(huán)；72℃延伸 5 min。藥材樣品的退火溫度為58℃，其余程序同葉片和干燥枝條。

1.6 DNA模板和PCR產(chǎn)物的檢測

用超微量紫外分光光度計測定DNA A260 nm/A 280 nm的值及濃度。將DNA模板及擴增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳分離，電壓100 V，電泳22 min。凝膠成像儀中觀察成像并拍照保存。

1.7 ITS2序列測定及聚類分析

將電泳條帶單一、清晰、明亮的PCR 擴增產(chǎn)物送至廣州華大生物科技有限公司進行雙向測序。所有序列用The ITS2 Database 在線工具（http∶//its2. bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/）及SnapGene?Viewer（Version2.6.2） 軟件剪切并校正，除去序列兩端質(zhì)量差的堿基，用BioEdit（Version 7.01）進行多重比對，在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行Blast，最后用MEGA（Version 6.0）軟件，選擇鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，并以Kimura.2-parameter model做1 000次可信度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同DNA提取方法提取效率比較分析

由于沉香不同組織所含化學(xué)成分差異較大，葉片中主要含有多糖、脂質(zhì)類成分，因此需先用DNA洗滌液洗滌數(shù)次；干燥枝條中尤其是樹皮中含有大量纖維[17]、蛋白質(zhì)及酚類成分，需要加入Tris飽和酚除去；而含樹脂藥材中主要含有色酮類、甾體類、萜類、揮發(fā)油類成分[18-20]，需用蛋白酶K、SDS、DTT等除雜，并在加入DNA洗滌液時充分研磨。本實驗優(yōu)化CTAB法提取的沉香總DNA A260/A280的值絕大多數(shù)分布在1.7-2.0之間，濃度達到幾十到幾百ng·μL-1（表2），葉片、干燥枝條總DNA電泳條帶單一、清晰，但由于不同產(chǎn)地、不同結(jié)香方法、不同樹種來源、不同質(zhì)量等級、不同加工處理方法的市售沉香藥材化學(xué)成分種類及含量差異較大[18-22]，樣品S1、S2總DNA的純度較低，濃度差異也較大（圖1）。試劑盒法提取的沉香總DNA A260/A280的值絕大多數(shù)分布在1.8-2.0之間，但濃度只有幾到幾十ng·μL-1,且去鹽程度較低，因此其A260/A230出現(xiàn)負值（表2）。葉片和干燥枝條總DNA電泳條帶單一、清晰，而藥材總DNA未見明顯電泳條帶（圖1）。

表2 試劑盒法和優(yōu)化CTAB法提取15個樣品總DNA的純度和濃度

2.2 沉香ITS2-PCR擴增結(jié)果分析

圖1 試劑盒法和優(yōu)化CTAB法提取沉香DNA電泳圖

沉香葉片和干燥枝條DNA的PCR產(chǎn)物電泳條帶均單一、清晰且明亮（圖2 -G、H、J、K）。但由于沉香藥材樣品質(zhì)量差異，其相應(yīng)的PCR產(chǎn)物電泳條帶亮度也參差不齊；此外，藥材DNA降解較嚴重，其PCR產(chǎn)物總體亮度也較葉片和干燥枝條低且有彌散；由于優(yōu)化CTAB法所得藥材DNA的純度較低，其PCR擴增產(chǎn)物電泳主條帶下方有非特異性條帶，且在點樣孔有雜質(zhì)污染（圖2）。

2.3 ITS2聚類分析

本研究15個沉香樣品（GenBank接收號為KX351409-KX351421和KX369227-KX369228）及GenBank中下載的擬沉香屬、沉香屬及其常見混偽品（泡桐木、馬尾松、檀香、降香）的ITS2序列比對、分析結(jié)果見表3、圖3。ITS2序列能準確鑒別出4個沉香混偽品和2個擬沉香物種。15個沉香樣品間ITS2序列與A. subintegra（泰國）、A. sinensis（中國）、A. crassna（柬埔寨、泰國）3個沉香物種來源的ITS2序列[23]及陳士林[16]等提供的GenBank中沉香序列均100%相似，且K2P距離均為0，因此可判斷本研究所選取的序列可靠，并確認本實驗所用15種沉香為其中一種。

3 討論

目前，新鮮植物葉片DNA的提取已有較多可行的方法，但由于不同物種葉片中主要化學(xué)成分的種類和含量差異，目前還沒有一種通用的DNA提取方法。木材DNA提取的方法仍處于試驗和摸索階段。1988年，De Filippis[24]利用改良的CTAB法成功提取刺槐Robinia pseudoacacia木材DNA，后繼學(xué)者們也采用改良CTAB或商業(yè)試劑盒的方法先后從松屬Pinus spp.[25]，櫟屬Q(mào)uercus spp.[26，27]，龍腦香科Dipterocarpaceae[28]等多種木材中提取出可用于PCR擴增的DNA。而中藥材樣品來源復(fù)雜，所含成分的種類和含量千差萬別，針對不同藥材、不同藥用部位進行DNA提取方法的摸索對于促進中藥材分子生物學(xué)研究是十分必要的。為此，羅焜[29]等按照中藥材藥用部位及成分的差異建立了改良CTAB法，該方法提取DNA的PCR擴增成功率達90%，為中藥材DNA的提取及后續(xù)的DNA條形碼研究奠定了重要基礎(chǔ)。

圖2 試劑盒法和優(yōu)化CTAB法提取15個樣品PCR產(chǎn)物電泳圖

與高曉霞[13]、劉少烽[14]、邵敏[15]等僅針對白木香葉片或者藥材的DNA提取方法相比，本研究系統(tǒng)全面的建立了適用于不同類型沉香樣品（葉片、干燥枝條、藥材）DNA提取的方法及優(yōu)化的PCR體系和程序，為后續(xù)DNA條形碼研究及對沉香藥材進行種質(zhì)資源聚類分析奠定基礎(chǔ)，具有一定創(chuàng)新性。本研究結(jié)果表明，試劑盒法所提取的沉香葉片、干燥枝條、藥材總DNA的ITS2-PCR擴增成功率和測序成功率均為100%，但其成本較高，且得到的樣品濃度較低。本實驗建立的優(yōu)化CTAB法提取的DNA濃度均較試劑盒法高，ITS2-PCR擴增成功率亦為100%，符合送樣測序標準，且成本較低。此外，沉香不同組織需用不同的DNA提取方法和PCR反應(yīng)條件；即使組織類型相同，在 DNA含量較低，雜質(zhì)含量較多，儲存年代久遠的市售沉香藥材之間，DNA提取效果及PCR擴增結(jié)果仍存在差異。此結(jié)果與羅焜[29]等的研究結(jié)果一致，即應(yīng)當根據(jù)藥材加工方法、貯藏時間、炮制工藝的不同，甚至是中成藥等實際情況對提取方法及PCR反應(yīng)條件進行調(diào)整。

圖3 樣品與擬沉香、沉香及其常見混偽品ITS2序列NJ樹

從本實驗基因組DNA紫外分光光度儀純度的檢測結(jié)果與DNA模板及PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果來看，盡管總DNA A260/A280的值不在1.8-2.0的純度范圍內(nèi)，甚至有些沉香藥材樣品的DNA模板電泳分離未見主條帶，但由于所用的優(yōu)化CTAB法提取的DNA濃度較高，試劑盒法提取的DNA純度較高，且使用了高保真的PCR預(yù)混酶，其PCR擴增成功率仍能達到100%。A260/A230產(chǎn)生負值主要是由于在濃度很低的DNA溶液中存在一些雜質(zhì)干擾，但這并不影響所得DNA的可用性，因為盡管DNA有一些污染，其仍然能進行PCR反應(yīng)，且PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后仍可用于ITS2序列的測定?？梢?，紫外檢測和電泳檢測仍存在偏差，在總DNA含量較少又含有雜質(zhì)的情況下，應(yīng)結(jié)合PCR擴增結(jié)果綜合分析，必要的情況下，還可以結(jié)合測序結(jié)果的測序成功率來評估所提取DNA的可用性。

近年來，DNA條形碼作為一項新興技術(shù)被大量用于物種鑒別和親緣關(guān)系分析，然而ITS2作為應(yīng)用最廣的植物DNA條形碼，并不能100%的鑒別親緣關(guān)系較近的物種。ITS2能100%的鑒別沉香常見混偽品及兩個擬沉香物種，但A. subintegra（泰國）、A. sinensis（中國）、A. crassna（柬埔寨、泰國）三個沉香物種的ITS2序列完全一致，不存在差異。綜上，ITS2序列能適用于較高分類等級的系統(tǒng)學(xué)研究，能夠簡便的鑒別沉香的真?zhèn)?，但無法100%鑒別沉香屬內(nèi)親緣關(guān)系較近的物種來源，實際工作中仍需結(jié)合傳統(tǒng)的分類鑒定方法來綜合判斷。此外，隨著第三代測序技術(shù)的發(fā)展和測序成本的降低，一些更具前景，能更高效精確的對親緣關(guān)系較近的物種進行鑒別的植物DNA條形碼片段被廣泛地發(fā)掘應(yīng)用。其中，葉綠體全基因組序列在貝母屬[30]、石斛屬[31]等藥用植物的鑒別中得到廣泛的應(yīng)用并展現(xiàn)出良好的鑒別效率。因此，用沉香全葉綠體基因組作為“超級條形碼”進行沉香鑒定及系統(tǒng)進化研究，或從沉香葉綠體全基因組序列中篩選出能鑒別親緣關(guān)系較近的沉香物種的特異性DNA條形碼，將為日后沉香分子鑒定及系統(tǒng)進化分析的研究提供參考。

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A Study on the DNA Extraction Methods of Aquilaria and Cluster Analysis of Its Germplasm Resources

This study aimed at establishing DNA extraction methods suitable for Aquilaria samples of different types, such as leaves, dry branches and medicinal herbs for its authentication by DNA barcode, with cluster analysis of its germplasm resources with ITS2 sequences. As the differences between leaves, dry branches and medicinal materials of Aquilaria., kit method and optimized CTAB method were adopted to extract DNAs. Ultraviolet spectrophotometry, agarose gel electrophoresis, PCR and ITS2 sequences were applied to detect the concentration, purity, availability of DNA, respectively. Then the extraction efficiency of the two methods were compared. The ITS2 sequences of Gyrinops spp., Aquilaria spp., and common adulterants of Aquilaria downloaded from GenBank and the sequenced results were clustered and analyzed. As a result, it was found that the purity of DNA extracted by the optimized CTAB method was lower than that by the kit method, while its concentration using the optimized CTAB method was much higher than that using the kit method. The total DNAs extracted by the two methods were amplified with PCR. Both the amplification success rate and the sequencing success rate for ITS2 were 100%. Four adulterants of Aquilaria and two species of Gyrinops were accurately identifyied using ITS2 sequences. The similarity between the fifteen samples and the three species of Aquilaria, including Aquilaria subintegra (Thailand), Aquilaria sinensis (China), and Aquilaria crassna (Cambodia, Thailand), was 100%. In conclusion, both the kit method and the optimized CTAB method can be applied to the studies of DNA barcode. However, the optimized CTAB method was more suitable for the DNA extraction of Chinese materia medica, which provided a reference for the DNA extraction of Aquilaria and other herbal medicines. The ITS2 sequence also provided scientific basis of germplasm identification and phylogenetic analysis.

CTAB method, kit method, DNA barcode, ITS2, cluster analysis

Zhong Zhimin1, Wu Wenru1, Lai Xiaoping1, Zhang Guifang1, Huang Song2

(1.School of Chinese Materia Medica, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China;

2. Dongguan Mathematical Engineering Academy of Chinese Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Dongguan 523808, China)

10.11842/wst.2016.10.003

R282.2

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

2016-07-01

修回日期：2016-07-21

＊ 港澳臺科技合作專項項目（2014DFH30010）：粵港澳嶺南中藥綜合開發(fā)研究，負責人：賴小平；澳門科技大學(xué)中藥質(zhì)量研究國家重點實驗室開放課題（MUST-SKL-2016-07）：基于LAMP技術(shù)進行鐵皮石斛的特異性分子鑒定研究，負責人：吳文如；廣州中醫(yī)藥大學(xué)留學(xué)人員科技活動資助計劃——薪火計劃（A1-AFD015142Z09）：基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)建立人參與西洋參的快速分子鑒別新方法，負責人：吳文如。

＊＊ 通訊作者：吳文如，博士，副教授，主要研究方向：中藥分子鑒定研究；通信作者：賴小平，本刊編委，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：嶺南中藥。