祁州漏蘆對D-氨基半乳糖所致小鼠急性肝損傷的保護作用

金明，高峰，金梅花，全吉淑（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林延吉133002）

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祁州漏蘆對D-氨基半乳糖所致小鼠急性肝損傷的保護作用

金明，高峰，金梅花，全吉淑*
（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林延吉133002）

摘要：研究祁州漏蘆提取物對D-氨基半乳糖（GalN）誘發(fā)的小鼠急性肝損傷的保護作用。將小鼠隨機分為正常組、模型組、聯(lián)苯雙脂組、祁州漏蘆乙醇提取物組、祁州漏蘆正丁醇層萃取物組和水層萃取物組。每日給藥1次，連續(xù)7 d。實驗?zāi)┢?，腹腔注射GalN建立急性肝損傷模型。比色法檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）以及肝臟誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、超氧化物歧化酶（SOD）水平。祁州漏蘆不同溶劑層提取物顯著降低GalN致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性（P＜0.05）；降低肝組織iNOS和NO水平，降低肝線粒體MDA水平（P＜0.05）；升高肝線粒體GPx、SOD活性和GSH水平（P＜0.05）。祁州漏蘆提取物對GalN致急性肝損傷具有保護作用，其機制可能與其抗氧化和抗炎作用有關(guān)。

關(guān)鍵詞：祁州漏蘆；D-氨基半乳糖；肝損傷；抗氧化

祁州漏蘆（Rhaponticum uniflorum（L.）DC）為多年生草本，分布于我國東北、內(nèi)蒙古、陜西、河北、甘肅等地區(qū)。具有清熱解毒、排膿消腫、通乳的功能，主治乳腺炎、腮腺炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、淋巴結(jié)結(jié)核、痔瘡等[1]。研究表明，祁州漏蘆具有抗氧化、抗衰老、抗炎、增強免疫及抗腫瘤等藥理作用[2-4]。近年來，祁州漏蘆在肝病防治中的應(yīng)用也越來越受關(guān)注。研究表明，祁州漏蘆對四氯化碳以及對乙酰氨基酚所致化學(xué)性肝損傷具有保護作用[5-6]。本文將研究祁州漏蘆不同溶劑萃取物對D-氨基半乳糖（GalN）致小鼠急性肝損傷的干預(yù)作用，探討祁州漏蘆的保肝作用機制。

1材料與方法

1.1材料

實驗動物選用雄性昆明小鼠：延邊大學(xué)實驗動物中心[體重22 g~26 g，合格證號：SCXK（吉）2008-0005]。GalN：（批號：085k1321）Sigma公司；聯(lián)苯雙脂（BFD）滴丸（批號：20091024）：北京協(xié)和藥廠；兔誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）多克隆抗體：美國Abcam公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、一氧化氮合酶（NOS）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）及蛋白質(zhì)測試盒：購于南京建成科技有限公司。

3-30K型離心機：德國Sigma公司；S22PC型分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DYY-12型電泳儀、DYCP-31D型電泳槽、DYCZ-24DN型電泳儀：北京六一儀器廠；Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽：美國Bio-Rad公司；UVP凝膠成像分析儀：美國UVP公司。

1.2方法

1.2.1祁州漏蘆的提取工藝

祁州漏蘆采自吉林省長白山，經(jīng)延邊大學(xué)藥學(xué)院劉勇鎮(zhèn)教授鑒定為祁州漏蘆Rhaponticum uniflorum （L.）DC。將祁州漏蘆切碎后，用90%乙醇回流提取2h，共3次，合并濾液，經(jīng)減壓濃縮即得祁州漏蘆乙醇提取物（RUEE），得率為8.7 %。將乙醇提取物加水溶解，用等體積乙酸乙酯和正丁醇萃取，得正丁醇層萃取物（RUBF）和水層萃取物（RUAF）[4]。

1.2.2模型的復(fù)制與分組、給藥

將小鼠隨機分為6組，即正常組、模型組、RUEE組、RUBF組、RUAF組和BFD（聯(lián)苯雙酯）組（陽性對照組）。治療組小鼠按200 mg/（kg·d）劑量灌胃給藥，BFD組按100 mg/（kg·d）劑量灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7 d。藥物的劑量選擇主要根據(jù)課題組前期研究及預(yù)實驗結(jié)果而定的[2，5-6]。正常組及模型組小鼠則灌胃等體積生理鹽水。末次給藥1h后，除正常組腹腔注射等體積生理鹽水外，其余各組小鼠一次性腹腔注射給予500 mg/kg GalN。造模期間禁食，不禁水。

1.2.3血清生化指標的檢測

造模24 h后處死小鼠，眼球取血，分離血清，檢測小鼠血清ALT、AST活性。

1.2.4肝組織抗炎、抗氧化指標及DNA損傷的檢測

常規(guī)方法制備肝線粒體。肝組織用磷酸鹽緩沖鹽水在冰浴中均質(zhì)處理，600 r/min離心取上清為肝勻漿。肝勻漿在10 000 r/min離心，取沉淀懸浮于磷酸鹽緩沖液中，用超聲波處理，在8 000 r/min離心得肝線粒體液。按照各測試盒操作方法測定iNOS、NO、MDA、GSH、GPx、SOD及蛋白質(zhì)水平。

1.2.5統(tǒng)計學(xué)處理

2結(jié)果與分析

2.1祁州漏蘆提取物對肝損傷小鼠血清ALT、AST活性的影響

血清ALT和AST是評價急性肝損傷程度的常用指標，見表1。

表1祁州漏蘆提取物對血清ALT和AST活性的影響Table 1 Effect of Rhaponticum uniflorum extracts on serum ALT and AST

表1祁州漏蘆提取物對血清ALT和AST活性的影響Table 1 Effect of Rhaponticum uniflorum extracts on serum ALT and AST

注：-表示無劑量；與正常組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05。

組別　　劑量/（mg/kg）　ALT/（μmol/s·L）　AST/（μmol/s·L）正常組　?。?.65±0.63　4.96±0.97模型組　?。?5.3±1.94*　10.4±1.45*RUEE組　200　10.8±1.63#　7.5±1.34#RUBF組　200　10.1±1.85#　6.4±1.29#RUAF組　200　11.6±2.02#　7.7±1.42#BFD組　100　9.23±1.27#　6.1±1.23#

由表1可見，與正常組比較，模型組小鼠血清ALT、AST活性升高（P＜0.05）。與模型組比較，RUEE、RUBF和RUAF組小鼠血清ALT和AST活性降低（P＜0.05）。單純從轉(zhuǎn)氨酶指標來看，RUAF與RUBF的保肝活性差不多，較弱于BFD。

2.2祁州漏蘆提取物對肝損傷小鼠肝線粒體GPx、SOD、GSH和MDA水平的影響

GalN經(jīng)不同途徑導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)破壞，引起細胞內(nèi)鈣離子增加，抑制線粒體呼吸功能，產(chǎn)生氧自由基和氧化應(yīng)激。結(jié)果見表2。

表2祁州漏蘆提取物對肝線粒體GPx、SOD、GSH和MDA水平的影響Table 2 Effect of Rhaponticum uniflorum extracts on GPx，SOD and GSH of liver mitochondria

表2祁州漏蘆提取物對肝線粒體GPx、SOD、GSH和MDA水平的影響Table 2 Effect of Rhaponticum uniflorum extracts on GPx，SOD and GSH of liver mitochondria

注：-表示無劑量；與正常組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05。

組別　　劑量/ （mg/kg）GPx/ （U/mg）SOD/ （U/mg）GSH/ （nmol/mg）MDA/ （nmol/mg）正常組　　－　187.1±28.3 65.3±10.6 38.7±4.3　 2.31±0.42模型組　?。?30.3±20.4*40.2±8.5*24.4±3.7*3.57±0.75*RUEE組　200　 168.5±20.3#49.8±8.3#31.6±5.4#2.68±0.52#RUBF組　200　 175.2±24.9#51.8±9.2#34.2±6.1#2.69±0.46#RUAF組　200　 153.4±23.4#53.7±10.3#32.7±4.7#2.53±0.59#BFD組　100　 192.1±25.6#60.4±10.4#34.5±5.6#1.28±0.37#

由表2可見，與正常組比較，模型組小鼠肝線粒體GPx、SOD、GSH水平降低（P<0.05），MDA含量增高（P<0.05）；與模型組比較，RUEE組、RUBF組和RUAF組肝線粒體GPx、SOD、GSH含量增高（P<0.05），MDA水平降低（P<0.05）。

2.3祁州漏蘆提取物對急性肝損傷小鼠肝組織iNOS 及NO水平的影響

祁州漏蘆提取物對肝組織iNOS蛋白水平的影響結(jié)果見表3和圖1。

表3祁州漏蘆提取物對肝組織iNOS活性和NO水平的影響Table 3 Effect of Rhaponticum uniflorum extracts on hepatic iNOS and NO

表3祁州漏蘆提取物對肝組織iNOS活性和NO水平的影響Table 3 Effect of Rhaponticum uniflorum extracts on hepatic iNOS and NO

注：-表示無劑量；與正常組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05。

組別　　劑量/（mg/kg）　iNOS/（U/mg）　NO/（μmol/g）正常組　?。?.25±0.07　2.7±0.6模型組　?。?.64±0.12*　 7.8±1.1*RUEE組　200　0.37±0.08#　 4.6±0.9#RUBF組　200　0.38±0.07#　 5.5±1.1#RUAF組　200　0.35±0.06#　 5.2±1.0#BFD組　100　0.31±0.07#　 4.6±0.7#

圖1祁州漏蘆提取物對肝組織iNOS蛋白水平的影響Fig.1 Effect of Rhaponticum uniflorum extracts on protein expression of iNOS in liver注：與正常組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05。

與正常組比較，模型組小鼠肝組織iNOS蛋白表達及活性顯著升高（P＜0.05）；NO水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，RUEE組、RUBF組和RUAF組小鼠肝iNOS蛋白表達和活性、以及NO水平顯著降低（P＜0.05）。

3　討論

GalN可造成肝彌漫性壞死和炎癥，其所致急性肝損傷模型與人類病毒性肝炎的病理學(xué)變化相似，是篩選保肝藥物和研究藥物作用機制的經(jīng)典動物模型。GalN是肝細胞磷酸尿嘧啶核苷的干擾劑，通過競爭生成二磷酸尿苷半乳糖使磷酸尿苷耗竭，導(dǎo)致肝細胞代謝障礙，造成肝臟彌漫性壞死和炎癥，其肝臟病理和生化改變與人類病毒性肝炎極為相似，是保肝、降酶新藥藥理實驗首選實驗動物模型[7]。GalN經(jīng)不同途徑導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)破壞，引起細胞內(nèi)鈣離子增加，抑制線粒體呼吸功能，產(chǎn)生氧自由基。而AST和ALT的活性變化成為最常用的判定藥物護肝作用及藥物抗氧化作用的重要指標。一般認為，ALT活性上升作為肝細胞漿膜損傷的標志，而AST活性作為線粒體損傷的重要指標，因為AST主要來源于線粒體[8-9]。本實驗中，模型組小鼠血清ALT、AST水平升高，而祁州漏蘆萃取物預(yù)處理組小鼠血清ALT、AST活性降低，提示祁州漏蘆萃取物可減輕GalN所致小鼠急性肝損傷程度。在炎癥反應(yīng)中NO大量釋放也被人們關(guān)注和廣泛研究。NO可直接抑制線粒體呼吸，使肝細胞內(nèi)能量代謝障礙而引起肝細胞凋亡和壞死[10]。本實驗結(jié)果表明，GalN處理可增高肝損傷小鼠肝組織iNOS活性和NO水平，而祁州漏蘆萃取物預(yù)處理可降低肝iNOS活性和NO水平，從而減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生。同時，模型組小鼠肝線粒體MDA水平升高，肝線粒體SOD、GPx、GSH水平降低，表明急性肝損傷小鼠肝細胞存在一定程度的氧化應(yīng)激損傷[11]。而祁州漏蘆萃取物預(yù)處理組小鼠肝線粒體MDA水平降低，GSH含量和抗氧化酶活性增高。綜上所述，祁州漏蘆萃取物對GalN所致小鼠急性肝損傷具有保護作用，可通過清除機體內(nèi)自由基和抑制脂質(zhì)過氧化，進而保護肝細胞免受氧化應(yīng)激損傷。其不同萃取物保肝活性相近，這與RUBF的體外抗氧化活性較高于RUAF的結(jié)果不吻合[2]。這可能與其成分的復(fù)雜性、體內(nèi)外抗氧化作用不完全一致有關(guān)。其原因還需進一步研究。

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Protective Effect of Rhaponticum uniflorum on Acute Liver Injury Induced by D-Galactoamine in Mice

JIN Ming，GAO Feng，JIN Mei-hua，QUAN Ji-shu*
（Medical College，Yanbian University，Yanji 133002，Jilin，China）

Abstract：To investigate the protective effect of Rhaponticum uniflorum extracts on liver injury induced by D-galactoamine（GalN）inmice，micewererandomlyassignedtothenormalcontrol，model，bifendate，Rhaponticum uniflorum ethanol extract，as well as the butanol（RUBF）and aqueous fractions of Rhaponticum uniflorum. Animals were treated once daily for 7 days. At the end of the experiment，GalN was given intraperitoneally to the mice of groups，then the alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），inducible nitric oxide synthase（iNOS），nitric oxide（NO），malondialdehyde（MDA），glutathione（GSH），glutathione peroxidase（GPx）and superoxide dismutase（SOD）were detected with the colorimetric method. The results showed that the administration with different solvent fractions of Rhaponticum uniflorum reduced the serum activities of ALT and AST（P＜0.05），decreased hepatic iNOS and NO level，decreased the MDA content and increased GPx，SOD and GSH levels of liver mitochondria in mice with acute liver injury（P＜0.05）. This study showed that Rhaponticum uniflorum extracts had protective effects on acute liver injury induced by GalN in mice，probably via anti-oxidative and anti-inflammatory activities.

Key words：Rhaponticum uniflorum；D-galactoamine；liver injury；anti-oxidative

收稿日期：2014-09-26

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.001

*通信作者：全吉淑（1968—），女（朝鮮），教授，博士，研究方向：中藥藥理學(xué)。

作者簡介：金明（1972—），女（朝鮮），副教授，博士，研究方向：中藥藥理學(xué)。

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（81160539）