19份玉米EMS誘變系的遺傳差異評(píng)價(jià)

石海春,譚義川,夏　偉,李仁飛,余學(xué)杰,柯永培

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,四川 成都　611130;2.四川農(nóng)大正紅生物技術(shù)有限責(zé)任公司,

四川 成都　610213;3.四川省樂山市農(nóng)科院,四川 樂山　614000)

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19份玉米EMS誘變系的遺傳差異評(píng)價(jià)

石海春1,2,譚義川1,3,夏偉2,李仁飛2,余學(xué)杰1,2,柯永培1,2

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,四川 成都611130;2.四川農(nóng)大正紅生物技術(shù)有限責(zé)任公司,

四川 成都610213;3.四川省樂山市農(nóng)科院,四川 樂山614000)

摘要：對(duì)新選的玉米EMS誘變系進(jìn)行遺傳評(píng)價(jià)是對(duì)其展開利用研究的前提。以19份玉米EMS誘變系為試材,利用表型分析和玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法(NY/T1432-2014),研究各誘變系與相應(yīng)基礎(chǔ)試材間的遺傳差異,結(jié)果表明:在考察的20個(gè)性狀中,與基礎(chǔ)試材相比,誘變系K305Y1403、 K305Y1409、K305Y1411和K305Y1415有9個(gè)性狀達(dá)到顯著或極顯著差異;R08Y1425、R08Y1423、R08Y1429分別有17,13,12個(gè)性狀達(dá)到顯著或極顯著差異,與相應(yīng)基礎(chǔ)試材差異較大。40對(duì)SSR引物,平均每對(duì)引物在來源于K305與R08的誘變系中,檢測(cè)出的等位基因個(gè)數(shù)平均分別為3.8,4.2個(gè),擴(kuò)增出的基因型個(gè)數(shù)平均分別為1.90,2.15個(gè);每個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性信息量(PIC)分別為0～0.76和0～0.88,平均PIC分別為0.20和0.28;與基礎(chǔ)材料間的遺傳相似系數(shù)分別為0.790～0.918和0.707～0.884,平均分別為0.862和0.809;各誘變系與相應(yīng)基礎(chǔ)試材的遺傳差異位點(diǎn)數(shù)均在2個(gè)或2個(gè)以上。綜上可知,該19份新選誘變系與相應(yīng)基礎(chǔ)試材間存在真實(shí)的遺傳差異,可繼續(xù)開展其遺傳利用研究。

關(guān)鍵詞：玉米；EMS；誘變系；遺傳差異

不斷拓展玉米種質(zhì)資源基礎(chǔ),改良現(xiàn)有種質(zhì)資源性狀,對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行不斷創(chuàng)新和利用仍是當(dāng)前玉米育種的重要課題[1-5]。前人研究證明,EMS化學(xué)誘變技術(shù)是作為創(chuàng)造作物新種質(zhì)、改良植物農(nóng)藝性狀的常用方法,其特點(diǎn)突變頻率高,且突變體穩(wěn)定,是高效的化學(xué)誘變技術(shù),能有效地誘導(dǎo)突變體的產(chǎn)生[6-11],故加強(qiáng)EMS誘變育種的利用研究有可能突破玉米育種的瓶頸,選育出更加優(yōu)良的自交系和雜交種,供玉米生產(chǎn)應(yīng)用。事實(shí)上,對(duì)新選的誘變系進(jìn)行遺傳評(píng)價(jià)是對(duì)其展開利用研究的前提,具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。通過EMS誘變處理玉米自交系K305和R08的花粉,成功選育出一批新的誘變系,本研究利用表型與SSR標(biāo)記研究各新誘變系與相應(yīng)基礎(chǔ)試材間的遺傳差異,以期為它們的進(jìn)一步利用提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1供試材料

由四川農(nóng)大正紅生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供的玉米自交系K305和R08,及其通過EMS～石蠟油混合體系誘變其花粉選育而成的9，10份M4誘變系。其來源于K305的9份誘變系其代號(hào)分別為K305Y1401、K305Y1403、……、K305Y1415、K305Y1417;來源于R08 的10份誘變系其代號(hào)分別為R08Y1421、R08Y1423、……、R08Y1437、R08Y1439。

1.2田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2014年春季種植自交系K305和R08及其EMS誘變系,4行區(qū),行長(zhǎng)3.5 m,行距0.8 m,窩距0.5 m,每行7窩,每窩定苗2株,種植密度50 000株/hm2,每個(gè)系種植56株,施肥與田間管理同大田生產(chǎn)。

1.3測(cè)定性狀與方法

田間測(cè)定株高、穗位高、葉長(zhǎng)、葉寬、葉面積、葉夾角、雄穗長(zhǎng)、雄穗分枝數(shù)、雄穗主軸長(zhǎng)度、雄穗分支長(zhǎng)度,雄穗分支夾角;室內(nèi)考查穗長(zhǎng)、禿尖長(zhǎng)、穗粗、穗行數(shù)、行粒數(shù)、粒深、百粒質(zhì)量,計(jì)算平均單株產(chǎn)量、出籽率。其中葉面積測(cè)定參照Pearce法[12],出籽率(%)=小區(qū)粒重/小區(qū)穗重×100。運(yùn)用T檢驗(yàn)法分析誘變系與基礎(chǔ)試材的各表型性狀差異[13]。

1.4SSR分子標(biāo)記

參照玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法(中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1432-2014)[14]選用SSR引物,由上海生工生物工程(股份)有限公司,2×Taq MIX試劑盒購(gòu)于成都康迪生物公司。剪取每個(gè)誘變系20株幼苗的幼嫩葉片,采用2×CTAB法提取并純化DNA。PCR反應(yīng)體系為15 μL:2×Taq MIX試劑盒6.5 μL,10 pmol/L SSR前后引物各0.5 μL,50 ng DNA模板(體積為1 μL),ddH2O 6.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性35 s,55～65 ℃退火60 s,72 ℃延伸45 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃最后延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在功率為75 W的6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳1 h后銀染。

1.5SSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)穩(wěn)定且易于辨認(rèn)的差異性條帶,在相同的牽移位置有帶記為“1”,無帶時(shí)記為“0”,缺失記為“9”。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果計(jì)算位點(diǎn)多態(tài)信息量(PIC),PIC=1-∑Pi2,Pi是第i個(gè)等位變異出現(xiàn)的頻率。根據(jù)Nei和Li[15]的公式計(jì)算遺傳相似系數(shù),Nei and Li coefficient=2Nxy/(Nx+Ny)。Nxy是指材料x和y之間共同多態(tài)性位點(diǎn),Nx是指x材料所具有的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù),Ny是指y材料所具有的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)。位點(diǎn)多態(tài)性信息量和遺傳相似系數(shù)的計(jì)算均由NTSYSpc2.1(Version2.11a)軟件完成。遺傳差異位點(diǎn)數(shù)統(tǒng)計(jì)參照標(biāo)準(zhǔn)NY/T1432-2014執(zhí)行[14]。

2結(jié)果與分析

2.1誘變系與其基礎(chǔ)試材間的表型差異

2.1.1來源于自交系K305的誘變系將與其基礎(chǔ)試材間的主要性狀差異結(jié)果列于表1,從中可見,各誘變系均有性狀與自交系K305存在顯著或極顯著差異。具體表現(xiàn)為,誘變系K305Y1403、K305Y1409、K305Y1411和K305Y1415有9個(gè)性狀與K305達(dá)到了顯著或極顯著差異,表型差異明顯;其次是誘變系K305Y1401和K305Y1407有8個(gè)性狀與自交系K305差異顯著或極顯著,表型差異較大;誘變系K305Y1405、K305Y1413和K305Y1417與自交系K305有6個(gè)性狀達(dá)到顯著或極顯著差異,表型差異相對(duì)較小。

2.1.2來源于自交系R08的誘變系將與其基礎(chǔ)試材間的主要性狀差異結(jié)果列于表2,表2中可見,各誘變系均有性狀與原自交系R08存在顯著或極顯著差異。具體表現(xiàn)為,誘變系R08Y1425有17個(gè)性狀與自交系R08達(dá)到了顯著或極顯著差異,表型差異明顯;其次是R08Y1423、R08Y1429、R08Y1437分別有13,12,12個(gè)性狀達(dá)到顯著或極顯著差異,表型差異較大;R08Y1427和R08Y1435有8個(gè)性狀與自交系R08存在顯著或極顯著差異,表型差異相對(duì)較小。

表1　自交系K305與其各EMS誘變新選系的農(nóng)藝性狀比較

注：*.0.05差異水平顯著；**.0.01差異水平顯著。表2同。

Note:*.Significant difference at the 0.05;**.Significant difference at the 0.01,The same as Tab.2.

2.2SSR分子遺傳差異分析

2.2.1遺傳多樣性分析用選取的40對(duì)SSR引物,對(duì)誘變系進(jìn)行同源位點(diǎn)檢測(cè)(表3)。40對(duì)引物在K305與R08誘變新選系中分別檢測(cè)出151,169個(gè)等位變異,每對(duì)引物分別檢測(cè)到2～8,2～7個(gè)等位基因,平均分別為3.8,4.2個(gè);在K305和R08誘變系中分別擴(kuò)增出基因型76,86個(gè),平均分別為1.90,2.15個(gè)。K305誘變系每個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性信息量(PIC)為0～0.76,平均0.20,其中引物umc1125y3位點(diǎn)的PIC值最大,為0.76;R08誘變系每個(gè)位點(diǎn)的PIC值在0～0.88,平均0.28,其中引物bnlg1520K1的PIC值最大,為0.88。

表2　自交系R08與其EMS誘變新選系的農(nóng)藝性狀比較

2.2.2遺傳相似性分析根據(jù)40對(duì)SSR引物擴(kuò)增出的多態(tài)性等位變異,用Nei和Li的公式分別計(jì)算出K305和R08與其相應(yīng)誘變系間的遺傳相似系數(shù)(表4)。從表4中可看出,K305組誘變系與K305的遺傳相似系數(shù)為0.790～0.918,平均0.862;其中誘變系K305Y1417與K305的遺傳相似系數(shù)最小,說明其與K305的遺傳差異最大;誘變系K305Y1407與K305的遺傳相似系數(shù)最大,說明其在分子水平上與K305的遺傳差異相對(duì)較小,其余誘變系與K305的遺傳相似系數(shù)為0.828～0.904。R08與其相應(yīng)誘變系的遺傳相似系數(shù)為0.707～0.884,平均為0.809,其中誘變系R08Y1433與R08的遺傳相似系數(shù)最小,說明其與R08的遺傳差異最大,誘變系R08Y1421與R08的遺傳相似系數(shù)最大,說明其在分子水平上的變異相對(duì)最小;其余誘變系與R08的遺傳相似系數(shù)為0.768～0.862。

表3　SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析

表4　誘變系與其基礎(chǔ)試材間的遺傳相似系數(shù)

2.2.3SSR標(biāo)記差異位點(diǎn)數(shù)分析根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1432-2014統(tǒng)計(jì)誘變系與其相應(yīng)基礎(chǔ)試材在前20對(duì)SSR核心引物位點(diǎn)存在的差異位點(diǎn)數(shù)(表5),其結(jié)果如下:在K305組,誘變系K305Y1411、K305Y1405和K305Y1415分別有6,5,5個(gè)位點(diǎn)存在差異,說明它們與K305在分子水平存在較大的遺傳差異;其次是K305Y1417、K305Y1401、K305Y1403、K305Y1407和K305Y1409分別有4,3,3,3,3個(gè)SSR位點(diǎn)有差異;K305Y1413有2個(gè)SSR位點(diǎn)與K305存在差異,在分子水平上的遺傳差異最小。在R08組,誘變系R08Y1433和R08Y1437均有8個(gè)SSR位點(diǎn)與R08存在差異,是差異最大的誘變系,表明它們與R08在分子水平上存在較大遺傳差異;其次是R08Y1427、R08Y1431、R08Y1423、R08Y1425、R08Y1429、R08Y1435和R08Y1439,分別有7,7,6,5,5,5,5個(gè)SSR位點(diǎn)存在差異;誘變系R08Y1421與R08有4個(gè)SSR位點(diǎn)與R08存在差異,差異最小。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1432-2014,有2個(gè)或2個(gè)以上SSR位點(diǎn)存在差異則判定為不同的自交系,據(jù)此可判定所選的誘變系均為新的自交系。

表5　誘變系與基礎(chǔ)試材間的SSR標(biāo)記差異位點(diǎn)

3討論與結(jié)論

表型性狀分析作為鑒定新選系與基礎(chǔ)試材之間遺傳差異傳統(tǒng)方法,其特點(diǎn)是簡(jiǎn)便有效。刁鈺嬋等[16]、安學(xué)麗等[17]、劉曉麗等[18]、祝麗英等[19]通過表型鑒定,發(fā)現(xiàn)玉米EMS誘變后代在多個(gè)性狀與基礎(chǔ)試材間存在較大的遺傳差異;本研究中,誘變系K305Y1403、 K305Y1409、R08Y1423和R08Y1429等,與其相應(yīng)基礎(chǔ)試材相比,均表現(xiàn)為表型變異較大。說明經(jīng)EMS誘變,可產(chǎn)生表型差異較大的誘變系。

李紅英等[8]、覃鴻妮等[20]用SSR標(biāo)記對(duì)玉米化學(xué)誘變后代檢測(cè),發(fā)現(xiàn)誘變系與基礎(chǔ)試材間存在較大的遺傳差異。本研究表明,誘變系與相應(yīng)基礎(chǔ)試材K305和R08的遺傳相似系數(shù)分別為0.790～0.918和0.707～0.884,平均分別為0.862和0.809,說明自交系R08和K305經(jīng)過EMS誘變后產(chǎn)生了不同程度的變異,與相應(yīng)的誘變系間存在真實(shí)的遺傳差異。在K305組誘變系中,誘變系K305Y1401和K305Y1403與K305在分子水平上的遺傳差異較大;在R08組誘變系中,誘變系R08Y1437與R08在分子水平上的遺傳差異較大。誘變系與相應(yīng)基礎(chǔ)試材間至少存在2個(gè)以上(含2個(gè))位點(diǎn)有差異,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1432-2014[14]可判斷本研究所選誘變系是EMS誘變創(chuàng)造的新種質(zhì)資源。

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Evaluation on Genetic Differences of 19 Maize Mutant Lines Induced by EMS

SHI Haichun1,2,TAN Yichuan1,3,XIA Wei2,LI Renfei2,YU Xuejie1,2,KE Yongpei1,2

(1.Agronomy College,Sichuan Agricultural Universtiy,Chengdu611130,China;2.Sichuan Nongda Zhenghong Bio.Co.,Ltd,Chengdu610213,China;3.Leshan Academy of Agricultural Science,Leshan614000,China)

Abstract：Genetic evaluation and potential application researches of new mutations are the preconditions of using and studying.Genetic differences between mutants and corresponding basic materials were studied by phenotypic characters analysis and the protocol for the identification of maize varieties-SSR marker method(NY/T1432-2014) were used in this study with 19 EMS mutants.The major results were as follows:Great differences were existed between K305 and its mutants such as K305Y1403,K305Y1409,K305Y1411 and K305Y1415.There were 9 characters significant or extremely significant between K305 and them in the 20 characters investigated in this study.Mutants R08Y1425,R08Y1423,R08Y1429 were also greatly different from R08.And there were 17,13,12 characters significant or extremely significant,respectively.The results of 40 SSR markers showed that each marker was detected 3.8 and 4.2 alleles between K305,R08 and their mutants,respectively.Numbers of genotype amplified from them were 1.90 and 2.15 on average.Polymorphism information content (PIC) at each location of K305 and R08 group were 0~0.76 and 0~0.88,respectively,and its average PIC were 0.20 and 0.28,respectively.Genetic similarity coefficient of K305 and R08 between their mutants were 0.790~0.918 and 0.707~0.884,and their average genetic similarity coefficient were 0.862 and 0.809.Different genetic locations of each mutation and their based materials K305 and R08 were two or above.All of the results suggested that there were real genetic differences between base material and their mutations and the application researches could be continued.

Key words:Maize;EMS;Mutant lines;Genetic differences

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.018

中圖分類號(hào)：S513.03

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-7091(2016)01-0110-07

作者簡(jiǎn)介：石海春(1974-),男,四川宣漢人,副教授,博士,主要從事玉米遺傳育種研究。通訊作者：柯永培(1963-),男,四川內(nèi)江人,教授,博士,主要從事玉米遺傳育種研究。

基金項(xiàng)目：四川省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)資金項(xiàng)目(SC2013510122023);四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011FZ0119);四川省“十二五”農(nóng)作物育種攻關(guān)項(xiàng)目(2011-3-11)

收稿日期：2015-09-23