葡萄逆境脅迫誘導啟動子的克隆及表達分析

呂兆勇,趙春梅,薛仁鎬

(1.聊城市人民醫(yī)院，山東 聊城　252000;2.青島農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院,山東 青島　266109)

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葡萄逆境脅迫誘導啟動子的克隆及表達分析

呂兆勇1,趙春梅2,薛仁鎬2

(1.聊城市人民醫(yī)院，山東 聊城252000;2.青島農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院,山東 青島266109)

摘要：為了研究葡萄抗逆基因(CAN70200.1)的表達特性,采用PCR技術從葡萄中克隆了CAN70200.1基因上游一段長度為1 354 bp的啟動子片段,命名為PCAN。采用PlantCARE和PLACE啟動子在線預測工具分析表明,PCAN啟動子序列具有CAAT-box、TATA-box基本的順式作用元件和一些參與非生物脅迫、光和植物激素應答相關的順式作用元件。為驗證啟動子的表達特性,將PCAN啟動子連接到pCAMBIA1391Z載體GUS基因的上游,構建成植物表達載體p1391Z-CAN,并通過農(nóng)桿菌介導法轉化煙草,經(jīng)PCR鑒定,獲得轉基因植株。對轉基因煙草植株進行逆境脅迫處理發(fā)現(xiàn),在干旱處理120 min后,PCAN啟動子活性達到最強;而4 ℃低溫處理30~60 min時,PCAN啟動子活性達到最強,表明PCAN啟動子具有低溫和干旱脅迫誘導表達特性。

關鍵詞：葡萄;PCAN啟動子;脅迫誘導表達;GUS檢測

植物基因的表達調控主要發(fā)生在轉錄水平,由啟動子和與之相互作用的轉錄因子共同完成,受到多種順式作用元件和反式作用因子的相互協(xié)調作用。啟動子是一段位于結構基因5′端上游區(qū)的DNA序列,能活化RNA聚合酶,使之與模板DNA準確地結合,并具有轉錄起始的特異性。啟動子按照轉錄方式可以分為:組成型、組織特異型和誘導型啟動子[1]。植物受到逆境(低溫、高鹽、干旱等)脅迫時會產(chǎn)生相應的應答反應,以降低或消除逆境脅迫給植物帶來的危害。逆境脅迫誘導型啟動子可以誘導植物在各種不良生長環(huán)境中表達抗逆基因,使其表現(xiàn)出一定的抗逆性。在逆境脅迫條件下,轉錄因子與脅迫應答基因啟動子的順式作用元件結合,特異地啟動應答基因的轉錄表達,從而作出調節(jié)反應。目前,關于逆境脅迫誘導型啟動子有很多報道,例如Weising等[2]研究發(fā)現(xiàn),Atrd29A基因啟動子具有干旱、高鹽及低溫脅迫響應的順式作用元件。Kasuga等[3]比較了由CaMV35S組成型啟動子和冷誘導rd29A啟動子分別驅動CBF基因在轉基因煙草中的低溫抗性和生長狀況,發(fā)現(xiàn)由rd29A啟動子驅動的轉CBF基因植株比由CaMV35S啟動子驅動的轉基因植株所表現(xiàn)出來的生長延滯要輕微的多。Roychoudhury等[4]將水稻的Rab16A基因轉化到煙草中,并由Rab16A基因啟動子來驅動,然而研究發(fā)現(xiàn)Rab16A基因只有在高鹽脅迫條件下才會表達,且植株的生長狀態(tài)正常,表現(xiàn)出明顯的耐鹽能力,表明Rab16A基因啟動子是鹽脅迫誘導型啟動子。Manavella等[5]對向日葵HAHB4啟動子的研究發(fā)現(xiàn),在HAHB4啟動子上含有ABRE元件。對轉HAHB4基因的擬南芥和向日葵進行GUS染色和RT-PCR分析,結果顯示ABRE元件對ABA、NaCl和干旱脅迫做出反應。在脅迫誘導型啟動子中發(fā)現(xiàn)多種與非生物脅迫相關的順式作用元件及轉錄因子,如DRE元件及DREB類轉錄因子、MYB元件及MYB類轉錄因子、GT-1元件及GT-1類轉錄因子等[6-8]。

本研究從葡萄(VitisviniferaL.)中克隆了1個逆境相關的基因(登錄號:CAN70200.1),為明確該基因的表達特性,依據(jù)葡萄基因組序列,克隆了該基因的啟動子片段,分析了啟動子序列中含有的順式作用元件,并構建該啟動子的融合GUS基因的植物表達載體,利用農(nóng)桿菌介導法轉化煙草,獲得轉基因植株,并對其進行逆境脅迫處理,分析其在煙草各組織中的表達特性,為揭示該基因在葡萄生長發(fā)育及非生物逆境應答中的生物學功能奠定基礎。

1材料和方法

1.1材料與試劑

植物材料:葡萄幼苗由青島農(nóng)業(yè)大學遺傳實驗室提供。

載體與試劑:大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞與載體pCAMBIA1391Z由青島農(nóng)業(yè)大學遺傳實驗室保存提供;DNA聚合酶、限制性內切酶、pMD19-T載體和植物基因組DNA提取試劑盒購于TaKaRa(大連)公司;各種生化試劑購置于上海生工生物工程有限公司。

1.2葡萄幼葉基因組DNA的提取

參照植物基因組DNA提取試劑盒(TaKaRa)說明書提取葡萄新鮮幼葉的基因組DNA,1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量。

1.3PCAN啟動子克隆

根據(jù)目的基因的上游啟動子序列設計引物VvESTPF (5′-ACACTCGTCCCATCTCCCATC-3′),VvESTPR (5′-TCCAAGTCTTTCCTAGTTGCTC-3′),以提取的葡萄幼葉DNA為模板,使用TaKaRaTaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)進行PCR擴增,按照說明書中的PCR體系進行擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,切膠回收后克隆到pMD19-T載體(TaKaRa公司),轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,重組質粒命名為pMD19T-CAN,陽性克隆送往TaKaRa(大連)公司測序。

1.4PCAN啟動子順式作用元件分析

利用PlantCARE網(wǎng)站[9](http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和PLACE[10](http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)在線分析啟動子區(qū)域存在的啟動子順式調控元件。

1.5植物表達載體p1391Z-CAN的構建及鑒定

將連接順序正確重組質粒pMD19T-CAN用限制性內切酶EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切切下目的片段,同樣用EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切表達載體pCAMBIA1391Z,在T4DNA連接酶作用下連接過夜,連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α,涂布含Kan(50 μg/mL)的固體LB平板,37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。在平板上挑取單菌落,接種含Kan(50 μg/mL)的液體LB培養(yǎng)基中,提取質粒,進行酶切驗證,將構建好的重組質粒命名為p1391Z-CAN。

1.6農(nóng)桿菌介導的煙草遺傳轉化

用凍融法將構建好的重組質粒轉化至農(nóng)桿菌EHA105,采用葉盤法對煙草進行遺傳轉化。將切割的煙草葉片預培養(yǎng)2 d后,置于含有重組質粒的農(nóng)桿菌EHA105侵染液中浸泡15 min左右,期間不停輕輕搖晃,使葉盤切面充分接觸菌液。取出葉盤,用無菌濾紙吸去多余菌液,將葉盤置于預培養(yǎng)基上,26 ℃黑暗培養(yǎng)3 d,然后將上述預培養(yǎng)葉片轉移至共培養(yǎng)基中。培養(yǎng)7 d左右后,轉至篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待分化的抗性不定芽長出達1 cm時,將其切下轉入MS含有潮霉素(Hygromycin,Hyg)10 mg/L和羧芐青霉素(Carbenicillin,Carb)250 mg/L的生根培養(yǎng)基上進行抗性植株生根篩選。

1.7轉基因植株的分子檢測

提取轉基因煙草的DNA,利用根據(jù)GUS基因設計的引物GUSR(5′-TTACAGAACCGACGACTCG-3′)和GUSR(5′-TAGTGCCTTGTCCAGTTGC-3′)擴增706 bp的片段。

1.8轉基因煙草的逆境脅迫處理

抗性苗T0種子萌發(fā)成苗后,做逆境脅迫處理。低溫處理:將轉基因煙草幼苗放在4 ℃低溫分別處理0，1，2，5，10，30，60，240 min,取其葉片進行GUS染色。干旱處理:將轉基因幼苗葉片放在室溫25 ℃下分別處理0,15,30,60,120 min,然后進行GUS染色。

2結果與分析

2.1PCAN啟動子序列克隆

利用PCR方法從葡萄幼葉基因組DNA中擴增PCAN啟動子(圖1),測序結果表明,該啟動子大小為1 354 bp,經(jīng)序列同源性比對表明,該PCAN啟動子序列與網(wǎng)站上的序列同源性達到96%(圖2)。

2.2PCAN啟動子序列分析

利用PlantCARE和PLACE網(wǎng)站在線分析啟動子區(qū)域存在可能的順式作用元件,分析發(fā)現(xiàn)PCAN啟動子含有TATA-box、CAAT-box序列和提高轉錄水平元件5′UTR Py-rich stretch。PCAN啟動子含有參與逆境脅迫調控元件,例如熱激應答元件HSE、厭氧誘導所需的元件ARE、參與干旱應答的元件MYCR、低溫應答元件LTR、傷害應答元件WUN-motif、赤霉素應答元件MYB。啟動子區(qū)還含有胚乳表達所需元件Skn-1-motif、晝夜節(jié)律控制元件Circadian。此外,在PCAN啟動子還發(fā)現(xiàn)了多個光應答元件,包括ACE、AT1-motif、Box Ⅰ、G-box、GAG-motif、GT1-motif、SP1、TCT-motif(表1、圖2)。

Marker.DL10000 Marker;1.PCR產(chǎn)物。

順式作用元件Cis-actingregulatory核心序列Coresequence功能 Function 數(shù)目Number5'UTRPy-richstretchTTTCTTCTCT提高轉錄水平元件3ACEAAAACGTTTA光應答元件1ARETGGTTT厭氧誘導所需元件2AT1-motifATTAATTTTA-CA部分光應答元件2ATGCAAATmotifATACAAATTGAGTCA位點相關元件1Box4ATTAAT部分保守DNA光應答元件3BoxⅠTTTCAAA光應答元件4Box-W1TTGACC真菌激活子應答元件1CAAT-boxCAAT啟動子和增強子普遍存在的元件10CAT-boxGCCACT分生組織表達相關的元件1EREATTTCAAA乙烯應答元件1G-boxGACGAC光應答元件1GAG-motifGGAGATG部分光應答元件1GT1-motifGGTTAA光應答元件1HSEAAAAAATTTC熱激應答元件1LTRCCGAAA低溫應答元件1Skn-1-motifGTCAT胚乳表達所需元件1SP1CC(G/A)CCC光應答元件1TATA-boxTATAAAT距轉錄起始位點30個堿基的啟動子中心元件17TCA-elementGAGAAGAATA水楊酸應答元件1TCT-motifTCTTAC部分光應答元件1WUN-motifAAATTTCCT傷害應答元件1as-2-boxGATAATGATG莖特異性表達和光應答元件1CircadianCAANNNATC晝夜節(jié)律控制元件1MYCRCANNTG干旱應答元件5MYBTAACAAA赤霉素應答元件1

圖2　PCAN啟動子序列

2.3PCAN啟動子融合GUS表達載體的構建

將測序正確的重組質粒pMD19T-CAN用EcoR Ⅰ和PstⅠ雙酶切獲得目的片段,同時將表達載體pCAMBIA1391Z也用EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切,將目的片段和載體膠回收后,根據(jù)濃度確定最合適的連接體系,目的片段連接到載體上后,經(jīng)雙酶切鑒定,在重組質粒雙酶切約1 400 bp的PCAN啟動子片段(圖3),雙酶切結果和預期目的條帶大小一致,說明獲得了PCAN啟動子融合GUS表達載體p1391Z-CAN。

2.4農(nóng)桿菌介導的煙草遺傳轉化

利用農(nóng)桿菌介導的葉盤法轉化煙草,農(nóng)桿菌侵染后,經(jīng)共培養(yǎng)基培養(yǎng)2~3 d(圖4-A),轉移至篩選培養(yǎng)基進行抗性芽的篩選(圖4-B),具有抗性的芽生長旺盛(圖4-C),待抗性芽生長到2 cm時(圖4-D),將抗性芽切下轉移至生根培養(yǎng)基,使其生根(圖4-E),最后轉至花盆中,進行室溫培養(yǎng)即煉苗(圖4-F),獲得抗性苗。

2.5PCAN啟動子轉基因煙草的PCR鑒定

抗性苗T0種子萌發(fā)成苗后,取煙草抗性苗的幼葉,提取基因組DNA,根據(jù)設計的GUS基因的引物,利用PCR檢測。部分轉基因植株的結果如圖5所示,表明PCAN啟動子已經(jīng)轉入這些植株。

Marker.DL12000 bp Marker;1.重組

A.共培養(yǎng);B.抗性芽篩選;C.抗性芽;D.抗性芽約2 cm;E.生根;F.抗性苗的馴化。

Marker.DL2000 bp Marker;1~4.抗性苗;5.未轉基因的煙草(對照)。

2.6轉基因植株逆境脅迫處理

為了檢測逆境條件下PCAN啟動子的表達特性,在低溫、高溫、鹽、干旱脅迫處理條件下,對轉基因煙草葉片中的GUS表達進行了檢測。取鑒定陽性的T0轉基因煙草的幼葉,對其4 ℃低溫處理設置時間1~240 min,進行GUS組織染色,結果顯示,未轉基因煙草對照處理和轉基因植株未處理的都沒有被染色,而轉基因植株在低溫處理1 min時就已開始表達,10 min時表達很高,30~60 min時,表達最高,240 min后開始有所減弱,說明PCAN啟動子是受低溫脅迫誘導表達(圖6-A)。將T0轉基因煙草幼葉取下,在室溫25 ℃下分別放置15,30,60,120 min。結果表明,轉基因未處理的對照,沒有檢測到GUS表達,而干旱處理15 min時有微弱表達,在處理120 min時,葉片染色最深(圖6-B),說明PCAN啟動子是受干旱脅迫誘導表達。在高溫和鹽脅迫下,未檢測到GUS基因表達。

A.4 ℃低溫脅迫誘導處理;B.干旱脅迫誘導處理。

3討論

目前已經(jīng)鑒定出的植物脅迫誘導型啟動子有多種,主要分為干旱誘導型啟動子、低溫誘導型啟動子、高溫誘導型啟動子、鹽誘導型啟動子和植物激素誘導型啟動子等[11]。每一種誘導型的啟動子都有一些核心順式作用元件。例如GCC-box是乙烯應答元件,存在于許多PR基因啟動子區(qū)域,在植物抗性反應和生長發(fā)育中具有重要的調控作用,TAGAAGCCGCC、AGCCGCC是GCC-box的核心序列[12]。G-box最早是Giuliano等[13]在研究光調控元件時發(fā)現(xiàn)的,是廣泛存在于植物中的順式作用元件,其共有序列為[C/G/T]ACGTGG[C/G],核心序列為CACGTG。目前已經(jīng)研究得到許多植物非生物脅迫誘導啟動子順式作用元件,對其結構和功能有了一定的認識。本研究所克隆的PCAN啟動子經(jīng)分析也發(fā)現(xiàn)了很多順式作用元件,包括低溫應答元件LTR、干旱應答元件MYCR、赤霉素應答元件MYB、熱激應答元件HSE、厭氧誘導所需的元件ARE、傷害應答元件WUN-motif、光應答元件ACE等誘導調控元件[14-16],胚乳組織表達元件Skn-1-motif[17],以及與微生物誘導相關的調控元件Box-W1[18]等,這些順式作用元件的存在暗示PCAN的啟動子可能不僅響應非生物脅迫,同時也可能是一個生物脅迫誘導的特異啟動子,能夠用于葡萄抗病的分子育種中,但這一推測還需要進一步研究證實。為了明確PCAN啟動子的表達特性,將該啟動子與GUS基因相連,構建成植物表達載體并轉化煙草。對轉基因煙草進行表達分析表明,PCAN啟動子能夠應答低溫和干旱脅迫處理,但不能被高溫和鹽脅迫誘導表達。在低溫處理條件下,該啟動子表達非常迅速,僅在處理1 min時就已開始表達,在處理10 min時,表達量迅速增加,之后表達量一直保存較高水平,表明該啟動子具有低溫高效誘導表達特性;同時,干旱脅迫處理結果表明,該啟動子也具有干旱脅迫誘導表達特性,證實了PCAN啟動子在煙草中能被干旱和低溫逆境脅迫誘導表達。非生物脅迫誘導啟動子順式作用元件與轉錄因子相互作用,在分子水平上調節(jié)植物對非生物脅迫的抗性[19-23]。本研究通過網(wǎng)站預測在PCAN啟動子上找到了與逆境脅迫誘導有關的調控元件,為下一步探索與這些元件相互作用的轉錄因子,在轉錄水平上弄清PCAN在逆境脅迫誘導下的調控機制奠定了基礎。

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Cloning and Expression Analysis of Grape′s Stress Inducible Promoter

Lü Zhaoyong1,ZHAO Chunmei2,XUE Rengao2

(1.Liaocheng People′s Hospital,Liaocheng252000,China;2.College of Life Sciences,Qingdao Agricultural University,Qingdao266109,China)

Abstract：To study the expression of grape stress tolerance gene (CAN70200.1),a 1 354 bp promoter fragment (named as PCAN) upstream of the gene CAN70200.1 was isolated by using PCR technology.Promoter sequence was analyzed by the database of PlantCARE and PLACE.The result showed that the PCANsequence contained basic elements CAAT-box,TATA-box and some cis-acting elements that response to abiotic stresses,light and plant hormones.To verify the expression pattern of the promoter,the PCANfragment was fused with GUS reporter gene located on pCAMBIA1391Z to construct a plant expression vector p1391Z-CAN,followed by transformation into tobacco by Agrobacterium-meditated method.The expression activity of PCANpromoter reached highest at 120 min after drought stress treatment or at 30-60 min under 4 ℃ cold treatment condition,indicated that the PCANpromoter could express under the condition of treatments with cold and drought.

Key words:Grape;PCANpromoter;Stress induction expression;GUS assay

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.013

中圖分類號：Q78;S565.1

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)01-0077-06

作者簡介：呂兆勇(1986-),男,山東聊城人,在讀碩士,主要從事植物分子生物學研究。通訊作者：薛仁鎬(1965-),男,吉林汪清人,教授,博士,主要從事植物分子生物學研究。

基金項目：轉基因生物新品種培育重大專項(2014ZX08010002-003-002);山東省自然科學基金項目(ZR2013CM025)

收稿日期：2015-10-10