六盤水野生蕨菜多糖的生物活性研究

方玉梅，王毅紅，張萍，譚萍，王盼（六盤水師范學(xué)院，貴州水城553004）

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六盤水野生蕨菜多糖的生物活性研究

方玉梅，王毅紅，張萍，譚萍，王盼
（六盤水師范學(xué)院，貴州水城553004）

摘要：采用紙片法測定其抑菌作用，并同時采用水楊酸比色法和DPPH法測定其抗氧化能力，來評價六盤水野生蕨菜多糖的生物活性。結(jié)果表明：蕨菜多糖提取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均有抑菌作用。不同濃度的蕨菜多糖對清除DPPH自由基和抑制·OH都有明顯的效果，且在一定的濃度范圍內(nèi)，蕨菜多糖的濃度與DPPH自由基的清除率和·OH的抑制率呈正相關(guān)。為六盤水野生蕨菜資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

關(guān)鍵詞：蕨菜；多糖；抑菌；DPPH·；·OH

蕨菜，別名拳頭菜、如意菜、龍頭菜等，屬于蕨科。喜生于淺山區(qū)向陽地塊，多分布于稀疏針闊混交林。其食用部分是未展開的幼嫩葉芽[1]。農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)及食品營養(yǎng)學(xué)等方面的研究結(jié)果顯示，蕨菜的某些有效成分能擴(kuò)張血管，降低血壓；粗纖維能促進(jìn)胃腸蠕動，具有下氣通便的作用；蕨菜還具有清熱解毒、殺菌清炎、補(bǔ)脾益氣、強(qiáng)健機(jī)體、增強(qiáng)抗病能力保健功能，為某些疾病問題的解決提供了更簡便有效的新途徑[2]。

隨著食品營養(yǎng)學(xué)的不斷發(fā)展，人們更加關(guān)注植物性來源的非傳統(tǒng)營養(yǎng)素，并試圖從植物中尋找生理活性物質(zhì)來降低、緩解、解決呈不斷上升趨勢的各種現(xiàn)代社會居民退行性疾病問題。研究表明植物多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、降血糖、刺激造血等多種生物學(xué)功效，而且對機(jī)體幾乎沒有毒性，故對植物多糖生物學(xué)功效的研究愈來愈引起國內(nèi)外藥理學(xué)家、生物學(xué)家和化學(xué)家們的興趣，它已成為當(dāng)代生物學(xué)的熱門領(lǐng)域[3-4]。

蕨菜作為一種野生植物資源，生長在深山叢林之中，沒有工業(yè)排放“三廢”污染，也沒有現(xiàn)代工業(yè)產(chǎn)品造成的農(nóng)藥污染，是一顆天然無公害的綠色珍珠，常年埋沒在高山深谷內(nèi)，屬于天然無公害綠色食品[5]。近年來，隨著野生資源的開發(fā)利用，對蕨菜的引栽加工以及一般的營養(yǎng)成分有了一些報道，但多見報道的是氨基酸、礦物質(zhì)、維生素及次生代謝物質(zhì)（生物類黃酮）等，而對蕨菜多糖的研究也僅見于含量測定和成分分析。但是蕨菜中次生代謝物質(zhì)的含量畢竟較少，而多糖是初生物代謝產(chǎn)物，其含量較生物類黃酮要大得多，如果蕨菜多糖也有一定的抗氧化作用和抑菌作用，則蕨菜將具有很大的醫(yī)療保健價值。

1儀器與試劑

1.1主要原料及試劑

原料：蕨菜，采自六盤水石龍。

試劑：無水葡萄糖、FeSO·47H2O、石油醚、濃硫酸、水楊酸、鹽酸、過氧化氫、苯酚、無水乙醇、鋁片、碳酸氫鈉、牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂，均為市售國產(chǎn)分析純；二苯代苦味酰自由基（DPPH）為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2儀器

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；sartoriusBS110S電子天平：北京賽多利斯儀器有限公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋、FW80型高速萬能粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；LC-600B型數(shù)控超聲波清洗機(jī)（總功率600 W）：濟(jì)寧市中區(qū)魯超儀器廠；202A-3型恒溫干燥箱：上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠；TGL-16G型離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；LDZX-50KBS高壓滅菌鍋：上海宜川儀表廠；HH.B11.420-BS-Ⅱ電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1F超凈工作臺：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

2　方法

2.1蕨菜多糖樣品的制備

2.1.1蕨菜的前處理及脫脂

將采來的新鮮蕨菜洗凈置于調(diào)至65℃的恒溫干燥箱中進(jìn)行烘干處理，徹底脫水后用粉碎機(jī)粉碎成粉末，過60目篩，然后稱取200 g蕨菜干粉于1 000 mL燒杯中，再量取400 mL石油醚加入其中，放置24 h進(jìn)行脫脂，24 h后將蕨菜粉末過濾，然后將蕨菜粉末鋪在大濾紙上待其干燥，將其盛入試劑瓶中放入恒溫干燥箱備用。

2.1.2蕨菜多糖的制備及含量的測定

2.1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[6]

精確稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖0.1000 g，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀至刻度，搖勻。精確吸取上述溶液1.0 mL，置50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度。

精確量取0.500 0 mg/mL葡萄糖溶液0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 mL，分別置于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，配成不同濃度的對照品系列溶液。于485 nm波長處測定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，以濃度（X）為橫坐標(biāo)，得回歸方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.2.2蕨菜多糖含量測定

準(zhǔn)確稱取0.1g蕨菜粉末一份置于干凈標(biāo)號的具塞試管中，按料液比1∶100（g/mL）入10mL蒸餾水，調(diào)節(jié)超聲波清洗機(jī)功率70%（420 W），溫度35℃，提取50 min。然后離心取上清液，將上清液定容至10 mL，備用。

精確吸取3 mL提取液進(jìn)行顯色，以制備的參比液作參比，在485 nm處分別測其吸光度。以上試驗，每一處理3次重復(fù)。之后取吸光度平均值帶入回歸方程，從而求得多糖濃度X。

2.2蕨菜多糖對細(xì)菌的抑制

首先配制好適宜大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基，即牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[7]，配方為：牛肉膏0.5 g、蛋白胨1 g、氯化鈉0.5 g、瓊脂2 g、蒸餾水100 mL、pH 7.0～7.2、滅菌1.05 kg/cm2，22 min。將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌[8]、枯草芽孢桿菌從保藏狀態(tài)恢復(fù)到室溫狀態(tài)。然后在超凈工作臺上按規(guī)范操作將上述菌種分別接種到培養(yǎng)基中，放到35℃恒溫箱中培養(yǎng)，挑選培養(yǎng)基中茁壯的菌落，繼續(xù)接種培養(yǎng)，重復(fù)此步驟2次～3次，得到生長良好的菌落（備用）。

在無菌操作室中將剪好并滅菌的濾紙片放入多糖提取液和無菌水中，各9片（防止操作失誤，可多放），浸泡1 h。把已活化的金黃色葡萄球菌接種到已經(jīng)倒好的培養(yǎng)皿中央，接種4皿，在第一、二皿上放入泡有多糖提取液的濾紙片，每皿一片，覆蓋接種菌株，第三皿中放入泡有無菌水的，第四組作對照。按上述步驟將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌接入，放置于35℃恒溫箱中培養(yǎng)。

2.3蕨菜多糖對DPPH自由基的清除[9-11]

DPPH溶液的配制：用分析天平精確稱取44 mg DPPH，并用水乙醇溶解定容于100mL容量瓶中，避光放入冰箱保鮮層保存。用時取配好的DPPH溶液1 mL用無水乙醇稀釋100 mL，此時DPPH濃度為120 μmol/L。

樣品稀釋：分別取蕨菜多糖提取液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別加入蒸餾水0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL，作為不同濃度的蕨菜多糖樣品液，分別標(biāo)示為樣品1～樣品5。

樣液：用移液槍分別取上述不同濃度的0.1 mL蕨菜多糖提取液與3 mL120 μmol/L的DPPH溶液加入同一支比色管中，搖勻，在黑暗中放置30 min，無水乙醇作空白，在517 nm波長處測定其吸光度Ai。

對照：用移液槍取0.1 mL無水乙醇與3 mL 120 μmol/L DPPH溶液加入同一比色管中，搖勻，在黑暗中放置30 min，以無水乙醇作為空白，在517 nm測定其吸光度Ac。

用以下公式計算清除率。

式中：Ac為0.1 mL無水乙醇+3.0 mL DPPH溶液的吸光度；Ai為0.1 mL待測液+3.0 mL DPPH溶液的吸光度。

由上面公式計算清除率，清除率越大抗氧化能力就越強(qiáng)。

2.4蕨菜多糖對·OH的抑制率[12]

按照Smirnof（1989）的方法，通過利用H2O2與FeSO4混合產(chǎn)生·OH，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉·OH，并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該種物質(zhì)在510 nm下有最大吸光值。

反應(yīng)體系：分別在比色管中依次加入2 mmol/L FeSO45 mL，6 mmol/L H2O25 mL，6 mmol/L水楊酸-乙醇15 mL，于37℃水浴鍋中保溫15 min取出，并以超純水作為參比，510 nm下測該溶液吸光度（A0），然后在該比色管中加入1 mL被測定樣品，搖均勻，于37℃水浴鍋中保溫15 min后取出，并以超純水作為參比，510 nm下測該溶液吸光度（Ax）。

由于多糖本身可能存在吸收光值，所以我們做一組對照試驗：在比色管中依次加入2mmol/LFeSO45mL，超純水5 mL，6 mmol/L水楊酸-乙醇15 mL，放入37℃水浴鍋中保溫15 min，然后在該比色管中加入1 mL被測定樣品，搖均勻，于37℃水浴鍋中保溫15 min后取出，并以超純水為參比，510 nm下測該溶液吸光度（Ax0）。

樣品稀釋：分別取蕨菜多糖提取液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別加入蒸餾水0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL，作為不同濃度的蕨菜多糖樣品液，分別標(biāo)示為樣品1～樣品5。

按下面公式計算抑制率：

式中：A0為用蒸餾水代替樣品的對照值；Ax為加樣后的吸光度；Ax0為樣品本身的本底值。

3結(jié)果與分析

3.1蕨菜多糖含量測定結(jié)果

根據(jù)試驗所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=0.070 97X-0.050 23，r=0.999 0。

式中：A為吸光度；X為濃度，mg/mL。

計算樣品液濃度，結(jié)果如下：

在485 nm下測得蕨菜多糖提取液的吸光度Y= 0.473，根據(jù)上述公式計算得到：蕨菜多糖提取液的濃度為245.751 7 μg/mL。

3.2蕨菜多糖對細(xì)菌的抑制

蕨菜多糖對金黃色葡萄球菌的影響見圖1。

圖1蕨菜多糖對金黃色葡萄球菌的抑制圖片F(xiàn)ig.1 Inhibition of picture pteridium revolutum polysaccharide on Staphylococcus aureus

其中a無菌水對照培養(yǎng)皿和b空白對照培養(yǎng)皿金黃色葡萄球菌長勢良好，說明蘸無菌水的紙片對金黃色葡萄球菌的生長無較大的影響，c多糖樣品培養(yǎng)皿中加入蘸有蕨菜多糖的紙片進(jìn)行培養(yǎng)，最終沒有培養(yǎng)出現(xiàn)金黃色葡萄球菌，說明蕨菜多糖對金黃色葡萄球菌的生長有較好的抑制作用。

蕨菜多糖對大腸桿菌的影響見圖2。

圖2蕨菜多糖對大腸桿菌的抑制圖片F(xiàn)ig.2 Inhibition of picture pteridium revolutum polysaccharide on E. Coli

其中a無菌水對照培養(yǎng)皿、b空白對照培養(yǎng)皿大腸桿菌長勢良好，說明蘸有無菌水的紙片對大腸桿菌的生長無較大的影響，c多糖樣品培養(yǎng)皿中加入蘸有蕨菜多糖的紙片進(jìn)行培養(yǎng)，最終沒有培養(yǎng)出現(xiàn)大腸桿菌，說明蕨菜多糖對大腸桿菌有較好的抑制作用。

蕨菜多糖對枯草芽孢桿菌的影響見圖3。

圖3蕨菜多糖對枯草芽孢桿菌的抑制圖片F(xiàn)ig.3 Inhibition of picture pteridium revolutum polysaccharide on Bacillus subtilis

其中a無菌水對照培養(yǎng)皿和b空白對照培養(yǎng)皿枯草芽孢桿菌長勢良好，說明蘸有無菌水的紙片對枯草芽孢桿菌的生長無較大的影響，c多糖樣品培養(yǎng)皿中加入蘸有蕨菜多糖的紙片進(jìn)行培養(yǎng)，沒有培養(yǎng)出枯草芽孢桿菌，說明蕨菜多糖對枯草芽孢桿菌有抑制作用。

綜上所述，在料液比為1∶100（g/mL），超聲波清洗機(jī)功率70 %（420 W），溫度35℃，時間為50 min溫度為60℃的條件下提取出來的蕨菜多糖提取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均有較好的抑菌作用。

3.3蕨菜多糖對DPPH自由基的清除率

由于DPPH在有機(jī)溶劑中是一種比較穩(wěn)定的自由基，呈紫色，而且在517 nm處有強(qiáng)吸收光值，并在有自由基清除劑存在時，DPPH的孤電子被配對，溶液顏色變淺，在517 nm波長處的吸光度也變小，而且這種顏色變淺的程度與配對的電子數(shù)成一定化學(xué)計量關(guān)系。因此，可以通過在517 nm波長處吸光度的測定來評價該色素對DPPH自由基的清除率。

取已稀釋好的蕨菜多糖提取液0.1 mL，測量其對DPPH自由基的清除率，測得Ac=0.732，根據(jù)公式（1）計算清除率，其結(jié)果如表1。

蕨菜多糖對DPPH自由基的清除率見圖4。

圖4蕨菜多糖對DPPH自由基的清除率折線圖Fig.4 Pteridium revolutum polysaccharide on DPPH free radical clearance line chart

由表1和圖4可知，蕨菜多糖提取液對DPPH·具有較好的清除作用，且在提取液濃度為49.150 3 μg/mL 到245.751 7 μg/mL范圍內(nèi)，蕨菜多糖的濃度與DPPH自由基清除效果呈正相關(guān)，在濃度為245.751 7 μg/mL時，清除效果最好，達(dá)到28.42 %。

3.4蕨菜多糖對·OH抑制作用的效果

取已稀釋好的蕨菜多糖溶液，測量其對·OH抑制作用，根據(jù)公式（2）計算抑制率，其結(jié)果如表2。

表2蕨菜多糖對·OH抑制作用的效果Table 2 Pteridium revolutum polysaccharide of·OH inhibition effect

蕨菜多糖對·OH抑制效果見圖5。

從表2和圖5可以看出蕨菜多糖提取液對羥基自由基也有抑制作用，且在提取液濃度為49.1503μg/mL 到245.751 7 μg/mL范圍內(nèi)，是隨著濃度的增大，抑制率也增大，呈正相關(guān)，當(dāng)濃度為245.751 7 μg/mL時，抑制率達(dá)到最大且為60.23 %。

圖5蕨菜多糖對·OH抑制作用的效果Fig.5 Pteridium revolutum polysaccharide of·OH inhibition effect

4　結(jié)論

試驗對通過超聲波提取的蕨菜多糖溶液的抗氧化性和抑菌作用進(jìn)行研究。結(jié)果表明蕨菜多糖提取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均有抑菌作用，這與唐巧玉等[13]（2008）關(guān)于蕨菜多糖抑菌能力的研究結(jié)果一致。且不同濃度的蕨菜多糖對清除DPPH自由基和抑制·OH都有明顯的效果，且在一定的濃度范圍內(nèi)，蕨菜多糖的濃度與DPPH自由基的清除率和·OH的抑制率呈正相關(guān)。這為六盤水野生蕨菜資源的功能研究及進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

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Study on Biological Activity of Polysaccharide in Liupanshui Wild Pteridium Revolutum

FANG Yu-mei，WANG Yi-hong，ZHANG Ping，TAN Ping，WANG Pan
（Liupanshui Normal College，Shuicheng 553004，Guizhou，China）

Abstract：The experimental determination of the antimicrobial effected by slip method，and the antioxidant ability by salicylic acid colorimetric method and DPPH method，to evaluate the biological activity of polysaccharide in Liupanshui wild pteridium revolutum. The results showed that：the polysaccharide in Liu Panshui wild pteridium revolutum had bacteriostasis to Staphylococcus aureus，Escherichia coli and Bacillus subtilis. Different concentrations of polysaccharide in Liupanshui wild pteridium revolutum had obvious effect scavenging rate of DPPH free radical and inhibition rate of·OH. And in a certain range of dilution，scavenging rate of DPPH free radical and inhibition rate of·OH，was positively related to concentration of polysaccharide in Liupanshui wild pteridium revolutum. To provide reference for further development and utilization of polysaccharide in Liupanshui wild pteridium revolutum.

Key words：pteridium revolutum；polysaccharide；bacteriostasis；DPPH free radical；·OH

收稿日期：2014-09-23

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.009

作者簡介：方玉梅（1982—），女（布依），副教授，碩士研究生，從事植物生理學(xué)與分子生物學(xué)的教學(xué)與研究。

基金項目：六盤水師范學(xué)院自然科學(xué)科研計劃（lpssy201204）；植物學(xué)省級重點支持學(xué)科（黔學(xué)位合字ZDXK[2014]24號）