牦牛HSPB6基因的生物信息學(xué)和表達(dá)分析

劉東花,衛(wèi)陽飛

(1.河西學(xué)院 河西生態(tài)與綠洲農(nóng)業(yè)研究院,甘肅 張掖　734000;2.河西學(xué)院 甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室,甘肅 張掖　734000)

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牦牛HSPB6基因的生物信息學(xué)和表達(dá)分析

劉東花1,衛(wèi)陽飛2

(1.河西學(xué)院 河西生態(tài)與綠洲農(nóng)業(yè)研究院,甘肅 張掖734000;2.河西學(xué)院 甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室,甘肅 張掖734000)

摘要：為了探究HSPB6對牦牛肉嫩度的影響,分析了牦牛HSPB6基因的分子特征,并利用熒光定量PCR技術(shù)檢測了HSPB6 mRNA在牦牛和黃牛背最長肌中的表達(dá)量。結(jié)果表明,牦牛HSPB6基因含有一個504 bp的開放性閱讀框,編碼167個氨基酸,屬于親水性蛋白;二級結(jié)構(gòu)主要由 α-螺旋、β-折疊、延伸鏈以及無規(guī)卷曲組成;牦牛HSPB6蛋白與水牛、普通牛相似度較高。熒光定量PCR研究表明,牦牛背最長肌中HSPB6基因mRNA表達(dá)水平顯著高于黃牛(P<0.01),說明HSPB6基因較高的表達(dá)量可能是造成牦牛肉剪切力較高的原因,為牦牛肉嫩化的分子機(jī)制研究奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：牦牛;HSPB6;肉嫩度

牦牛是分布于青藏高原及其毗鄰地區(qū)的主要畜種,是青藏高原地區(qū)牧民主要的肉食來源。我國有13個牦牛地方品種和1個牦牛培育品種。牦牛主要以自然放牧為主,與黃牛肉相比,牦牛肉蛋白質(zhì)含量高,脂肪含量較低,且富含不飽和脂肪酸,是真正的綠色有機(jī)食品[1]。但是,牦牛肉嫩度較差,不易咀嚼,其市場接受度受到制約。因此,牦牛肉的嫩度是目前牦牛選育重要方向之一。

熱應(yīng)激蛋白(HSPs)是一個保守的伴侶蛋白家族,廣泛存在于原核及真核細(xì)胞中,按其分子量大小可分為5個家族:HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子HSP (sHSP),每個亞家族又由多個成員組成[2-4]。HSPB6(又被稱為HSP20)是sHSP家族的成員之一,蛋白分子量約為17 kDa。HSPB6可在多個組織中表達(dá),在血管、氣管、結(jié)腸、膀胱、子宮平滑肌、心肌、骨骼肌等組織中表達(dá)量較高[5-6]。最近幾年肉品質(zhì)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn),HSPs的表達(dá)量與肉的嫩度顯著相關(guān)。HSPs可以直接結(jié)合其互作蛋白,阻止其互作蛋白降解,延緩細(xì)胞凋亡的過程,影響肉最終嫩度的形成[7-8]。其中HSPB6與牛肉品質(zhì)有著密切的關(guān)系,特別是在影響肉嫩度方面發(fā)揮著重要的作用。畜禽屠宰后,肌肉中較多的HSPB6可以阻止細(xì)胞凋亡的過程,進(jìn)而減緩肉的成熟速度,增大剪切力[9-10]。

近幾年來,從基因組學(xué)、蛋白組學(xué)方面進(jìn)行探討調(diào)控肉品質(zhì)分子機(jī)理的研究越來越多。許多研究表明,HSPB6對肉品質(zhì)有重要的影響。因此,本研究以牦牛為研究對象,對HSPB6基因編碼序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并利用熒光定量PCR檢測HSPB6基因在牦牛和黃牛背最長肌中的表達(dá)水平,以期為進(jìn)一步開展牦牛HSPB6基因的表達(dá)調(diào)控和牦牛肉品質(zhì)的選育研究提供分子理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1試驗材料

選取甘肅省肅南縣自然放牧條件下生長的3.5歲健康牦牛和黃牛各3頭,屠宰后迅速采集背最長肌組織在液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗方法

1.2.1HSPB6序列的生物信息學(xué)分析根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫收錄的牦牛HSPB6 mRNA序列(XM_005908208.1),利用在線軟件預(yù)測HSPB6基因的開放閱讀框、對HSPB6蛋白的基本理化性質(zhì)、疏水性質(zhì)、信號肽位點、跨膜區(qū)域、磷酸化位點、結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)等性質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,相關(guān)在線軟件詳細(xì)說明見表1。

在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載8個物種的HSPB6蛋白序列,分別為(人,NP_653218.1)、 (大鼠,NP_620242.1)、(小鼠,NP_001012401.1)、(牛,NP_001069495.1)、(水牛,XP_006068849.1)、(美洲野牛,XP_010847332.1)、(家犬,XP_541688.1)和(豬,XP_003127107.1)。利用MegAlign軟件與牦牛HSPB6蛋白序列進(jìn)行比對,利用MEGA6[11]軟件構(gòu)建Neighbor-Joining(簡稱NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹,Bootstrap自檢驗1 000次。

表1　生物信息學(xué)分析預(yù)測相關(guān)網(wǎng)站

1.2.2總RNA的提取利用RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司提供)提取總RNA。取牦牛和黃牛背最長肌組織各100 mg,分別用液氮磨成粉末裝入1.5 mL的EP管,加入1 mL的TRIzol液,室溫放置5 min;加入0.2 mL的氯仿,振蕩混勻后室溫放置15 min,4 ℃下13 000 r/min離心15 min,吸取上層水相,至另一新的離心管,加入等體積的異丙醇混勻,室溫放置10 min,4 ℃下13 000 r/min離心10 min;棄去上清液,加入l mL的75%乙醇漂洗RNA中混合的雜質(zhì),4 ℃下8 500 r/min離心5 min;小心棄去上清液,室溫晾干10 min,加入適量的DEPC水。將回收產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3RT-PCR 擴(kuò)增分別以牦牛和黃?？俁NA為模板,進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。反應(yīng)總體系為20 μL:5×PrimeScript Buffer 4 μL,RNase free dH2O 14 μL,500 ng/μL總RNA 2 μL,混勻后離心。反應(yīng)程序:42 ℃ 10 min,85 ℃ 5 s。反應(yīng)得到的cDNA產(chǎn)物保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4引物設(shè)計與合成根據(jù)NCBI收錄的牦牛HSPB6 mRNA序列(XM_005908208.1),利用引物設(shè)計軟件Primer 6.0設(shè)計1對引物P1和P2,即P1:5′-GCCAATCAGAACCCTCAACC-3′;P2:5′-AGAAA GTGGCTGCTTGGTTG-3′,預(yù)計擴(kuò)增大小為174 bp;內(nèi)參基因GAPDH上游引物為5′-CCACGAGAAG TATAACAACACC-3′,下游引物為5′-GTCATAAGTC CCTCCACGAT-3′。引物由TaKaRa公司合成。

1.2.5熒光定量PCR利用實時熒光定量儀(Bio-Rad,美國)檢測HSPB6基因在牦牛和黃牛背最長肌中的mRNA表達(dá)水平。Real-time PCR反應(yīng)總體系50 μL,包括:SYBR Premix Ex TaqTM 25 μL,上、下游引物(20 mmol/L)各2 μL,ddH2O 19 μL,cDNA模板2 μL。充分混勻,反應(yīng)程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,55 ℃ 30 s,40個循環(huán)。本試驗選擇牦牛GAPDH基因作為內(nèi)參基因,mRNA表達(dá)量使用2-ΔΔCT法計算。

2結(jié)果與分析

2.1牦牛HSPB6序列的開放閱讀框分析

利用NCBI的ORF Finder在線程序預(yù)測牦牛HSPB6的開放閱讀框區(qū)域(ORF),發(fā)現(xiàn)HSPB6基因包含一個完整的開放閱讀框,定位于6~509 bp,CDS區(qū)長度為504 bp,編碼167個氨基酸,起始密碼子為ATG,終止密碼子為TAG(圖1)。

圖1　牦牛HSPB6基因的開放閱讀框

2.2牦牛HSPB6蛋白的理化性質(zhì)分析

通過預(yù)測牦牛HSPB6蛋白的分子特征發(fā)現(xiàn),該蛋白分子式為C805H1257N225O228S2,分子量為17.799 3 kDa,理論等電點(pI)為5.95。該蛋白含有19種基本氨基酸殘基,缺少Asn殘基。蛋白中含量最高的氨基酸殘基是Ala (16.2%),含量最低的是Cys(0.6%)和Met(0.6%),含有帶負(fù)電荷(Asp+Glu)的殘基18個,正電荷(Arg+Lys)殘基14個。在280 nm下消光系數(shù)為16 960,不穩(wěn)定指數(shù)為62.76,屬于不穩(wěn)定蛋白;親水性平均系數(shù)(GRAVY)為-0.101,證明該蛋白為親水性蛋白。

2.3牦牛HSPB6蛋白的疏水性/親水性分析

運(yùn)用ProtScale工具對牦牛HSPB6蛋白的疏水性/親水性進(jìn)一步分析,依據(jù)Hphob.OMH/Sweet et al.算法,氨基酸分值越高,親水性越弱的規(guī)律可知:牦牛HSPB6蛋白多肽鏈第110位Pro具有最低的分值-0.889和最強(qiáng)的親水性;第54位Ala具有最高的分值0.400和最強(qiáng)的疏水性。整個多肽鏈大部分區(qū)域分值位于0以下,因此,該結(jié)果進(jìn)一步證明該蛋白為親水性蛋白(圖2)。

圖2　牦牛HSPB6蛋白疏水性分析

2.4牦牛HSPB6蛋白信號肽和跨膜區(qū)分析

信號肽預(yù)測結(jié)果表明,牦牛HSPB6蛋白存在信號肽的可能性非常低,屬于非分泌蛋白。跨膜區(qū)分析表明,牦牛HSPB6蛋白不存在跨膜區(qū)域,表明該蛋白屬于表面蛋白(圖3)。

圖3　牦牛HSPB6蛋白分子信號肽預(yù)測

2.5牦牛HSPB6蛋白亞細(xì)胞定位分析

從分析結(jié)果可知,其分布在細(xì)胞質(zhì)中的可能性最大,百分比為47.8%,細(xì)胞核中的可能性為21.7%,分布在線粒體中的可能性為17.4%,分布在高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞骨架中的可能性比較低,分別為4.3%。因此,可以推斷牦牛HSPB6蛋白可能主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮生物學(xué)作用。

2.6牦牛HSPB6蛋白結(jié)構(gòu)分析

通過預(yù)測牦牛HSPB6蛋白的二級結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)該蛋白由27.54% α-螺旋、14.37%延伸鏈、10.18% β-轉(zhuǎn)角和47.90%無規(guī)則卷曲組成(圖4)。α-螺旋和無規(guī)則卷曲是組成牦牛HSPB6蛋白主要的二級結(jié)構(gòu)元件。

長豎線區(qū).α螺旋；中豎線區(qū).延伸鏈；次中豎線區(qū).β轉(zhuǎn)角；短線區(qū).無規(guī)則卷曲。

利用SWISS-MODEL中同源建模的方法對牦牛HSPB6蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果如圖5。牦牛HSPB6蛋白中包含α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲。

圖5　牦牛HSPB6基因蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.7牦牛HSPB6蛋白功能位點和功能分析

磷酸化位點分析結(jié)果表明,牦牛HSPB6蛋白含有3個磷酸化位點,其中2個是絲氨酸激酶磷酸化位點(第87,140位),1個是酪氨酸激酶磷酸化位點(第115位),其結(jié)果表明,該蛋白可能在這些位點被磷酸化,從而實現(xiàn)其功能。通過Protfun在線分析軟件預(yù)測牦牛HSPB6蛋白的功能可知,該蛋白具有轉(zhuǎn)錄和結(jié)合(Transport_and_binding)功能的可能性極大(0.773)。

2.8牦牛HSPB6蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載了8個物種的HSPB6蛋白序列,包括(Homosapiens,人)、 (Rattusnorvegicus,大鼠)、(Musmusculus,小鼠)、(Bostaurus,黃牛)、(Bubalusbubalis,水牛)、(Bisonbisonbison,美洲野牛)、(Canislupusfamiliaris,家犬)和(Susscrofa,豬)。利用MegAlign和MEGA6.0軟件進(jìn)行同源性分析。結(jié)果表明,牦牛跟水牛和普通牛的HSPB6蛋白相似度較高,都達(dá)到97%以上,親緣關(guān)系較近;大鼠和小鼠親緣關(guān)系較近;人和豬的親緣關(guān)系較近(圖6)。

2.9HSPB6 mRNA在牦牛和黃牛背最長肌中的表達(dá)量分析

通過熒光定量PCR方法檢測了HSPB6基因mRNA在牦牛和黃牛背最長肌中的表達(dá)量,結(jié)果如圖7。在放牧條件下,牦牛背最長肌中HSPB6 mRNA表達(dá)量顯著高于黃牛(P<0.01)。

圖6　NJ法構(gòu)建的HSPB6蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

**.差異極顯著(P<0.01)。

3討論

隨著人們生活水平的不斷提高,人們對畜產(chǎn)品質(zhì)量要求也在逐步提高。肉類在人類日常飲食中占重要的地位,其肉質(zhì)鮮美、易咀嚼的肉產(chǎn)品更受消費(fèi)者的青睞。傳統(tǒng)的飼養(yǎng)方式和惡劣的生活環(huán)境導(dǎo)致牦牛生長較慢,屠宰年齡較大,肉質(zhì)較差。目前,屠宰企業(yè)通常采用一些嫩化方式對肉進(jìn)行處理,達(dá)到對肉嫩化的目的。國際通用的嫩化方式主要包括機(jī)械嫩化法、電刺激加低溫排酸嫩化法、添加外源和內(nèi)源蛋白酶嫩化法和基因修飾嫩化法等[12-14]?；蛐揎椖刍ㄊ抢矛F(xiàn)代生物技術(shù)(如ZFN、Crispr cas9等)對畜禽的基因進(jìn)行人工修飾,改變一些內(nèi)源蛋白在肌纖維中的含量,進(jìn)而改善畜禽的肉品質(zhì)[14]。動物育種即將進(jìn)入分子育種時代,目前,已鑒定出一些影響動物重要經(jīng)濟(jì)性狀的基因。因此,利用分子育種的手段改善肉品質(zhì)是未來動物育種的主要方向。

本研究通過分析牦牛HSPB6蛋白的分子特征發(fā)現(xiàn),牦牛HSPB6蛋白含167個氨基酸,其中大部分屬于親水性氨基酸,說明該蛋白較易溶于水。蛋白質(zhì)的磷酸化在生物整個細(xì)胞周期的生命活動中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[15-16]。磷酸化預(yù)測結(jié)果表明,HSP蛋白中存在2個絲氨酸激酶磷酸化位點和1個酪氨酸激酶磷酸化位點,蛋白激酶可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)在細(xì)胞分化、凋亡、細(xì)胞間信號傳遞和免疫等生物學(xué)過程中的作用。因此,筆者推測蛋白質(zhì)的磷酸化修飾對牦牛HSPB6蛋白的生物學(xué)功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。通過比對不同物種HSPB6蛋白序列發(fā)現(xiàn),?？苿游镩gHSPB6蛋白的相似度最高,牦牛、美洲野牛、水牛和普通牛聚為一類,說明HSPB6蛋白在牛科動物種間的功能是相似的。

近年來,關(guān)于肉嫩度標(biāo)記蛋白的研究發(fā)現(xiàn),與肉嫩度相關(guān)的蛋白質(zhì)主要為無氧和有氧能量生成酶類、細(xì)胞解毒蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑和熱休克蛋白家族[17-18]。前期研究表明,HSPB6蛋白的表達(dá)量與肉的嫩度呈顯著負(fù)相關(guān),說明HSPB6蛋白的表達(dá)量越高,肉的剪切力越大,嫩度越差[10,18-19]。在相同放牧條件下,牦牛肉的剪切力顯著高于黃牛[20]。本研究通過熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn),牦牛背最長肌中HSPB6基因mRNA表達(dá)水平顯著高于黃牛(P<0.01)。因此可以推測,HSPB6基因較高的表達(dá)量可能是造成牦牛肉剪切力較高的原因。本研究結(jié)果為分析牦牛HSPB6基因及其對肉嫩度的影響提供了理論依據(jù)。

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Bioinformatics and Expression Analysis of YakHSPB6 Gene

LIU Donghua1,WEI Yangfei2

(1.Institute of Hexi Ecology and Oasis Agriculture,Hexi University,Zhangye734000,China;2.Key Laboratory of Hexi Corridor Resourses Utilization of Gansu,Hexi University,Zhangye734000,China)

Abstract：HSPB6 protein plays an important role in meat tenderization.In order to better understand the function of HSPB6 gene in yak,we analyzed the molecular characteristics of HSPB6 gene and detected expression level of its mRNA in longissimus dorsi muscle in yak and cattle by using Real-time PCR.The results showed that the length of CDS in yak HSPB6 mRNA was 504 bp and encoded 167 amino acids,which encoded a hydrophilic protein.The secondary structures were mainly composed of the α-helix,β-turn,extended strand and random coil.Amino acid sequences of HSPB6 gene between yak and buffalo,cattle were high similarity.Real-time PCR analysis showed that the expression level of HSPB6 gene in longissimus dorsi muscle in yak was significantly higher than in cattle.We concluded that higher expression level of HSPB6 gene might lead to tougher meat in yak.This study would provide basic data for studying meat tenderization of yak.

Key words:Yak;HSPB6;Meat tenderness

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.006

中圖分類號：Q78

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)01-0035-05

作者簡介：劉東花(1986-),女,山東文登人,助理研究員，碩士,主要從事動物遺傳育種研究。

基金項目：河西學(xué)院青年教師科研基金項目(QN2014-22)

收稿日期：2015-11-07