利用熒光免疫層析卡測定黃曲霉毒素M1的研究

趙衛(wèi)東，房保海，侯麗萍，崔穎，張宏偉（.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物與食品檢測中心，天津30046；．山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山東青島6600）

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利用熒光免疫層析卡測定黃曲霉毒素M1的研究

趙衛(wèi)東1，房保海2，侯麗萍1，崔穎1，張宏偉1
（1.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物與食品檢測中心，天津300461；2．山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山東青島266002）

摘要：將量子點(diǎn)與抗黃曲霉毒素M1（AFM1）的單克隆抗體偶聯(lián)，以AFM1-BSA偶聯(lián)物包被于NC膜作為檢測線，山羊抗鼠二抗包被于NC膜上作為質(zhì)控線，構(gòu)建了直接競爭檢測AFM1的熒光定量免疫層析檢測卡體系，在0.156 μg/L~ 1.25μg/L范圍內(nèi)能夠準(zhǔn)確定量黃曲霉毒素B1，靈敏度達(dá)到0.156μg/L。

關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素M1；熒光定量免疫層析；檢測卡

黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）劃定為I類致癌物[1-2]，是一種毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)，其毒性是氰化鉀的10倍，黃曲霉毒素中的B1、M1屬強(qiáng)致癌物，其作用機(jī)制是影響細(xì)胞膜，抑制RNA合成并干擾某些酶的感應(yīng)方式；其中毒癥狀無特異表現(xiàn)，按癥狀的嚴(yán)重程度不同，臨床可表現(xiàn)為發(fā)育遲緩、腹瀉、肝腫大、肝出血、肝硬化、肝壞死、脂肪滲透、膽道增生等。

黃曲霉毒素M1（AFM1）是黃曲霉毒素B1在動物體內(nèi)經(jīng)過羥化生成的代謝產(chǎn)物，主要存在于牛奶及其制品中，奶牛吃了黃曲霉污染的飼料或草料后，經(jīng)過奶牛體內(nèi)代謝，生成，被帶入到乳制品中，嚴(yán)重危害人體健康。我國在2011年就針對黃曲霉毒素M1制定了相應(yīng)國家標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定其在乳及乳制品和特殊膳食食品中的限量不得超過0.5 μg/kg[3]。

目前，檢測AFM1的方法主要有薄層色譜法（thinlayer chromatography，TLC）[4-5]、酶聯(lián)免疫法（ELISA）[6]、熒光光度法[7]、雙流向酶聯(lián)免疫技術(shù)（SNAP）[8]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[9]。其中，TLC法操作繁瑣，ELISA法為篩選法，易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法儀器價格昂貴，容易受到基質(zhì)效應(yīng)的影響。以上方法均存在檢測周期較長，檢測工作依賴于昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員，不利于基層執(zhí)法人員的現(xiàn)場監(jiān)督檢驗(yàn)工作。因此，建立針對黃曲霉毒素M1的高靈敏度、快速、穩(wěn)定、易普及的檢測方法非常必要。

本研究利用小鼠抗AFM1單克隆抗體為基礎(chǔ)，通過在單克隆抗體上偶聯(lián)量子點(diǎn)，將AFM1-BSA偶聯(lián)物包被于硝酸纖維素膜（NC膜）作為檢測線，山羊抗小鼠二抗包被于NC膜上作為質(zhì)控線，成功構(gòu)建直接競爭檢測AFM1的熒光定量免疫層析檢測卡體系，該檢測體系能保障檢測時間短、檢測靈敏度高，可滿足我國在乳及乳制品中AFM1殘留限量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)出口檢測要求。

1材料與方法

1.1主要試劑及材料

AFM1標(biāo)準(zhǔn)品、AFM1-BSA偶聯(lián)物、BSA、碳化二亞胺EDC：Sigma；McAb-AFM1單克隆抗體：Abcam；羧基水溶性量子點(diǎn)QDs 605：武漢珈源；羊抗鼠IgG：Jackson ImmunoResearch；層析柱：GE Healthcare；超濾管、硝酸纖維素膜：Millipore；Tween-20：Amresco；蔗糖：國藥集團(tuán)；玻璃纖維、吸水墊、襯板：上海杰一試劑均為分析純。

1.2主要儀器

熒光顯微鏡：Olympus BX51；熒光免疫層析分析儀：武漢珈源；UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)：SHIMADZU UV2550，Japan；LS-55型熒光分光光度計(jì)：Perkin Elmer LS55，America；電泳儀：北京六一；Alpha Innotech凝膠成像系統(tǒng)：Alpha Imager HP；XYZ3060三維噴點(diǎn)儀、CM4000切條機(jī)：Bio-Dot；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海索譜。

1.3量子點(diǎn)的制備和純化

1.3.1量子點(diǎn)標(biāo)記抗體（QDs-McAb）的制備及純化

標(biāo)記抗體所用的量子點(diǎn)為武漢珈源量子點(diǎn)公司生產(chǎn)的羧基水溶性量子點(diǎn)（PEG）-605，濃度8 μmol/L，50 mmol/L borate，pH8.4。

將羧基水溶性量子點(diǎn)和AFM1抗體在偶聯(lián)劑EDC的作用下共價交聯(lián)，生成量子點(diǎn)標(biāo)記的抗體（QDs-McAb）：取CdTe QDs 600 μL，加入18 μL的EDC （1 mg/mL）和800 μL的甲醇混合后避光震蕩30 min，再加入8 μL的β-巰基乙醇進(jìn)行終止，取0.75 mg的抗體用PBS稀釋至適當(dāng)體積加入活化的QDs中與之混合，避光震蕩2 h，反應(yīng)結(jié)束后再加入巰基乙醇穩(wěn)定量子點(diǎn)，進(jìn)行透析。透析后在16 300 r/min條件下離心3 min，去除上清，沉淀重懸于PBS中，4℃保存。

對上述步驟產(chǎn)生的QDs-McAb進(jìn)行純化。采用凝膠尺寸排阻色譜法除去多余的抗體及其它副產(chǎn)物，終產(chǎn)物保存于10 mmol/L PBS（pH7.4中）。

1.3.2 QDs-McAb的表征

使用紫外-可見分光光度計(jì)以及熒光分光光度計(jì)對純化后的QDs-McAb進(jìn)行掃描鑒定。同時，對純化前的QDs 525及純化后的QDs-McAb進(jìn)行電泳檢測。

分光光度計(jì)測定條件為紫外掃描波長范圍：400 nm~700 nm，掃描間距：0.5 nm，掃描速度：高速；熒光激發(fā)波長：380 nm，掃描步長：1 nm；參比溶液：10 mmol/L PBS，pH7.4。

電泳檢測條件為電泳緩沖液：0.5×TAE；0.5×TAE緩沖液下電壓：103 V，電流：60 mA，時間：40 min；凝膠成像系統(tǒng)光圈：2.0，焦距：2.75，曝光時間：100 ms。

1.3.3 QDs-McAb生物活性鑒定

用點(diǎn)雜交的方法對QDs-McAb進(jìn)行生物活性鑒定。

分別將濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8（ng/mL）的AFM1-BSA偶聯(lián)物包被于NC膜上，加入QDs-McAb 37℃孵育，用熒光顯微鏡進(jìn)行檢測。

1.4免疫層析試紙條制備

1.4.1樣品墊預(yù)處理

以玻璃纖維作為樣品墊，使用含2 % BSA、2 %蔗糖、0.05 %Tween-20，10 mmol/L，pH 7.4的PBS作為樣品墊處理液。將樣品墊浸泡于樣品墊處理液15 min后，取出于37℃干燥24 h。采用切條機(jī)切割成長320 mm，寬21 mm，備用。

1.4.2包被抗體

用10 mmol/L，pH 7.4的PBS稀釋AFM1-BSA偶聯(lián)物以及山羊抗鼠二抗。將AFM1-BSA偶聯(lián)物以及山羊抗鼠二抗分別包被于NC膜上。檢測線包被AFM1-BSA偶聯(lián)物，濃度為2 mg/mL；質(zhì)控線包被山羊抗鼠IgG，濃度為0.5 mg/mL。置于干燥箱內(nèi)干燥過夜。將包被好的NC膜剪裁成長320 mm，寬2.5 mm，備用。

1.4.3試紙條組裝

將樣品墊、NC膜、吸水墊粘貼于長300 mm、寬60 mm的底板上，使用切條機(jī)切割成寬4 mm、長60 mm的試紙條備用。

1.5免疫層析試紙條靈敏度和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將AFM1標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行倍比稀釋為10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078、0 ng/mL，取75μL樣品與5μL QDs-McAb標(biāo)記液混合，一起加入到免疫層析試紙條的上樣區(qū)，使用試紙條進(jìn)行檢測，1個濃度做5個平行試驗(yàn)。10 min后使用熒光層析檢測儀進(jìn)行讀值，同時使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

根據(jù)測得的熒光值建立劑量-反應(yīng)曲線，確定線性范圍，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.6免疫層析試紙條特異性

按照1.5中的方法，應(yīng)用熒光免疫層析試紙條分別對稀釋配制的真菌毒素標(biāo)品溶液（黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮）進(jìn)行檢測，濃度分別為1、1.5、2 ng/mL，使用熒光層析檢測儀進(jìn)行讀值，判斷試紙條的特異性。

1.7免疫層析試紙條穩(wěn)定性

按照1.5中的方法，將密封好的AFM1免疫層析試紙條置于37℃保存15 d，每天取試紙條檢測。分別檢測陰性（0.01 mol/L PBS）樣品和陽性（1.25 ng/mL）樣品，每個濃度重復(fù)檢測3次，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測試紙條的保質(zhì)期。

1.8加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)和精密度

向空白牛奶樣品中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的黃曲霉毒素M1濃度至0.2、0.5、1.0 μg/kg，每個添加量做3個平行，以熒光免疫檢測卡進(jìn)行檢測，計(jì)算平均回收率和精密度。

2結(jié)果與分析

2.1 QDs-McAb的表征

根據(jù)紫外-可見分光光度計(jì)以及熒光分光光度計(jì)對QDs-McAb的掃描結(jié)果見圖1，電泳結(jié)果見圖2。

圖1 QDs-McAb的熒光及紫外光譜圖（Em：607 nm，fwhm：21 nm）Fig.1 Fluorescence and UV spectrum of QDs-McAb （Em：607 nm，fwhm：21 nm）

圖2 QDs-McAb的瓊脂糖凝膠電泳圖（Em：302 nm）Fig.2 Agarose gel electropherogram of QDs-McAb（Em：302 nm）

由圖1可看出，在607 nm處有明顯的特征峰，半峰寬較窄說明量子點(diǎn)均一性良好。圖2顯示與抗體偶聯(lián)后量子點(diǎn)電泳速度較偶聯(lián)前的慢，這說明量子點(diǎn)上已偶聯(lián)上抗體。

2.2 QDs-McAb生物活性鑒定

QDs-McAb生物活性鑒定，見圖3。

圖3 QDs-McAb生物活性鑒定熒光顯微鏡圖Fig.3 The picture of fluorescence microscope to QDs-McAb’s bioactivity

由圖3可以看出，不同濃度的AFM1-BSA與QDs-McAb結(jié)合后，在熒光顯微鏡下可觀察到熒光強(qiáng)度有明顯差異，由此可見QDs-McAb與AFM1-BSA具有良好的結(jié)合能力。

2.3免疫層析試紙條制備、線性關(guān)系和靈敏度

本研究主要使用量子點(diǎn)標(biāo)記AFM1單克隆抗體，形成QDs-McAb復(fù)合物。利用競爭法，使NC膜上的AFM1-BSA與樣品中的AFM1共同競爭QDs-McAb復(fù)合物。根據(jù)檢測線上熒光減弱的程度從而對樣品中的AFM1進(jìn)行定量，結(jié)果見表1。

表1 QDs-McAb免疫層析靈敏度熒光值Table 1 Fluorescence value of immunochromatogragphic sensitivity of QDs-McAb

由熒光層析檢測儀檢測的熒光值可見（表1），除0.078 ng/mL外其他各濃度的檢測樣品對應(yīng)的熒光值都與陰性樣品有明顯的差異，且不同濃度的熒光值存在一定的比例關(guān)系。同時凝膠成像系統(tǒng)檢測出的結(jié)果（圖4）顯示，當(dāng)AFM1的濃度為0.078 ng/mL時與陰性樣品的結(jié)果差異變得不顯著。綜合兩種檢測方法的結(jié)果，該免疫層析試紙條的定量靈敏度在0.156 ng/mL。

從各濃度-熒光值折線圖（圖5a）可以得出，濃度在0.156 ng/mL~1.25 ng/mL時，AFM1濃度與熒光值呈線性關(guān)系；使用數(shù)據(jù)分析軟件建立了劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5b），線性回歸方程為y = -107.37x + 136.43 （R2= 0.993 5），曲線的線性良好，說明該方法的檢測值與樣品的濃度具有良好的線性關(guān)系，可以使用該方法進(jìn)行定量檢測。

圖4 QDs-McAb免疫層析靈敏度成像圖Fig.4 Imaging map of immunochromatogragphic sensitivity of QDs-McAb

圖5 AFM1免疫層析法劑量-反應(yīng)曲線Fig.5 The dose- reaction curve of immunochromatogragphic assay

2.4免疫層析試紙條特異性

用本試紙條對不同毒素進(jìn)行特異性檢測，結(jié)果見表2和圖6。

表2免疫層析試紙條特異性試驗(yàn)Table 2 The specificity assay of immunochromatogragphic paper test strip

圖6 AFM1檢測卡特異性測試Fig.6 The specificity assay of AFM1 detection card

表2和圖6表明，黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮等真菌毒素與AFM1熒光定量免疫層析檢測卡均不產(chǎn)生交叉反應(yīng)，特異性較好。

2.5穩(wěn)定性

據(jù)文獻(xiàn)報道，試紙條在37℃保存1 d，相當(dāng)于室溫放置1個月[10]。把本試紙條在37℃分別保存1 d到15 d后，對3種陽性樣品和3種陰性樣品分別進(jìn)行檢測，結(jié)果見表3。

據(jù)表3結(jié)果可推斷，AFM1熒光定量免疫層析試紙條常溫干燥環(huán)境下保質(zhì)期約為15月，試紙條穩(wěn)定性良好，故保質(zhì)期可定位1年。

表3熒光定量免疫層析試紙條穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 3 Stability testing of fluorescent quantitative immunochromatogragphic paper test strip

2.6加標(biāo)回收試驗(yàn)和精密度

向空白牛奶樣品中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的黃曲霉毒素M1，每個添加量做3個平行，分別測定其平均回收率，結(jié)果見表4。

表4牛奶樣品中黃曲霉毒素M1的加標(biāo)回收率Table 4 The recovery of standard addition of AFM1 to milk sample

由表4可以看出，黃曲霉毒素M1的平均回收率在98.0 %～107.9 %之間，精密度（即相對標(biāo)準(zhǔn)偏差）為1.89 %～4.51 %之間（表4），說明該方法在測定線性范圍內(nèi)準(zhǔn)確度較高。

3結(jié)論和討論

本研究研制的AFM1熒光免疫試紙條采用了競爭原理，試紙條底板為雙面膠白色塑料板，從加樣處開始分別為樣品墊、膠金墊、NC膜和吸水紙。量子點(diǎn)標(biāo)記抗AFM1單克隆抗體噴涂于樣品墊上（玻璃纖維），NC膜上分別噴涂偶聯(lián)抗原AFM1-BSA（檢測線）和山羊抗鼠IgG（質(zhì)控線）。

該法檢測線出現(xiàn)熒光條帶，結(jié)果顯示陰性，檢測線無條帶，結(jié)果顯示陽性。這是因?yàn)楫?dāng)被檢物質(zhì)溶液中不含AFM1時，由加樣區(qū)釋放量子點(diǎn)標(biāo)記有抗AFM1單克隆抗體的反應(yīng)位點(diǎn)便會被檢測線處的偶聯(lián)抗原AFM1-BSA物質(zhì)識別并被結(jié)合，因而被截留在該處，當(dāng)累積到一定的程度在此處便出現(xiàn)熒光條帶，但弱陽性時會出現(xiàn)反應(yīng)強(qiáng)度減弱的檢測線。當(dāng)被檢物質(zhì)溶液中AFM1的濃度達(dá)到一定時，AFM1就會把量子點(diǎn)標(biāo)記上的抗AFM1抗體的反應(yīng)位點(diǎn)全部結(jié)合完畢，這樣當(dāng)量子點(diǎn)標(biāo)記抗體到達(dá)檢測線時便不能再與此處噴涂有偶聯(lián)抗原發(fā)生反應(yīng)，因而也就不出現(xiàn)熒光條帶。無論被檢測物質(zhì)中有無AFM1，量子點(diǎn)標(biāo)記的抗AFM1單克隆抗體都會與噴涂在NC膜上的山羊抗鼠二抗發(fā)生免疫反應(yīng)，即在質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條熒光條帶。

本研究研制的AFM1熒光定量免疫層析檢測卡在0.156 μg/L~1.25 μg/L范圍內(nèi)能夠準(zhǔn)確定量，具有快速、單份測定、操作簡單，不需添加其他試劑和孵育、洗滌步驟的優(yōu)點(diǎn)，因此大大地提高了檢測效率，十分適合現(xiàn)場快速檢測，有望成為AFM1現(xiàn)場快速定量檢測檢測的有效方法和工具，為食品安全檢測提供有效的手段，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和社會價值。

參考文獻(xiàn)：

[1]王軍淋,蔡增軒,任一平.超高效液相色譜-大體積流通池?zé)晒夥z測奶及奶制品中的黃曲霉毒素M1[J].浙江大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版), 2013, 39(2): 191-196

[2] Ren Y P, Zhang Y, Shao S L, et al. simulataneous determination of multi-component mycotoxin contaminants in foods and feed by ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry [J]. Journal of Chromatography A, 2007, 1143(1/2):48-64

[3]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 2761-2011食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2011:2

[4] Carvalho K L, Goncalves G A A, Lopes A L, et al. Modeling uncertainly estimation determination of aflatoxin M1 in milk by visual and densitometric thin-layer chromatography with immunoaffinity column clean-up[J]. Food Additives and Contaminants, 2012, 29(4): 679-693

[5] Kamkar A. A study on the occurrence of aflatoxin M1 in Iranian Feta cheese[J]. Food Control,2006, 17(10): 768-775

[6] Bakirci I. A study on the occurrence of Aflatoxin M1 in milk and milk products produced in Van Province of Turkey[J]. Food Control, 2001, 12(1): 47-51

[7] Elkak A, AtaT O E, Habib J, et al. Occurrence of aflatoxin M1 in cheese processed and marketed in Lebanon[J]. Food Control, 2012, 25(1): 47-51

[8]張鵬,張藝兵,王晶,等.牛奶及奶粉中黃曲霉毒素M1的快速檢測[J].中國乳品工業(yè), 2002, 30(6): 30-32

[9]付成平,歐陽華學(xué),胡莉. SNAP快速檢測法與高效液相色譜法測定牛奶中黃曲霉毒素M1的比較分析[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2009, 22(5): 1435-1438

[10]段霞.單核細(xì)胞增生李斯特氏菌膠體金免疫層析方法的建立[D].江西:南昌大學(xué), 2009:47-55

Studies on Fluorescent Immunochromatogragphic Card to Detect AFM1

ZHAO Wei-dong1，F(xiàn)ANG Bao-hai2，HOU Li-ping1，CUI Ying1，ZHANG Hong-wei1
（1. Animal & Plant & Foodstuffs Inspection Center of Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China；2. Inspection and Quarantine Technical Center of Shandong Exit & Entry Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao 266002，Shandong，China）

Abstract：By conjugating ployclonal antibody of anti- AFM1 and quantum dots，the system of fluorescent quantitative immunochromatogragphic card was established. The detection line is established by coating NC film with AFM1-BSA conjugate. The detection line is established by coating NC film with sheep anti-rat second antibody. This system could quantified AFM1 correctly in the range of 0.156 μg/L-1.25 μg/L. The sensitivity of the detection card was 0.156 μg/L.

Key words：AFM1；fluorescent quantitative immune chromatography；detection card

收稿日期：2015-09-01

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.033

作者簡介：趙衛(wèi)東（1977—），男（漢），高級工程師，碩士，主要從事分子生物學(xué)檢測工作。

基金項(xiàng)目：天津出入境檢驗(yàn)檢疫局應(yīng)用重點(diǎn)項(xiàng)目（TK075-2013）