高效液相色譜法測定大蒜中大蒜素的含量

韓貴芝， 王文軍， 王 芳　 (濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，山東濟(jì)寧 272013)

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高效液相色譜法測定大蒜中大蒜素的含量

韓貴芝， 王文軍， 王 芳 (濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，山東濟(jì)寧 272013)

摘要[目的]通過有機(jī)萃取法中萃取劑的選擇、用量和萃取時(shí)間等條件的優(yōu)化處理，建立大蒜中大蒜素含量測定的分析方法。[方法]將新鮮大蒜搗碎、酶解后，分別用乙醇和乙酸乙酯作為萃取劑萃取得到大蒜素溶液。用高效液相色譜儀分析樣品中大蒜素的含量,確定最佳萃取劑；通過對不同時(shí)間段提取物檢測對比，確定最佳萃取時(shí)間。[結(jié)果]以乙醇作為萃取劑提取大蒜素，大蒜素的平均濃度可以達(dá)到28.85 μg/mL，乙酸乙酯提取組中的大蒜素平均濃度為13.24 μg/mL；經(jīng)對比分析，乙醇提取大蒜素的最佳萃取時(shí)間為3.0 h。[結(jié)論]乙醇作為實(shí)驗(yàn)室常用的化學(xué)試劑具有低毒、無污染、高效的提取效果，可為醫(yī)藥、食品等實(shí)驗(yàn)室對大蒜素的提取開發(fā)和利用提供參考。

關(guān)鍵詞乙醇；乙酸乙酯；大蒜素；萃取時(shí)間優(yōu)化

大蒜為百合科蔥屬植物，在我國有2 000多年的種植歷史。大蒜屬藥食同源植物，其鱗莖中富含鈣、鐵、鋅、鍺等元素以及多種必需氨基酸[1-5]，具有較高的食用和藥用價(jià)值，能有效防治高血壓等疾病。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，大蒜也是一味中草藥，能夠激發(fā)免疫功能，誘生出干擾素，抑制生成腫瘤壞死因子，降低致癌物的作用，具有提高人體免疫功能的重要作用[6]。大蒜中的有機(jī)含硫化合物——大蒜素，其化學(xué)名稱是二烯丙基三硫化物(DATS)。新鮮完整的大蒜中并不含大蒜素，只含有其前體物質(zhì)——蒜氨酸。蒜氨酸存于大蒜的細(xì)胞質(zhì)中，但當(dāng)大蒜的細(xì)胞破碎后，液泡內(nèi)的內(nèi)源蒜酶被釋放并與蒜氨酸接觸，經(jīng)酶解生成大蒜素。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究得出，大蒜素的藥理作用包含以下幾種：抗微生物、抗腫瘤、抗寄生蟲、抗?jié)?、抗衰老、降血壓、降血脂、提高機(jī)體免疫力等[7-8]。大蒜素使用安全，不良反應(yīng)少，具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，大蒜素的開發(fā)和研究越來越受到人們的重視。

目前，對大蒜素的提取和測定已有一定的研究，其中有機(jī)溶劑提取法、水蒸氣蒸餾法和超臨界CO2萃取法是最常用的提取大蒜素的3種方法[9-11]。水蒸氣蒸餾法具有成本低、設(shè)備簡單等優(yōu)點(diǎn)，但因操作過程中溫度相對較高容易降低蒜酶的活性，降低大蒜素產(chǎn)率。超臨界CO2萃取法因具有工藝簡單、高效節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)而在化工、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，但該法所用設(shè)備投資較大，不適于實(shí)驗(yàn)室提取。筆者采用有機(jī)溶劑萃取法萃取大蒜中的大蒜素，并采用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行檢測，比較其萃取效果，并優(yōu)化萃取時(shí)間 ，以期能夠提高大蒜素的產(chǎn)率。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料及試劑。市售普通大蒜；大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；乙醇(分析純)；乙酸乙酯(分析純)；甲醇(高效液相色譜專用)。

1.1.2主要儀器。500 mL燒杯、100 mL容量瓶、漏斗、錐形瓶、JJ-2(2003-61)型組織搗碎勻漿機(jī)，常州國華電器有限公司；HH·S21·6型雙列六孔電熱恒溫水浴鍋，山東醫(yī)療器械廠；TD5M-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；RE-48轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器，上海亞榮生化儀器廠；LC210型高效液相色譜儀，上海儀電分析儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1色譜條件。該試驗(yàn)參照張民等用HPLC法測定大蒜中大蒜素含量所用色譜條件[12]。色譜柱：C18柱，流動(dòng)相為甲醇∶水為85∶15(V/V)，柱溫30 ℃，流速為0.8 mL/min，檢測波長為214 nm，每次進(jìn)樣20 μL。

1.2.2大蒜素樣品的制備。將新鮮大蒜去皮，用組織搗碎機(jī)搗碎成蒜泥，取3份樣品,每份20 g,分別用保鮮膜密封，利用大蒜細(xì)胞破碎后釋放的內(nèi)源蒜酶常溫酶解30 min，按照料液比1∶4 g/mL向樣品中分別加入等量乙醇。用保鮮膜密封置于40 ℃恒溫水浴鍋中浸提1 h后，將樣品轉(zhuǎn)移至離心管以1 000 r/min低速離心沉淀，取上清液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行蒸餾，溫度設(shè)定為78 ℃，轉(zhuǎn)速70 r/min,待體積減至原來的1/4時(shí)停止蒸餾，過濾即得濃縮大蒜素液。使用乙酸乙酯作為萃取劑提取大蒜素的步驟與乙醇相同。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品測定。以流動(dòng)相作為溶劑將大蒜素純品制備成200 μg/mL的大蒜素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再用流動(dòng)相稀釋為100.00、50.00、25.00、12.50 μg/mL的系列溶液，經(jīng)微孔濾膜過濾后分別精密進(jìn)樣20 μL，使用高效液相色譜儀對標(biāo)準(zhǔn)系列中大蒜素含量進(jìn)行測定，以大蒜素濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。分別準(zhǔn)確量取1 mL濃縮大蒜素液，用流動(dòng)相定容至10 mL，微孔濾膜過濾后分別進(jìn)樣20 μL進(jìn)行檢測，根據(jù)對待測物質(zhì)所得峰面積計(jì)算得出樣品中大蒜素的含量。

1.2.4萃取時(shí)間優(yōu)化。分別取40 g搗碎大蒜置于5個(gè)燒杯中，編號(hào)A、B、C、D、E，經(jīng)酶解、勻漿后，按照料液比1∶4 g/mL加入提取效果較好的溶劑分別置于40 ℃水浴鍋中萃取1、2、3、4、5 h，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾、過濾制得大蒜素濃縮液。用微孔濾膜分別對樣品進(jìn)行過濾，按照前述色譜條件對5份樣品中大蒜素的含量進(jìn)行測定、比較，確定最佳萃取時(shí)間。

1.2.5回收率試驗(yàn)。精確量取已知大蒜素含量的樣品，向其中加入不同濃度的大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品，按照前述色譜條件測定大蒜素的加標(biāo)回收率。

2結(jié)果與分析

2.1大蒜素樣品的高效液相色譜圖圖1為乙醇提取組中大蒜素含量的色譜圖，大蒜素的保留時(shí)間為6.084 min，圖2為乙酸乙酯提取組中大蒜素含量的色譜圖。

2.2大蒜素的標(biāo)準(zhǔn)曲線取“1.2.3”中所配制的大蒜素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液分別進(jìn)樣，記錄峰面積，以大蒜素濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=15 950C+74 949，r=0.999 050。

2.3乙醇和乙酸乙酯的提取效果比較由表1可知，乙醇較乙酸乙酯對大蒜素的提取率高，且乙醇對人體相對無毒副作用，故選擇使用乙醇提取大蒜中的大蒜素。

2.4萃取時(shí)間的優(yōu)化選取乙醇作為萃取劑，按照“1.2.4”的方法對大蒜素的萃取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。由圖3可知，當(dāng)萃取時(shí)間為3.0 h時(shí)，所得提取物中大蒜素的濃度最高，故乙醇提取大蒜素的最佳時(shí)間為3.0 h。

2.5回收率測定精確量取1 mL濃度為31.79 μg/mL的樣品溶液，再分別加入1 mL不同濃度的大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品，按前述色譜條件對混合液中的大蒜素進(jìn)行測定，計(jì)算回收率。由表2可見，大蒜素的加標(biāo)回收率在84.4%～88.2%，平均回收率86.4%,而測定結(jié)果在80%～120%即可視為優(yōu)化方法可行。因此，該試驗(yàn)采用的方法可行。

3結(jié)論與討論

大蒜素為無色油狀液體，難溶于水，但易溶于有機(jī)溶劑如乙醇、乙酸乙酯、乙醚等中。該研究采用乙醇作為萃取劑提取大蒜素的工藝,得出最佳工藝條件為:大蒜細(xì)胞破碎后常溫酶解30 min，加入乙醇，置于40 ℃恒溫水浴鍋中浸提1 h后，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀78 ℃蒸餾，得濃縮大蒜素液，用HPLC法對樣品中大蒜素含量進(jìn)行測定，當(dāng)萃取時(shí)間為3.0 h時(shí)，所得提取物中大蒜素的濃度最高。

在實(shí)驗(yàn)室中提取大蒜素主要用于食品工業(yè)的研究，應(yīng)選用無毒或低毒的萃取劑，故選乙醇作為萃取劑，且提取結(jié)束后，所得大蒜素產(chǎn)品中無不良?xì)馕?，?yōu)化了大蒜素的提取方法。該方法萃取率高，加標(biāo)回收率高，線性關(guān)系好，可為醫(yī)藥、食品等實(shí)驗(yàn)室對大蒜素的提取開發(fā)和利用提供參考依據(jù)。

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Detection of Allicin Content in Garlics by High Performance Liquid Chromatography

HAN Gui-zhi,WANG Wen-jun,WANG Fang

(School of Public Health，Jining Medical College,Jining,Shandong 272013)

Key wordsEthanol; Ethyl acetate; Allicin; Extraction time optimization

Abstract[Objective] To establish an analytical method to detect the content of allicin in garlics based on the optimization of extractant selection,dosage and extraction time.[Method] After comminution and enzymolysis of garlics,ethanol and ethyl acetate were used as the extractants to prepare allicin solution.Allicin content was analyzed by high performance liquid chromatograph,so as to determine the optimal extractants.By comparing the extracts detection of different periods,the optimal extraction time was obtained.[Result] The average concentration of allicin reached 28.85 μg/mL with ethanol as the extractant; and the average concentration of allicin was 13.24 μg/mL in ethyl acetate extraction group.Based on comparison,the optimal extraction time was 3.0 h for the extraction of allicin by ethanol.[Conclusion] As a commonly used laboratory chemical reagent,ethanol had the advantages of low toxicity,no pollution and high efficiency.This research provides references for the development and utilization of allicin extraction in laboratory for medicine and food.

基金項(xiàng)目濟(jì)寧市科技局項(xiàng)目(2013jnwk74)。

作者簡介韓貴芝(1986- ),女，山東臨沂人，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事食品毒理研究。 *通訊作者，副教授，從事公共衛(wèi)生方面研究。

收稿日期2016-01-04

中圖分類號(hào)S 41-33

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)07-057-02