雙酶法制備大豆肽工藝優(yōu)化研究

柯濤，黃亞男，龐振凌，鞏婷婷，王曦，李盤欣，賈春陽，郭金璐，遲婷婷，江雨，黎文進(jìn)（.南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南南陽47306；.河南省南街村集團(tuán)有限公司，河南臨穎46600）

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雙酶法制備大豆肽工藝優(yōu)化研究

柯濤1，黃亞男2，龐振凌1，鞏婷婷1，王曦1，李盤欣2，賈春陽1，郭金璐1，遲婷婷1，江雨1，黎文進(jìn)1
（1.南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南南陽473061；2.河南省南街村集團(tuán)有限公司，河南臨穎462600）

摘要：以大豆分離蛋白為原料，通過單因素試驗(yàn)研究蛋白液的濃度、水解的溫度、水解時(shí)間、酶的加入量及pH等因素對(duì)大豆分離蛋白水解度的影響，確定適宜的范圍值和因素組合。結(jié)果表明，大豆分離蛋白在蛋白液濃度8 %，加酶底物比為2%，在55℃水解4 h，水解初始pH為9.0～10.0時(shí)水解率最高。水解后pH穩(wěn)定在7左右。通過苦味值測(cè)定，結(jié)果表明，風(fēng)味酶在50℃條件下，水解1h，苦味值最低。液相色譜檢測(cè)水解后肽的分子量主要分布在300 Da～1 000 Da范圍。小于1000 Da以下的肽占總量的80.3%，2000 Da以下的肽含量占91.5%。

關(guān)鍵詞：大豆分離蛋白；堿性蛋白酶；風(fēng)味蛋白酶；大豆肽；工藝優(yōu)化

大豆蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白，可以提供充足的人體所需的8種必需氨基酸、多種維生素和礦物質(zhì)等。但大豆蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，相對(duì)分子量較大，溶解性差，消化率和生物效價(jià)不及牛乳等動(dòng)物蛋白質(zhì)[1]。而小分子的肽則易被人體消化吸收，能夠抗疲勞、增強(qiáng)體力。此外，大豆肽還具有抗氧化、降血壓、降血脂減肥、免疫調(diào)節(jié)、血糖調(diào)節(jié)的生理功能[2]。這些特點(diǎn)使大豆肽在保健食品中的應(yīng)用具有廣泛前景，因此，大豆蛋白水解生產(chǎn)大豆多肽是大豆深加工的一個(gè)重要方向[2]。將大豆蛋白質(zhì)水解還可以改善大豆蛋白質(zhì)的品質(zhì)，進(jìn)一步改善其溶解性、起泡性等功能特性，促進(jìn)大豆蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

大豆多肽的生產(chǎn)主要是利用化學(xué)方法或酶法將大豆蛋白質(zhì)水解而成，其關(guān)鍵技術(shù)是大豆蛋白水解過程的控制。與酸法和堿法相比，酶法水解大豆蛋白水解效率高，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)生毒性物質(zhì)的可能性較?。凰阅壳吧a(chǎn)大多采用酶法[3]。同時(shí)隨著酶反應(yīng)的進(jìn)行，蛋白質(zhì)的分子量逐漸變小，并轉(zhuǎn)化為肽或者氨基酸，其物理性狀及機(jī)能特性都發(fā)生明顯變化。但在酶解過程中普遍存在難以精確控制、水解度較低且不穩(wěn)定等問題，阻礙了大豆肽產(chǎn)品的研發(fā)和應(yīng)用[4-5]。因此，對(duì)其水解過程進(jìn)行深入研究有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究是利用諾維信堿性蛋白酶，通過單因素試驗(yàn)得到酶水解的較優(yōu)水解工藝，期待能提供技術(shù)參考。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

大豆分離蛋白購(gòu)自平頂山天晶植物蛋白有限責(zé)任公司；蛋白酶采用諾維信公司的堿性蛋白酶（Alcalase）和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶（Flavourzyme）；茚三酮、氯化亞錫、磷酸鈉、氫氧化鈉等試劑均為分析純。

HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇榮華儀器制造有限公司；WFJ2000型分光光度計(jì)：上海尤尼柯儀器公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；pHS-3C精密計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；KDN凱氏定氮儀，XHL-16C數(shù)控硝化爐：上海新嘉電子有限公司；芬蘭可調(diào)式移液器；BSA224S電子分析天平：北京賽多利思科技有限公司；ZWFR-211數(shù)控?fù)u床：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2方法

1.2.1樣品總氮的測(cè)定

總氮的測(cè)定方法采用采用GB/T 6432-1994《飼料中粗蛋白測(cè)定方法》，大豆分離蛋白的水解度選用分光光度法。

1.2.2大豆蛋白水解的測(cè)定

大豆蛋白水解的測(cè)定采用校正后的茚三銅比色法。茚三酮與α-氨基酸發(fā)生反應(yīng)，生成藍(lán)色物質(zhì)，這種藍(lán)色物質(zhì)在570 nm附近有最大吸收，并且藍(lán)色物質(zhì)的顏色深淺和氨基酸含量成正比[6]。茚三酮溶液配制：2 g茚三酮加入100 mL蒸餾水，溶解，放棕色瓶中保存，應(yīng)每次使用前配制。

1.2.3完全水解蛋白液的制備

取大豆蛋白25 mg，放入反應(yīng)瓶中加入25 mg，6 mol/L鹽酸，擰緊瓶蓋，100℃水解24 h，冷卻，過濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至0.5 mL左右，加蒸餾水，用1 mol/L NaOH中和至中性（pH 6），定容至25 mL。

1.2.4工作曲線的繪制

取完全水解液0.1mL～0.8mL于25mL比色管中，蒸餾水稀釋至2 mL，加pH為8的緩沖溶液0.5 mL，茚三銅溶液0.5 mL，沸水浴加熱16 min，冷卻，蒸餾水稀釋至10 mL。570 nm下測(cè)光密度，以蒸餾水為參比。另取25 mg蛋白質(zhì)，加水25 mL，振蕩均勻后過濾，取相應(yīng)體積的濾液，按上述方法測(cè)光密度值。以相同體積樣品的光密度之差與蛋白質(zhì)含量做工作曲線。結(jié)果見圖1。

圖1完全水解液蛋白濃度與OD值關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of relationship between concentration of complete hydrolysis protein and the OD

1.2.5水解度的測(cè)定

取水解后滅酶的水解液1 mL，稀釋至100 mL，過濾后取濾液2 mL，分別加pH8的緩沖溶液0.5 mL和茚三銅溶液0.5 mL，沸水浴加熱16 min，冷卻，用蒸餾水稀釋至10 mL，在570 nm下測(cè)光密度，以蒸餾水做參比。另取相同濃度未水解蛋白溶液2 mL，按上述方法測(cè)光密度，以二者光密度之差從工作曲線上查蛋白質(zhì)含量，按下式計(jì)算水解度：

DH/%=（A/1 000×w）×V1×（100/V2）×100

式中：A為標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的蛋白質(zhì)的mg數(shù)；w為稱樣重，g；V1為水解液的總體積，mL；V2為顯色時(shí)所用稀釋液的體積，mL。

1.2.6酶解工藝流程

大豆分離蛋白→加水配制為一定濃度→加磷酸緩沖液調(diào)pH→95℃水浴20 min→加酶水解→沸水浴15 min滅酶→3 000 r/min離心10 min→取上清液測(cè)定水解度

1.2.7風(fēng)味酶水解時(shí)間對(duì)大豆肽苦味的影響

取堿性蛋白酶酶解后水解液，加入風(fēng)味酶，50℃條件下分別水解1 h~8 h，評(píng)價(jià)苦味。水解液經(jīng)過梯度稀釋后直到達(dá)到不苦的稀釋度，記錄作為苦味值。稀釋度越高，說明苦味值越高。苦味評(píng)定方法：感官評(píng)定時(shí)，評(píng)定員用蒸餾水漱口之后，取評(píng)定液2 mL~3 mL置于口中，10 s后吐出，確認(rèn)苦味強(qiáng)度，重復(fù)上述步驟測(cè)定另一樣品苦味強(qiáng)度，比較不同樣品的苦味強(qiáng)度差異。須取五人次評(píng)定的結(jié)果綜合考量。

1.2.8雙酶水解液的SDS-PAGE電泳及液相色譜法檢測(cè)肽分子量分布

將底物濃度為8 %，酶底物比2 %，pH9.0，55℃條件下，不同水解時(shí)間的蛋白水解液在12 % SDS-PAGE膠中電泳，檢測(cè)不同時(shí)間水解后肽的分子量分布情況。將經(jīng)過堿性蛋白酶和風(fēng)味酶雙酶在最佳條件下水解后，100℃加熱10 min使蛋白酶徹底失活，8 000 r/min，4℃下離心15 min，去除未水解的大豆蛋白和其它非水溶性物質(zhì)得到混合肽，經(jīng)冷凍干燥得到大豆肽粉末。按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)JY/T 024-1996《高效液相色譜法通則》方法和條件對(duì)肽粉進(jìn)行液相色譜檢測(cè)肽分子量的分布[7]。

2　結(jié)果

2.1 Alcalase加酶量對(duì)蛋白水解度的影響

在底物濃度一定的條件下，研究加酶量的高低對(duì)大豆分離蛋白水解的影響。用pH 7.0磷酸鈉溶液配制質(zhì)量濃度為2 %的大豆分離蛋白，在95℃下預(yù)處理20 min。分別加入與底物濃度體積百分?jǐn)?shù)為0.4 %~ 2.0 %的Alcalase蛋白酶。55℃水浴中酶解2 h后，沸水浴中滅酶10 min，取1 mL蛋白水解液測(cè)其水解度。結(jié)果見圖2所示。

圖2加酶量對(duì)大豆分離蛋白水解度的影響Fig.2 Effect of enzyme/substrate ratio on the DH of soybean protein isolate（SPI）

由圖2可以看出，隨著酶用量的增加，蛋白液的水解度升高。當(dāng)酶的用量達(dá)到酶底物比為2 %時(shí)，蛋白液的水解度最大。

2.2大豆分離蛋白濃度對(duì)水解度的影響

為研究大豆分離蛋白濃度對(duì)水解度的影響，分別配置2 %、4 %、6 %、8 %、10 %的大豆蛋白溶液，相同預(yù)處理?xiàng)l件，pH7.0，酶底物比為2.0 %、酶解溫度55℃、酶解2.0 h后，測(cè)定水解度，結(jié)果見圖3所示。

圖3大豆分離蛋白濃度對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of SPI concentration on the DH of SPI

由圖3可以看出，隨著濃度的繼續(xù)增大水解率呈逐漸上升趨勢(shì)。底物濃度超過8 %時(shí)，底物黏稠度增加，不利于底物的溶解，因此蛋白酶水解最佳底物濃度選定為8 %。

2.3溫度對(duì)水解度的影響

配置溶液濃度為8 %大豆分離蛋白溶液。預(yù)處理同上。酶底物比為2.0 %，pH7.0條件下，分別在35℃～75℃的水浴中加熱水解2 h，之后在沸水浴中滅酶10 min，分別取1 mL測(cè)水解度。結(jié)果如圖4。

圖4溫度對(duì)水解度的影響Fig.4 Effect of temperature on the DH of SPI

可以看出，在55℃時(shí)蛋白液的水解率最高，故蛋白酶水解最適溫度為55℃。

2.4水解時(shí)間對(duì)水解度的影響

配置溶液濃度為8 %大豆分離蛋白溶液。預(yù)處理同上。pH7.0，酶底物比為2.0 %、酶解溫度55℃條件下，分別水解1 h~7 h，在沸水浴中滅酶10 min，分別取1 mL測(cè)水解度。結(jié)果如圖5所示。

圖5水解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.5 Effect of hydrolysis duration on the DH of SPI

由圖5可以看出，蛋白的水解率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。但達(dá)到一定的時(shí)間后其上升趨勢(shì)平緩，綜合考慮到能耗、生產(chǎn)周期及防止水解液變質(zhì)等因素，以水解時(shí)間4 h為宜。

不同水解時(shí)間大豆蛋白水解液的SDS-PAGE電泳結(jié)果見圖6。

圖6不同水解時(shí)間大豆蛋白水解液的SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.6 SDS-PAGE analysis of different hydrolysis duration products of SPI

從圖6可以看出，在水解1 h時(shí)，大部分蛋白已經(jīng)水解成小分子肽，分布在<18 kDa范圍內(nèi)，而隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，大豆肽條帶逐漸變淡，分子量分布逐漸變小，說明大部分蛋白變成在該電泳條件下無法檢測(cè)到的小肽。

2.5 pH對(duì)水解度的影響

分別用磷酸緩沖液配置pH7.0~12.0的大豆蛋白溶液。預(yù)處理同上。控制條件為：酶底物比2 %，大豆分離蛋白濃度8 %，溫度為55℃水浴中水解4 h，沸水浴中滅酶10 min，分別取1 mL測(cè)水解度。為觀察在水解過程中，水解液中pH的變化趨勢(shì)，從而確定pH對(duì)水解過程的影響，在水解過程中每隔0.5 h取樣測(cè)定pH。結(jié)果如圖7、圖8所示。

圖8蛋白水解液中pH變化趨勢(shì)Fig.8 Pattern of pH during dehydrogenase

由圖7可以看出，pH7～pH9時(shí)，大豆分離蛋白水解度隨著pH的增大而增大，當(dāng)pH為9～10時(shí)，水解度達(dá)到最大。但在達(dá)到pH 11時(shí)開始下降。這說明蛋白酶的活性在pH時(shí)最大，環(huán)境pH會(huì)影響酶分子的構(gòu)象和酶分子及底物分子的解離狀態(tài)，從而影響酶的活性和酶促反應(yīng)速度。

為了檢測(cè)水解過程中溶液pH的變化趨勢(shì)，在初始pH分別為7，8，9時(shí)，每隔0.5 h取樣測(cè)定pH，我們發(fā)現(xiàn)，在水解0.5 h時(shí)，3個(gè)不同起始pH的水解液pH值均迅速下降，并隨著水解的進(jìn)行，pH逐漸趨近相同，最后穩(wěn)定在pH7左右。初始pH為7時(shí)，由于酸性蛋白溶液對(duì)pH的影響較大，使pH迅速降低到pH6左右，此時(shí)的pH環(huán)境可能嚴(yán)重影響到堿性酶的活性，因此，最適初始pH在9~10之間。

2.6風(fēng)味酶脫苦條件的研究

在pH9.0，酶底物比為2.0 %、酶解溫度55℃條件下，水解4 h的蛋白水解液，pH調(diào)整到4.5，與風(fēng)味酶在50℃條件下反應(yīng)不同時(shí)間，品嘗大豆多肽反應(yīng)前后苦味變化，結(jié)果見表1。

表1風(fēng)味酶水解時(shí)間與苦味值的關(guān)系Table 1 The relationship of Flavourzyme-catalyzed hydrolysis time and bitterness

表明風(fēng)味酶作用時(shí)間為1 h時(shí)對(duì)脫苦有明顯效果，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，苦味值逐漸變大，在繼續(xù)水解超過4 h后苦味值又下降并穩(wěn)定下來。因此，風(fēng)味酶作用時(shí)間可以維持1 h即可達(dá)到脫苦的效果。

2.7雙酶水解后大豆肽分子量分布研究

在最佳水解條件下雙酶法水解大豆蛋白，取水解液用SDS-PAGE方法檢測(cè)大豆肽的分子量分布，結(jié)果見圖9。

圖9大豆蛋白在最佳水解條件下水解液的SDS-PAGE分析Fig.9 SDS-PAGE analysis of hydrolysis products of SPI

圖9表明，水解前高分子量的大豆蛋白完全水解，水解后可以觀察到的肽主要分布于14 kDa附近，但更小的肽分子量在12 %的膠中無法檢測(cè)到。因此，我們采用HPLC的方法檢測(cè)肽分子量分布。結(jié)果表明，大豆水解后獲得的肽分子量主要分布在300 Da~1 000 Da范圍。占總蛋白量的54.2 %。而小于1 000 Da以下的肽占總量的80.3 %。2 000 Da以下的肽含量占91.5 %。5 000 Da以上的只占1.9 %。

3　結(jié)論

通過對(duì)堿性蛋白酶對(duì)大豆蛋白的水解條件的探索，蛋白液水解時(shí)的濃度固定在8 %時(shí)有利于水解的進(jìn)行。通過單因素試驗(yàn)得出蛋白液的水解最佳條件：蛋白液的濃度為8 %、酶底物比為2 %、溫度為55℃、水解時(shí)間為4 h、pH為9。試驗(yàn)結(jié)果得出的大豆分離蛋白的水解率可達(dá)到為30.0 %左右。

當(dāng)前對(duì)肽的吸收與生理作用的研究認(rèn)為，二、三肽能被完整吸收。也有研究發(fā)現(xiàn)四肽、五肽甚至六肽都能被動(dòng)物直接吸收[7]。具有活性的大豆肽以3~6個(gè)氨基酸組成的小分子肽為主，分子量在1 000 Da以下。本研究結(jié)果獲得的大豆肽分子量小于1 000 Da以下的肽占總量的80.3 %，因此具有較好的吸收性和生理功能。

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Study on the Soybean Peptides via Hydrolysis by Two Enzymes and the Optimization of Process

KE Tao1，HUANG Ya-nan2，PANG Zhen-ling1，GONG Ting-ting1，WANG Xi1，LI Pan-xin2，JIA Chun-yang1，GUO Jin-lu1，CHI Ting-ting1，JIANG Yu1，LI Wen-jin1
（1. College of Life Science and Technology，Nanyang Normal University，Nanyang 473061，Henen，China；2. Henan Province Nanjiecun Group Limited Company，Linying 462600，Henen，China）

Abstract：Flavourzyme and alcalase were used for hydrolysis of the soybean protein and the properties of obtained peptides were examined here. The optimum conditions of the hydrolysis of the soybean protein were gotten by single factor experiment. For the alcalase-catalyzed hydrolysis，the optimum temperature，substrate concentration，ratio of Alcalase to substrate，pH value and time were 55℃，8 %，2 %，9.0~10.0 and 4 h，respectively，and the reaction time and temperature for the subsequently performed flavourzyme-catalyzed hydrolysis，were 50℃，and 1h，respectively. The molecular weights of achieved oligo-peptide were lower than 1 000 D and predominated（80.3 %）. This research can be helpful to the application of hydrolysis of soy protein.

Key words：soybean protein lsolated；alcalase；flavourzyme；soybean peptides；process optimization

收稿日期：2014-09-28

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.023

*通信作者

作者簡(jiǎn)介：柯濤（1970—），女（漢），副教授，博士，主要從事生物工程與食品研究。

基金項(xiàng)目：河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目基礎(chǔ)研究計(jì)劃（13A180809）；河南省科技廳攻關(guān)項(xiàng)目（112102310093）；河南省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2011B180039）