糖腎方治療糖尿病腎病心肌纖維化的實(shí)驗(yàn)研究及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

趙婷婷，胡 琳，2，張浩軍，李 平★

（1.中日友好醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)研究所；北京市免疫炎性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029；2.北京化工大學(xué) 生物工程專業(yè)，北京 100029）

心肌纖維化是大多數(shù)心血管疾病共同病理特征，主要表現(xiàn)為心肌成纖維細(xì)胞過度增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積[1]。心肌纖維化不僅是導(dǎo)致心力衰竭的一個主要原因，而且與心血管死亡風(fēng)險直接相關(guān)[2，3]。糖尿病腎 ?。╠iabetic kidney disease，DKD）伴發(fā)心血管疾病的風(fēng)險高，患者因心血管疾病導(dǎo)致死亡的可能性是其進(jìn)入終末期腎病的5～10 倍[4]。因此對DKD 患者的治療應(yīng)重視減輕其心血管損傷。糖腎方是課題組在繼承名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上研制的治療DKD 復(fù)方中藥，前期多中心臨床試驗(yàn)和體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)均顯示其療效確切[5～8]。

本文旨在探討糖腎方治療DKD 大鼠心肌纖維化的作用，并用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對糖腎方活性化合物成分及抗纖維化靶點(diǎn)進(jìn)行系統(tǒng)研究。

1 材料與方法

1.1 動物造模與給藥

Wistar 大鼠20 只，雄性，體重180～220g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，合格證號：SCXK （京） 2007-0001。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，行基礎(chǔ)狀態(tài)測定，剔除血糖與尿蛋白異常的動物。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，常規(guī)消毒，背部切口1～1.5cm，暴露右腎，剝離腎臟脂肪及腎上腺，結(jié)扎右腎門血管，切除右腎，縫合切口。術(shù)后1 周后，按40mg/kg 腹腔注射1%的鏈脲佐菌素，72h后尾尖采血測血糖，＞16.7mmol/L 為造模成功[9]。另取6 只動物作為空白組，戊巴比妥鈉麻醉后進(jìn)行假手術(shù)，消毒切口后暴露右腎，不做其他處理，縫合切口，1 周后腹腔注射檸檬酸緩沖液。

造模成功大鼠12 只，隨機(jī)分為模型組和糖腎方治療組（2.67g/kg/d，相當(dāng)于臨床劑量10 倍），每組6 只?？瞻捉M和模型組大鼠給予同容積的蒸餾水，連續(xù)給藥20 周。糖腎方配方顆粒由江陰天江藥業(yè)有限公司加工，4g/袋，批號060632。

造模后第20 周，戊巴比妥鈉麻醉處死動物，取心肌組織固定于10%中性甲醛溶液，包埋切片后進(jìn)行Masson’s trichrome 染色。光鏡下觀察心肌組織病理學(xué)變化，并采用Image J 軟件統(tǒng)計其膠原面積百分比。

1.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.2.1 主要化合物成分篩選和收集

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP） 分別檢索出糖腎方七味中藥（大黃、地黃、黃芪、三七、枳殼、山茱萸、鬼箭羽）的化合物成分，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中常用的化合物成分篩選方法和條件，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug like，DL）≥0.18 篩選化合物成分作為候選活性成分。

1.2.2 化合物靶點(diǎn)收集

通過中醫(yī)藥百科全書 （the Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM）數(shù)據(jù)庫、證候關(guān)聯(lián)（Symptom Mapping，SymMap）數(shù)據(jù)庫、化學(xué)相似性系綜法（similarity ensemble approach，SEA）搜索引擎和STITCH 數(shù)據(jù)庫檢索候選活性成分靶點(diǎn)，將整理收集到的靶點(diǎn)導(dǎo)入Uniprot 數(shù)據(jù)庫，剔除非人源靶點(diǎn)，并將靶點(diǎn)的基因名稱校正為通用名稱，建立成分-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

1.2.3 化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使用Cytoscape3.7.2 對查詢到的化合物成分以及其對應(yīng)的作用靶點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

1.2.4 疾病靶點(diǎn)的獲取

在OMIM 數(shù)據(jù)庫、 TTD 數(shù)據(jù)庫、Drugbank 數(shù)據(jù)庫和Pubmed-gene 數(shù)據(jù)庫中檢索關(guān)鍵詞“myocardial fibrosis”，收集心肌纖維化疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2.5 藥物-疾病蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖及Hub 基因分析

將糖腎方主要化合物成分靶點(diǎn)與心肌纖維化靶點(diǎn)相關(guān)靶蛋白上傳至String 數(shù)據(jù)庫，獲取PPI數(shù)據(jù)，以置信度為0.7 為篩選條件，確保其數(shù)據(jù)的可靠性，后建立藥物-疾病PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。將得到的PPI 數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2 進(jìn)行可視化分析，利用cytoHubba 插件中基于度的方法計算得到網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，選擇二者共同擁有且degree 數(shù)值排名前20 的靶點(diǎn)作為糖腎方映射到心肌纖維化發(fā)病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.2.6 靶基因功能富集和通路分析

通過DAVID 將PPI 網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)蛋白進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes） 通路富集分析，將分析結(jié)果在R 軟件中進(jìn)行圖形可視化，得到糖腎方化合物靶點(diǎn)蛋白的基因功能以及糖腎方治療DKD 心肌纖維化的潛在作用靶點(diǎn)在信號通路中的作用。

2 結(jié)果

2.1 糖腎方對DKD 大鼠心肌纖維化的治療作用

通過Masson’s trichrome 染色觀察各組大鼠心肌膠原沉積狀況，發(fā)現(xiàn)DKD 大鼠心肌間質(zhì)和心肌微血管周圍膠原沉積增多、 纖維化發(fā)生情況顯著（P<0.05），給予糖腎方20 周干預(yù)后可顯著降低DKD 大鼠心肌纖維化狀況 （P<0.05，圖1 見封底）。

圖1 糖腎方顯著降低單側(cè)腎切除合并鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠心肌膠原沉積（Masson’s trichrome染色，×200）。A.假手術(shù)組；B.糖尿病腎病模型組；C. 糖尿病腎病+糖腎方治療組；D.各組膠原面積百分比半定量分析。

2.2 糖腎方中候選化學(xué)成分

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫的檢索，收集到大黃100個、鬼箭羽120 個、黃芪117 個、三七221 個、 山茱萸299 個、枳殼18 個、地黃86 個化學(xué)成分。經(jīng)OB 和DL 篩選，得到268 個有效活性成分：大黃24 個、鬼箭羽25 個、黃芪41 個、三七51 個、山茱萸100 個、枳殼12 個、地黃15 個。

2.3 糖腎方化合物靶點(diǎn)收集

通過 ETCM、SymMap、SEA搜索引擎和STITCH 數(shù)據(jù)庫檢索候選活性成分的靶點(diǎn)，268 個化合物活性成分對應(yīng)7751 個作用靶點(diǎn)：其中大黃對應(yīng)靶點(diǎn)1105 個，鬼箭羽214 個，黃芪1343 個，三七1527 個，山茱萸1608 個，枳殼1542 個，地黃412 個。在靶點(diǎn)與藥物的相互對應(yīng)關(guān)系中，存在多種中藥共有多個相同的靶點(diǎn)。

2.4 糖腎方-心肌纖維化相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在OMIM、TTD、Drugbank 和Pubmed-gene 數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)鍵詞，共收集到601 個心肌纖維化疾病相關(guān)靶點(diǎn)。將糖腎方活性成分靶點(diǎn)和心肌纖維化疾病靶點(diǎn)匹配后，得到277 個潛在靶點(diǎn)。

2.5 Hub 基因分析及與活性化合物對應(yīng)關(guān)系

“度值”表示網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)相連的數(shù)目。度值（degree）排名前20 的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)連接情況見圖2。將上述靶點(diǎn)依次導(dǎo)入DisGeNET 數(shù)據(jù)庫，得到其蛋白屬性。大部分基因都參與炎癥反應(yīng)，如IL6、IL4、TLR4、IL1A、CXCR4 等；VEGFA、KDR 等主要參與血管細(xì)胞內(nèi)皮的增殖分裂、從而促進(jìn)新生血管的生成；FN1 作為纖維連接蛋白，影響心肌纖維化；此外，還有一些靶點(diǎn)參與了信號傳導(dǎo)、物質(zhì)運(yùn)輸和酶活調(diào)節(jié)等。

圖2 糖腎方治療心肌纖維化前20 個關(guān)鍵靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

糖腎方七味藥共有49 個化合物參與前20 個靶點(diǎn)蛋白的調(diào)控，同時調(diào)控3 個以上靶點(diǎn)的化合物有9 個。其中β-谷甾醇（Beta-sitosterol）是大黃、三七、山茱萸、枳殼和鬼箭羽五味藥的共同活性成分；槲皮素（quercetin）是黃芪、鬼箭羽、山茱萸和三七四味藥的共同活性成分，山奈酚（kaempferol）是黃芪和鬼箭羽的共同活性成分；谷甾醇（sitosterol）是地黃、山茱萸、鬼箭羽的共同活性成分。

2.6 GO 富集和KEGG 通路分析

對篩選到的277 個靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析，按顯著性由高到低排序并繪制了氣泡圖。我們發(fā)現(xiàn)糖腎方的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要富集于2741 個生物過程、72 個細(xì)胞組分和167 個分子功能。

在生物學(xué)過程 （biological process，BP） 分析中，糖腎方對循環(huán)系統(tǒng)過程、血液循環(huán)、調(diào)節(jié)血管系統(tǒng)發(fā)育、肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修飾等影響較大。

分子功能（molecular function，MF）分析顯示（圖3，見封底），糖腎方成分的功能主要與受體配體活性（receptor ligand activity）、細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）、細(xì)胞因子活性（cytokine activity）、生長因子活性（growth factor activity）、氨基化合物結(jié)合（amide binding）關(guān)系密切。

圖3 糖腎方治療心肌纖維化靶點(diǎn)蛋白GO富集分析（分子功能）

在細(xì)胞組分（cellular component，CC）分析中，這些靶點(diǎn)主要與細(xì)胞外基質(zhì)、囊腔、胞質(zhì)囊腔、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、質(zhì)膜的外側(cè)等相關(guān)。

KEGG 通路分析中，共得到136 條具有明顯意義的通路（P<0.05，F(xiàn)DR<0.05），靶點(diǎn)參與的主要通路見圖4 （封底），X 軸表示富集因子、Y 軸為通路名稱，氣泡顏色代表在該條通路上靶基因的富集程度，氣泡大小代表該條通路上所富集基因數(shù)量。10 條通路中，與糖腎方治療心肌纖維化相關(guān)度最高的通路依次為：細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）、液體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化信號 （fluid shear stress and atherosclerosis）、 蛋白多糖在癌癥中的作用（proteoglycans in cancer）、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路 （AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）等。

圖4 糖腎方治療心肌纖維化靶點(diǎn)蛋白KEGG通路分析

3 討論

文獻(xiàn)研究[10，11]發(fā)現(xiàn)糖腎方的七味藥中黃芪、山茱萸、三七、枳殼等均在心血管系統(tǒng)疾病中廣泛應(yīng)用，具有良好保護(hù)作用。本文采用單側(cè)腎切除合并鏈脲佐菌素腹腔注射誘導(dǎo)的DKD 大鼠，進(jìn)行糖腎方治療20 周，首次發(fā)現(xiàn)糖腎方具有顯著抑制DKD 心肌纖維化的作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)相關(guān)基因、促血管生成基因和纖維化標(biāo)志分子是糖腎方治療心肌纖維化的關(guān)鍵靶點(diǎn)。炎癥被認(rèn)為是心肌纖維化重要誘因，抗炎治療能夠減輕慢性腎臟病患者心血管風(fēng)險[12]。炎癥能夠誘導(dǎo)釋放IL-1、IL-6，IL-1β，IL-8，TNF-α、TGF-β、CRP、 纖維蛋白原等細(xì)胞因子[13]，它們誘導(dǎo)了前纖維化和動脈粥樣硬化的進(jìn)程。糖腎方治療心肌纖維化相關(guān)度最高的通路為細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路。細(xì)胞因子可分為促炎因子和抗炎因子。IL-6 是糖腎方治療心肌纖維化網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度值最高的靶點(diǎn)，它是一個多效細(xì)胞因子，具有促炎作用。有研究證實(shí)，心臟成纖維細(xì)胞過度合成IL-6，會促使纖維化因子表達(dá)，加速心肌纖維化[14]，而IL-6 抑制劑能夠有效減輕模型小鼠的心肌纖維化程度[15]。課題組前期發(fā)現(xiàn)糖腎方能夠顯著抑制DKD 大鼠腎臟和循環(huán)系統(tǒng)IL-6 等炎癥因子的表達(dá)[6]，提示抑制炎癥反應(yīng)可能是糖腎方有效治療糖尿病腎臟和心臟損傷的共同機(jī)制。

糖腎方七味藥有效成分眾多，其中槲皮素、黃芩素、山奈酚、人參皂苷rh2、柚皮素、油酸、亞油酸、蘆薈大黃素等化合物作用靶點(diǎn)最多，是糖腎方治療心肌纖維化的主要活性成分。槲皮素和黃芩素均能夠抑制AngII 誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞膠原I 和膠原III 的分泌[16，17]，該作用在AngII 心肌纖維化小鼠和異丙腎上腺素心肌纖維化大鼠模型上得到驗(yàn)證[18，19]。槲皮素、黃芩素、山奈酚和柚皮素4 種化合物均是黃酮類化合物，提示黃酮類化合物可能是糖腎方治療心肌纖維化的有效部位。