羰基鎳急性中毒對大鼠骨髓細胞的DNA損傷

趙亞學，李宇，馬國煜，劉靜，王秋英，張小培，宣小強，閆銘鋒，吳喜江，程寧

1. 蘭州大學公共衛(wèi)生學院流行病與衛(wèi)生統計學研究所，蘭州 730000 2. 蘭州大學甘肅省新藥臨床前研究重點實驗室，蘭州 730000 3. 金川集團股份有限公司職工醫(yī)院，金昌 737103

羰基鎳急性中毒對大鼠骨髓細胞的DNA損傷

趙亞學1,2，李宇1，馬國煜3，劉靜1，王秋英3，張小培1，宣小強3，閆銘鋒1，吳喜江3，程寧2,*

1. 蘭州大學公共衛(wèi)生學院流行病與衛(wèi)生統計學研究所，蘭州 730000 2. 蘭州大學甘肅省新藥臨床前研究重點實驗室，蘭州 730000 3. 金川集團股份有限公司職工醫(yī)院，金昌 737103

通過動物實驗觀察不同劑量羰基鎳對大鼠骨髓細胞DNA損傷程度。采用SD大鼠，以135 mg·m-3和250 mg·m-3羰基鎳為染毒組，250 mg·m-3氯氣為陽性對照組，靜態(tài)方式染毒30 min。未染毒組為正常對照組，大鼠染毒后1、2、3和7 d分別采集樣本。采用單細胞凝膠電泳檢測每組大鼠骨髓細胞DNA的損傷程度。彗星尾長和Olive尾矩2個指標的分析結果表明，大鼠骨髓細胞DNA損傷程度隨著羰基鎳染毒劑量的增加而增加，在4個時間點各劑量組間均有顯著差異(P<0.05)且隨時間的變化有一定的規(guī)律，損傷程度在3 d時達到最大，而后緩慢下降。羰基鎳急性中毒對大鼠骨髓細胞DNA有一定的損傷，且存在劑量-效應關系，各劑量組損傷程度有一定的時間效應規(guī)律。

羰基鎳；SD大鼠；DNA損傷；單細胞凝膠電泳；骨髓細胞

羰基鎳(nickel carbonyl)是由鎳和一氧化碳在一定壓力條件下反應生成的一種金屬化合物，進入體內的羰基鎳與蛋白質和核酸結合，隨血流分布到全身，可導致肺、肝、腦等的損傷[1]。羰基鎳致器官、組織、細胞等損傷的研究較多，我們前期研究發(fā)現羰基鎳可導致肺組織和肝組織的氧化損傷，降低肺組織和肝組織SOD活力，對肺臟和肝臟產生毒性作用[2-4]，同時發(fā)現羰基鎳可誘導腦組織的氧化應激反應而產生神經毒性[5]。Armit[6]觀察到了人在羰基鎳急性中毒后出現呼吸困難、眼花、嘔吐，隨后幾天出現發(fā)紺、咳嗽、血痰、脈搏加快、神智錯亂等癥狀，嚴重者甚至死亡。但以往研究中對羰基鎳致骨髓細胞損傷的研究較少，本研究旨在對羰基鎳骨髓細胞DNA的損傷程度進行研究，揭示羰基鎳對大鼠骨髓細胞DNA的損傷作用規(guī)律。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 動物分組與染毒

由西安交通大學基礎醫(yī)學實驗動物中心提供的體重在180～220 g之間的雌雄各半的SD大鼠。按照性別隨機分成4個組，1個正常對照組(8只)以及3個染毒組(40只/組)分別定義為A、B、C、D組。萬級潔凈動物房分籠飼養(yǎng)，SPF級大鼠飼料(北京科澳協力飼料有限公司)喂養(yǎng)，自由采食及飲水。

135 mg·m-3、250 mg·m-3的羰基鎳和250 mg·m-3的氯氣靜態(tài)方式染毒30 min。4組動物染毒后分別于1、2、3和7 d這4個時間點隨機處死2、10、10、10只，取材。

1.2 單細胞凝膠電泳實驗

按常規(guī)單細胞凝膠電泳(single-cell gel electrophoresis, SCGE)實驗進行操作和分析。運用CASP彗星分析軟件測量所選骨髓細胞的彗星尾長(comet tail length)和Olive尾矩(Olive tail moment)，將彗星尾長和Olive尾矩作為實驗觀察指標，具體儀器及操作過程詳見文獻[7]。

1.3 統計學分析

采用SPSS21.0對數據進行統計分析，對于不符合正態(tài)要求的數據經對數轉換后進行分析，多組樣本均數之間的比較采用方差分析，多組樣本均數間的多重比較采用LSD法，劑量-反應關系采用Spearman等級相關分析法，對于相關性的組別做線性或曲線回歸分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果(Results)

2.1 羰基鎳急性染毒后大鼠骨髓細胞彗星尾長和Olive尾矩的變化趨勢

從表1可以看出，各個時間段不同羰基鎳染毒劑量組間彗星尾長和Olive尾矩隨著染毒劑量的增加而增加。各染毒劑量組在3 d時尾長和Olive尾矩達到最大，在7 d時均開始下降。經LSD法多重比較可以看出，未染毒組與3個染毒組的尾長和Olive尾矩均數之間均有差異(P<0.05)。氯氣組在染毒后各個時間點的彗星尾長和Olive尾矩也明顯高于未染毒組，且最大損傷程度出現在染毒后2 d，但最大損傷程度小于羰基鎳高劑量組的最大損傷程度。

分組Groups染毒劑量Exposuredoses1d2d3d7d彗星尾長ComettaillengthA03.58±1.33#3.58±1.33#3.58±1.33#3.58±1.33#B135mg?m-3nickelcarbonyl21.62±1.76*#20.64±1.64*36.47±1.60*#8.49±1.48*C250mg?m-3nickelcarbonyl26.90±1.59*#23.17±1.72*31.55±1.31*#7.60±1.57*D250mg?m-3chlorine16.97±1.33*21.91±1.32*21.00±9.50*9.04±1.63*Olive尾矩OlivetailmomentA00.173±2.375#0.173±2.375#0.173±2.375#0.173±2.375#B135mg?m-3nickelcarbonyl2.536±1.784*#2.485±1.939*5.995±1.658*#0.917±1.680*C250mg?m-3nickelcarbonyl3.538±1.843*#2.540±1.800*5.887±1.533*#0.809±1.744*D250mg?m-3chlorine2.646±5.292*3.544±1.435*2.430±2.091*1.036±1.768*

注：* 為經LSD法多重比較；同時間點，與A組比較，P<0.05；#為與D組比較，P<0.05。

Note: * By using the line segment detector (LSD) method; compared with A, at the same time P<0.05; # compared with D, P<0.05.

2.2 相同時間點不同劑量組間及相同劑量組不同時間點的相關性及回歸分析

經過Spearman相關性分析發(fā)現同一時間不同劑量組之間，同一劑量組不同時間的各組均有相關性(表2)，從表中還可以看出同一時間點不同劑量組之間除了第7天時的Olive尾矩之外幾乎都呈線性相關，即隨著劑量的增加，彗星尾長、Olive尾矩都在增加，存在著明顯的劑量-效應關系。第7天時回歸方程呈現曲線相關，從方程看出，在第7天時Olive尾矩不再隨著劑量的增加而增加，而是出現緩慢下降狀態(tài)，這可能是由于羰基鎳對骨髓DNA的損傷劑量達到一定程度后，機體開始將外源化學物質排泄出體外，不會再加重損傷效應，故Olive尾矩不再增長。表中還可看出同一劑量組不同時間點之間呈現曲線相關，曲線回歸方程表明，羰基鎳染毒各個劑量組中DNA的損傷在染毒3 d時損傷程度均達到最大，而在7 d時損傷程度都逐漸變小，這可能因為外源化學物質排出體外，濃度減少。

3 討論(Discussion)

羰基鎳是鎳化合物中急性毒性最強的一種，短時間大劑量吸入可累及到多種臟器及器官，包括對肝臟、肺臟、心臟及腦組織的損傷。以往對羰基鎳致動物或人體損傷的研究較多，但其制毒的細胞及分子機制仍不完全清楚。有研究表明鎳化合物可引起機體氧化應激反應，產生超氧陰離子自由基，導致細胞突變及腫瘤的發(fā)生[8-9]。還有研究得出羰基鎳是通過抑制Ca2+-Mg2+ATP酶和Na+-K+ATP酶的活性，導致組織/器官細胞漿內游離鈣增多引起組織細胞損傷，影響肝肺等臟器功能[2-3]。Armit[6]的研究顯示羰基鎳吸入后在呼吸道表面進入血液或淋巴液，在接觸到水、血液等體液的情況下如果有氧氣或者二氧化碳的存在，分解產生碳酸鹽化合物，形成沉淀，分布在肺部、大腦、脊髓束、心肌、棕色脂肪、腎上腺皮質等處，刺激神經節(jié)和腎上腺實質細胞引起毛細血管內皮細胞的退變，引起血管壁脂肪變性和出血，同時機體也會通過腎臟和腸道將其排出體外。Sunderman等[10]在對懷孕倉鼠進行研究的過程中發(fā)現倉鼠吸入一定濃度羰基鎳后產生胎盤毒性對后代有致畸效應。骨髓是維持機體生命和免疫力的重要器官，骨髓細胞DNA的損傷嚴重影響機體的正常運行。

本實驗結果顯示，大鼠吸入不同濃度羰基鎳后各時間點隨羰基鎳濃度的增加，DNA斷鏈片斷也增多，尾長增加，呈現明顯的劑量-效應關系，這種關系估計是隨著羰基鎳濃度的升高，DNA的修復功能不能與越來越嚴重的損傷相平衡，從而使DNA的損傷加重所致。但Olive尾矩在一定時間后不再隨著劑量的升高而加重，這可能是大劑量的羰基鎳進入體內對機體的損傷嚴重，機體調動排泄系統加大毒物排泄，一定時間后毒物在體內的分布減少所致。相同劑量，不同時間點測量的尾長和Olive尾矩變化也有一定規(guī)律，在染毒后3 d時，DNA的損傷程度均達到最重，在7 d時開始下降。此結果與Barnes和Denz[11]的研究結果一致，他們發(fā)現羰基鎳急性中毒后，死亡病例一般發(fā)生在前3 d，存活者中毒癥狀也以前3 d最為明顯，7 d后癥狀逐漸減輕。氯氣染毒組各時段骨髓細胞DNA的損傷程度均低于羰基鎳高劑量組，這說明相同劑量羰基鎳致大鼠骨髓細胞DNA的損傷程度比氯氣嚴重。

表2 同一時間不同劑量組間和同一劑量不同時間點間相關性分析及回歸方程Table 2 The correlation analysis and regression equations among different doses and different times

注：* 相關性分析P<0.05，r為相關系數，Y為回歸方程。

Note: * P<0.05 by the correlational analysis, r stands for correlation coefficient, Y stands for regression equation.

外周血中的各種細胞均由骨髓中的始祖細胞分化而來，處于不同發(fā)育、分化階段的血細胞對外源化學物敏感性較高，因此，血液系統比其他身體器官更容易受到外源化學物的損傷。本研究結果表明，羰基鎳對大鼠骨髓細胞DNA損傷嚴重，具有骨髓毒性，且損傷程度與羰基鎳存在時間-效應規(guī)律和劑量-效應關系。

致謝：感謝金川公司鎳鈷工業(yè)衛(wèi)生研究所祁光偉、徐東偉、黃克英在動物飼養(yǎng)方面的幫助！感謝蘭州大學張榮強、蘆永斌、常曉宇在樣本處理和數據統計上的幫助！

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◆

DNA Damage in Bone Marrow Cells of Rat Acutely Poisoned with Nickel Carbonyl

Zhao Yaxue1,2, Li Yu1, Ma Guoyu3, Liu Jing1, Wang Qiuying3, Zhang Xiaopei1, Xuan Xiaoqiang3, Yan Mingfeng1, Wu Xijiang3, Cheng Ning2,*

1. Institute of Epidemiology and Statistics, School of Public Health, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China 2. Provencial Key Preclinical Study Laboratory of New Drug, Lanzhou 730000, China 3. Staff Hospital, Jinchuan Group Co., Ltd., Jinchang 737103, China

Received 23 March 2016 accepted 23 May 2016

In order to study the DNA damage induced by nickel carbonyl in rat bone marrow cells, 128 healthy SD rats were divided into four groups to conduct 30 min static inhalation experiments. SD rats in the two exposure groups were exposed to a nickel carbonyl concentration of 135 mg·m-3and 250 mg·m-3, and the rats were exposed to 250 mg·m-3Cl2in the positive control group. 8 unpoisoned rats served as the blank control. After rats inhaled for 1, 2, 3 and 7 d, bone marrow samples were taken. SCGE was used to detect the acute injury extent. The comet tail length and Olive tail moment in the comet image were measured. In nickel carbonyl groups, extreme DNA damage was found after 3 d, and the DNA damage was decrease after 7 d. Higher nickel carbonyl dose caused greater DNA damage. It is indicated that acute nickel carbonyl exposure caused DNA damage in the bone marrow cells of the SD rats, with a dose-response and time-response relationship.

nickel carbonyl; SD rats; DNA damage; single-cell gel electrophoresis; bone marrow cell

金川集團股份有限公司與蘭州大學產學研合作項目(金科綜2009-12和2011-18)

趙亞學(1990-)，女，碩士研究生，研究方向為重金屬中毒防治，E-mail: yxzhao14@lzu.edu.cn

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: chengn@lzu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160323061

2016-03-23 錄用日期：2016-05-23

1673-5897(2016)6-230-04

X171.5

A

程寧(1959)，男，教授，研究方向為安全性評價。

趙亞學, 李宇, 馬國煜, 等. 羰基鎳急性中毒對大鼠骨髓細胞的DNA損傷[J]. 生態(tài)毒理學報，2016, 11(6): 230-233

Zhao Y X, Li Y, Ma G Y, et al. DNA damage in bone marrow cells of rat acutely poisoned with nickel carbonyl [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(6): 230-233 (in Chinese)