楊樹桑黃胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化及形態(tài)學(xué)研究

何培新，吳雙雙，許春平（鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450002）

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楊樹桑黃胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化及形態(tài)學(xué)研究

何培新，吳雙雙，許春平*
（鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450002）

摘要：采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了楊樹桑黃搖瓶產(chǎn)胞外多糖（EPS）的培養(yǎng)條件，并研究了優(yōu)化培養(yǎng)基中菌絲體的形態(tài)變化。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，楊樹桑黃產(chǎn)EPS的最適生長(zhǎng)周期為8 d，最佳碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽分別為蔗糖、玉米粉和KH2PO4，最適環(huán)境條件為溫度28℃，pH7。在此基礎(chǔ)上，選用碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽3個(gè)因素，應(yīng)用正交試驗(yàn)優(yōu)化出楊黃產(chǎn)EPS的最佳培養(yǎng)基配方為：40 g/L蔗糖，4 g/L玉米粉，4 mmol/L KH2PO4。在優(yōu)化培養(yǎng)條件下，胞外多糖產(chǎn)量為0.352g/L。優(yōu)化培養(yǎng)基的形態(tài)學(xué)結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，菌絲球逐漸增大，平均直徑、緊密度均逐漸增加，圓度先增加后急劇減小，粗糙度與圓度呈負(fù)相關(guān)，表現(xiàn)為先減小后增加的趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞：楊樹桑黃；優(yōu)化；胞外多糖；形態(tài)學(xué)

楊樹桑黃即瓦尼木層孔菌（Phellinus vaninii Ljup），又名楊黃，屬擔(dān)子菌亞門（Basidiomyeotina），層菌綱（Hymenomycetes），非褶菌目（Aphyllophorales），銹革孔菌科（Hymenochaetaceae），木（針）層孔菌屬（Phellinus）[1]，有“森林黃金”之美稱。瓦尼木層孔菌以生長(zhǎng)在天然林中老齡的楊樹上，且子實(shí)體孔口表面呈黃色菌蓋邊緣為黃色帶狀環(huán)紋而得名[2]，人工林中很難找到。該菌具有抗腫瘤、抗炎、抗血管生成活性等多種藥理作用[3-5]。2005年以來(lái)，人們對(duì)瓦尼木層孔菌的馴化栽培已經(jīng)獲得成功[6-8]，但是關(guān)于瓦尼木層孔菌活性物質(zhì)提取的研究相對(duì)較少，鮮有與其多糖相關(guān)的報(bào)道。

本文主要優(yōu)化楊樹桑黃發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)胞外多糖條件，進(jìn)行菌株的活化培養(yǎng)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以EPS產(chǎn)量為觀察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化碳源、氮源等人工培養(yǎng)條件，并研究了其形態(tài)學(xué)。研究結(jié)果為楊樹桑黃胞外多糖的產(chǎn)品開發(fā)奠定了扎實(shí)的理論和技術(shù)基礎(chǔ)，對(duì)其他真菌的相關(guān)研究也具有一定的借鑒價(jià)值。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌種

楊樹桑黃：來(lái)源于鄭州輕工業(yè)學(xué)院發(fā)酵工程研究室，于斜面培養(yǎng)基上4℃保存。

1.1.2主要儀器

ΜV-17001C紫外分光光度計(jì)：上海鳳凰光學(xué)科儀有限公司；SFLY-100B臺(tái)式小容量恒溫培養(yǎng)搖床、DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海申賢恒溫設(shè)備廠；RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHB-III循環(huán)水多用真空泵：西安太康生物科技有限公司；Nikon E-100顯微鏡（配有DT2000圖像分析軟件）：尼康儀器有限公司。

1.1.3試劑

葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、牛肉膏、蛋白胨、多價(jià)胨、胰蛋白胨、玉米粉、酵母粉、尿素、（NH4）2SO4、NaNO3、FeSO4、CuSO4、MgSO4、CaCl2、K2HPO4、NaCl、HCl、NaOH、乙醇、濃硫酸、苯酚均為分析純，購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：200 g去皮土豆，20 g葡萄糖，108 g瓊脂，蒸餾水補(bǔ)至1 000 mL，pH自然。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：30 g葡萄糖，3 g蛋白胨，蒸餾水補(bǔ)至1 000 mL，pH自然。

1.2方法

1.2.1菌種活化

將保存的試管斜面菌種轉(zhuǎn)接PDA平板，26℃恒溫培養(yǎng)7 d。

1.2.2種子液的制備

用打孔器打取活化好的真菌菌絲塊（約1cm2）兩塊接入含50 mL種子培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，搖瓶轉(zhuǎn)速為160 r/min，于26℃振蕩搖床中培養(yǎng)4 d。然后加入無(wú)菌玻璃珠，置于磁力攪拌器上將菌絲球打碎后備用。

1.2.3葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[9-10]

精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品1.02g，置于100 mL容量瓶中，加水溶解至刻度，搖勻，即為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)母液。精確量取1 mL母液移至100 mL的容量瓶中，用蒸餾水定容，即為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。精確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于具塞試管中，分別補(bǔ)蒸餾水至1 mL，再各加入5 %的苯酚水溶液1 mL和濃硫酸5 mL振蕩搖勻，先在沸水浴中15 min，取出后立即置于冰水浴中15 min。以加入0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的反應(yīng)液作為空白對(duì)照調(diào)零，于490 nm下測(cè)各反應(yīng)液的吸光度值，回歸分析數(shù)據(jù)。

1.2.4菌絲干重和EPS產(chǎn)量的測(cè)定

用抽濾法[11]將菌絲和發(fā)酵液分離，將濾紙和菌絲置于70℃的烘箱烘至干燥后稱量，除去濾紙干重即為菌絲干重。

菌絲體含量（g/L）=菌絲干重（g）/發(fā)酵液體積（mL）×1 000

把發(fā)酵液濃縮后加入4倍乙醇，置于4℃冰箱過(guò)夜處理，第2天把處理液放在轉(zhuǎn)速為10 000 r/min離心機(jī)中離心15 min后棄去上清，用蒸餾水溶解沉淀定容至250 mL，然后用苯酚硫酸法[12]測(cè)發(fā)酵液中的多糖含量。

1.2.5最適生長(zhǎng)周期的確定

將楊樹桑黃培養(yǎng)14 d，每隔2天測(cè)定其菌絲干重和EPS產(chǎn)量。

1.2.6單因素試驗(yàn)確定最佳搖瓶培養(yǎng)條件

碳源優(yōu)化試驗(yàn)：分別用30 g/L的果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木糖代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，26℃、160 r/min培養(yǎng)，測(cè)其菌絲干重和胞外多糖產(chǎn)量。

氮源優(yōu)化試驗(yàn)：采用以上的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以3 g/L牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米粉、酵母粉、尿素、（NH4）2SO4、NaNO3為氮源，26℃、160 r/min培養(yǎng)，測(cè)其菌絲干重和胞外多糖產(chǎn)量。

無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化試驗(yàn)：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加5 mmol/L的MgSO4、KH2PO4、CuSO4、NaCl、CaCl2、FeSO4，以不加無(wú)機(jī)鹽的為空白，26℃、160 r/min培養(yǎng)，測(cè)其菌絲干重和胞外多糖產(chǎn)量。

pH試驗(yàn)：使用1 mol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH分別為3、4、5、6、7、8、9、10，26℃，160 r/min培養(yǎng)，測(cè)其菌絲干重和EPS產(chǎn)量。

溫度試驗(yàn)：將接種好的培養(yǎng)基分別置于24、26、28、30、32℃搖床中，160 r/min培養(yǎng)，測(cè)定不同溫度條件下楊樹桑黃的菌絲干重和EPS產(chǎn)量。

1.2.7正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)確定楊樹桑黃在搖瓶培養(yǎng)中獲得最高EPS產(chǎn)量的條件。為了綜合確定培養(yǎng)基中碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽的最佳濃度組合，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了L9（34）正交表，各因素和水平詳見表1。

表1正交試驗(yàn)的因素和水平Table 1 The factors and levels of orthogonal test

1.2.8形態(tài)學(xué)研究

每?jī)商烊∫淮蝺?yōu)化培養(yǎng)基中的菌絲球，顯微鏡下拍攝菌絲球形態(tài)后，通過(guò)DT2000圖像分析軟件分析，根據(jù)菌絲球的平均直徑、菌核面積、菌絲球面積、菌絲球周長(zhǎng)、圓度等參數(shù)計(jì)算出緊密度、粗糙度。公式如下所示：緊密度=菌核面積/菌絲球面積；粗糙度=（菌絲球的周長(zhǎng)）2/（菌絲球面積×4）[13]。菌絲球染色時(shí)，先加入與發(fā)酵液等體積的固定劑和少許染色劑，4℃冰箱放置1 d，然后用蒸餾水多次沖洗染色的菌絲體，將其放在載玻片上，待晾干后在40倍下顯微拍照。

2試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖濃度對(duì)吸光度的影響變化繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y = 8.428 33x - 0.055 6，相關(guān)系數(shù)R2= 0.999 3。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of glucose

2.2最適生長(zhǎng)周期的確定

在培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，每2天測(cè)量一次楊樹桑黃的菌絲干重和EPS產(chǎn)量，用sigmaplot軟件做圖。培養(yǎng)時(shí)間對(duì)楊樹桑黃菌絲干重和EPS產(chǎn)量的影響見圖2。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，楊樹桑黃的菌絲干重和EPS產(chǎn)量均有所增長(zhǎng)，但第8天以后菌絲干重仍在增加，而EPS產(chǎn)量明顯下降，這可能是由于菌絲量達(dá)到一定生長(zhǎng)高峰期后，多糖成分作為養(yǎng)分供應(yīng)菌絲增長(zhǎng)而被消耗[14]。綜合考慮，確定楊樹桑黃的生長(zhǎng)周期為8 d，此時(shí)胞外多糖的產(chǎn)量最高。

2.3最佳碳源的優(yōu)化

碳源對(duì)楊樹桑黃的菌絲干重和EPS產(chǎn)量均有顯著影響，結(jié)果如圖3所示。

圖2培養(yǎng)時(shí)間對(duì)楊樹桑黃菌絲干重和EPS產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of culture time on mycelial dry weight and EPS production by Phellinus vaninii Ljup

圖3碳源對(duì)楊樹桑黃菌絲干重及EPS產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of carbon source on mycelial dry weight and EPS production by Phellinus vaninii Ljup

楊黃對(duì)葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖的利用率均較好，以葡萄糖為碳源時(shí)菌絲生物量最高，但EPS產(chǎn)量低于蔗糖的，綜合考慮，確定最佳碳源為蔗糖。

2.4最佳氮源的優(yōu)化

氮源對(duì)楊樹桑黃菌絲干重及EPS產(chǎn)量的影響見圖4。

圖4氮源對(duì)楊樹桑黃菌絲干重及EPS產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of nitrogen source on mycelial dry weight and EPS production by Phellinus vaninii Ljup

由圖4可以得出，以玉米粉為氮源時(shí)，楊樹桑黃的菌絲干重和EPS產(chǎn)量均達(dá)到最大值，其次是酵母粉，且一般無(wú)機(jī)氮源不利于菌株的生長(zhǎng)，有機(jī)氮源利于菌株的生長(zhǎng)和胞外多糖的積累[15]。綜合考慮，確定最佳氮源為玉米粉[16]。

2.5最佳無(wú)機(jī)鹽的優(yōu)化

培養(yǎng)基中添加不同的無(wú)機(jī)鹽，目的為了增加菌絲干重和EPS產(chǎn)量。無(wú)機(jī)鹽對(duì)楊樹桑黃菌絲干重及胞外多糖產(chǎn)量的影響見圖5。

圖5無(wú)機(jī)鹽對(duì)楊樹桑黃菌絲干重及EPS產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of inorganic salt on mycelial dry weight and EPS production by Phellinus vaninii Ljup

可以得出，添加無(wú)機(jī)鹽較沒有添加的多糖產(chǎn)量高，菌絲干重沒有明顯變化。添加MgSO4時(shí)楊樹桑黃的菌絲生物量達(dá)到最大，但添加KH2PO4時(shí)，EPS產(chǎn)量顯著增加，故選擇KH2PO4作為最適宜生長(zhǎng)的無(wú)機(jī)鹽添加應(yīng)用。

2.6最適培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

選取5個(gè)溫度梯度，24、26、28、30、32℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)菌絲干重和EPS產(chǎn)量，結(jié)果見圖6。

圖6培養(yǎng)溫度對(duì)楊樹桑黃菌絲干重及EPS產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of culture temperature on mycelial dry weight and EPS production by Phellinus vaninii Ljup

可以得出，26℃時(shí)楊樹桑黃的菌絲產(chǎn)量最高，28℃~ 32℃菌絲干重沒有明顯的變化。而EPS產(chǎn)量在28℃時(shí)增加至最大值，以目標(biāo)產(chǎn)物為指標(biāo)，選取28℃為最佳培養(yǎng)溫度。

2.7培養(yǎng)基初始pH的優(yōu)化

培養(yǎng)基中pH的變化對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用、細(xì)胞的生長(zhǎng)、EPS產(chǎn)量都有著很大的影響。以液體種子培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其他條件保持不變，培養(yǎng)基pH分別為3、4、5、6、7、8，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，確定最適pH，結(jié)果見圖7。

圖7培養(yǎng)基初始pH對(duì)楊黃菌絲干重及EPS產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of medium initial pH on mycelial dry weight and EPS production by Phellinus vaninii Ljup

可以得出，楊樹桑黃菌絲生長(zhǎng)的最適pH為6.0，產(chǎn)胞外多糖的最適pH為7.0。

2.8正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，碳源選擇蔗糖，氮源選擇玉米粉，無(wú)機(jī)鹽選擇KH2PO4，進(jìn)行正交試驗(yàn)考察，結(jié)果見表2。

表2楊樹桑黃正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of Phellinus vaninii Ljup

分析表2可知，以菌絲干重和EPS產(chǎn)量為指標(biāo)，影響因素的主次順序均為A＞C＞B，最優(yōu)組合為A3C1B3。表2 的9組試驗(yàn)組合中沒有最優(yōu)組合為A3C1B3，因此選擇該組合進(jìn)行追加驗(yàn)證試驗(yàn)，獲得最佳條件下的胞外多糖產(chǎn)量為0.352g/L。楊樹桑黃的最優(yōu)培養(yǎng)基組合為40g/L蔗糖，4 g/L玉米粉，4 mmol/L KH2PO4。

2.9形態(tài)學(xué)

在優(yōu)化培養(yǎng)基中，不同發(fā)酵時(shí)間的楊黃菌絲球形態(tài)變化和菌絲球平均直徑、圓度、緊密度和粗糙度的變化見圖8和圖9。

圖8楊樹桑黃隨發(fā)酵時(shí)間的形態(tài)變化（放大倍數(shù)40）Fig.8 The morphological changes of Phellinus vaninii Ljup during fermentation time（magnification 40）

圖9楊樹桑黃的形態(tài)學(xué)指標(biāo)Fig.9 The morphological indexs of Phellinus vaninii Ljup

由圖8可以看到，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌絲球逐漸增大，第2天已有明顯的菌核，外圍菌絲持續(xù)生長(zhǎng)。到第6天菌絲生長(zhǎng)最旺盛，發(fā)酵后期菌核較為致密，菌絲逐漸減少，這可能是由于發(fā)酵后期，菌絲生長(zhǎng)到了穩(wěn)定期。菌絲球的直徑和緊密度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)均逐漸增加（圖9A和9C），圓度呈先增加后減小的趨勢(shì)，初期圓度小可能與發(fā)酵初期菌絲球?yàn)榻z狀體有關(guān)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，外圍菌絲增加圓度急劇下降（圖9B）。菌絲球的粗糙度（圖9D）先減小后增加，與圓度呈負(fù)相關(guān)。

3　結(jié)論

本研究結(jié)果表明：楊樹桑黃產(chǎn)胞外多糖的最優(yōu)環(huán)境條件為溫度28℃、pH 7、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，最適生長(zhǎng)周期為8 d，最佳碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽分別是蔗糖、玉米粉和KH2PO4。正交試驗(yàn)優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基組合為：40 g/L蔗糖，4 g/L玉米粉，4 mmol/L KH2PO4，獲得的胞外多糖產(chǎn)量為0.352 g/L。優(yōu)化培養(yǎng)基中，菌絲球隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大，其平均直徑、緊密度均逐漸增加，圓度先增加后急劇減小，粗糙度與圓度呈負(fù)相

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Optimization of Fermentation Conditions for Exopolysaccharide from Phellinus vaninii Ljup and Its Morphological Investigation

HE Pei-xin，WU Shuang-shuang，XU Chun-ping*
（College of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，Henan，China）

Abstract：In this study，the single-factor method and orthogonal design were used to optimize the flask culture conditions for exopolysaccharide（EPS）production by Phellinus vaninii Ljup. The morphological changes in optimal medium mycelia were also investigated. The results of single-factor experiment for EPS production showed the optimum growth cycle 8 days. And the best carbon source，nitrogen source and inorganic salts were sucrose，corn steep powder and KH2PO4，the optimal temperature of 28℃，pH 7. Then，the concentrations of three factors，i.e. carbon source，nitrogen source and inorganic salts was optimized using the orthogonal design and the optimum culture medium for EPS production were 40 g/L sucrose，4 g/L corn steep powder，4 mmol/L KH2PO4. Under the optimial culture conditions，EPS yield was 0.352 g/L. The morphology under the optimal medium was invesitaged during the fermentation period. The mycelial pellets increased gradually，and the average diameter and density also increased，but roundness increased first then decreases sharply. The roughness first decreased and then increased，which was negatively correlated with roundness.

Key words：Phellinus vaninii Ljup；optimization；exopolysaccharide；morphology

收稿日期：2014-08-02

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.044

*通信作者

作者簡(jiǎn)介：何培新（1970—），男（漢），教授，博士，主要從事應(yīng)用真菌的研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（21376227）；河南省科技創(chuàng)新杰出青年計(jì)劃（134100510017）