新疆紅棗果實不同部位總酚的含量測定

楊璐，努爾比耶，李宏，*（.新疆林業(yè)科學(xué)院，新疆烏魯木齊830000；.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊830054）

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新疆紅棗果實不同部位總酚的含量測定

楊璐1，努爾比耶2，李宏1，*
（1.新疆林業(yè)科學(xué)院，新疆烏魯木齊830000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊830054）

摘要：系統(tǒng)地研究新疆紅棗果實不同部位總酚含量的最佳提取和測定方法，為進一步開發(fā)利用紅棗資源提供有效的測試手段。以沒食子酸為標準對照品，研究Folin-Ciocalteu比色法測定新疆紅棗果肉和果核的中總酚含量的最適宜條件；以總酚含量為指標，通過L9（34）正交試驗考察甲醇濃度、料液比、提取時間和提取次數(shù)對總酚提取工藝的影響，確定紅棗總酚供試品溶液的提取方法。紅棗提取液在Folin-Ciocalteu試劑1.5 mL、25 % Na2CO3溶液2 mL、反應(yīng)溫度30℃、反應(yīng)時間60min的條件下，測定其760nm處的吸光值，沒食子酸濃度在0～100 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系（R2= 0.998 8）；紅棗總酚的最佳提取工藝為50 %的甲醇，料液比1∶10（g/mL），提取時間30 min，提取次數(shù)2次。加樣回收率為98.79 %，RSD為1.71 %。該提取和測定方法適合于紅棗果實總酚含量的測定，利用該方法提取和測定同一產(chǎn)地12個不同品種紅棗果核中的總酚含量均明顯低于果肉，果肉總酚含量約為果核總酚含量的6倍。

關(guān)鍵詞：紅棗；總酚；正交試驗；單因素試驗；Folin-Ciocalteu比色法

紅棗（Dried red Jujubes）為鼠李科（Rhamnaceae）棗屬（Zizyphusmill）植物的成熟果實棗（Zizyphus jujuba mill）[1]，新疆維吾爾自治區(qū)的東疆、南疆地區(qū)利用其獨特的自然條件，把發(fā)展大棗產(chǎn)業(yè)作為振興當?shù)亟?jīng)濟的支柱產(chǎn)業(yè)和棗區(qū)農(nóng)民增收的主要來源。目前普遍認為新疆產(chǎn)棗果的品質(zhì)優(yōu)于內(nèi)地。較多的研究均認為新疆棗以其果實飽滿、肉質(zhì)細膩、含糖量高、口味濃郁、營養(yǎng)豐富為其他紅棗所不及，棗果品質(zhì)遠遠超過其原產(chǎn)地[2-6]。

紅棗中含有豐富的總酚類化合物，總酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的多羥基酚類化合物的總稱，具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、防曬美白、護肝益腎、抗動脈硬化、防治冠心病與中風(fēng)等心腦血管疾病以及抑菌消炎抗病毒等多種生理功能[7]。為合理開發(fā)利用新疆紅棗中酚類化合物資源，本研究采用Folin-Ciocalteu比色法考察新疆主產(chǎn)的12個品種紅棗果肉和果核中總酚的含量，期望為新疆紅棗的質(zhì)量控制和開發(fā)利用提供理論參考。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

于新疆林業(yè)科學(xué)院佳木試驗站采集新疆主產(chǎn)的12個紅棗品種（駿棗、灰棗、贊皇大棗、新鄭大棗、金昌1號、哈密大棗、圓脆紅棗、新疆小圓棗、新疆長圓棗、壺瓶棗、冬棗、梨棗）作為供試材料。采集的樣品來自同一個果園、同一年成熟期、統(tǒng)一制干的紅棗果實。

沒食子酸標準品、硫酸鋰：上海山浦化工有限公司；無水碳酸鈉：天津市登科化學(xué)試劑有限公司；鉬酸鈉：金堆城鉬業(yè)股份有限公司化學(xué)分公司；鎢酸鈉、磷酸、甲醇、乙醇、丙酮：天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；濃鹽酸：西安化學(xué)試劑廠。

SW23水浴鍋：德國優(yōu)萊博公司；UV-2600紫外光譜儀：日本島津公司；TP-2102電子天平：德國賽多利斯集團。

1.2樣品處理

1.2.1 Folin-Cioealteu試劑的配制[8]

精確稱取20 g鎢酸鈉和5 g鉬酸鈉，加入140 mL超純水，完全溶解后，加入10mL85%磷酸溶液和20mL濃鹽酸，倒入帶回流裝置的圓底燒瓶中，充分混勻，水浴回流2 h，冷卻后，再加入30 g硫酸鋰和15 mL 30 %的雙氧水，加熱沸騰至溶液呈亮黃色（約15 min）。自然冷卻后至于250 mL棕色容量瓶中，用蒸餾水定容，置于棕色試劑瓶內(nèi)，保存在冰箱中。

1.2.2對照品溶液的配制

精密稱取10 mg的沒食子酸標準品，置于100 mL容量瓶用超純水溶解并稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的標準溶液。

1.2.3供試品溶液的制備

每個品種均隨機選取無病蟲、無機械傷害的干制紅棗若干，處理前先將果肉（帶果皮）與果核分離。分別取果肉和果核樣品各100 g放入冷凍粉碎機中粉碎。粉碎后放入-80℃超低溫冰箱中備用。精密稱取紅棗備用樣品1 g，至于具塞錐形瓶中，加入10 mL甲醇溶液（50 %），超聲輔助提取30 min，提取1次，轉(zhuǎn)入離心管中在4 500 r/min離心5 min，取上清液2 mL加水稀釋至10 mL，即得供試品溶液。

1.2.4樣品測定方法

用移液器精密吸取供試品溶液2 mL于10 mL容量瓶中，再加入1.5 mL Folin- Ciocalteu試劑，搖勻，5 min后加入2 mL 25 % Na2CO3溶液，加水稀釋至刻度，搖勻，30℃水浴60 min，取出冷卻后在760 nm下比色。1.3工作曲線的建立

采用改進后的方法，取6支試管，分別精確吸取不同體積的沒食子酸標準溶液于10 mL容量瓶中，加入1.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，搖勻，5 min后加入2 mL 25 % Na2CO3溶液，加水稀釋至刻度，搖勻，配置成濃度分別為0、20、40、60、80、100 μg/mL的標準液，30℃水浴60 min，按選定方法測定吸光度，并根據(jù)各標準溶液的濃度及相應(yīng)的吸光度繪制工作曲線，見圖1。

圖1樣品總酚含量測定標準曲線Fig.1 The standard curve of sample determination

結(jié)果表明，沒食子酸在濃度為0~100 μg/mL內(nèi)與其吸光值有良好的線性關(guān)系，在此范圍內(nèi)線性回歸方程為y =0.017 0x+0.014 7，相關(guān)系數(shù)仍R2=0.998 8。

2結(jié)果與分析

由于不同因素對總酚提取和測定的結(jié)果產(chǎn)生的影響不同，因此在Folin-Ciocalteu比色法的基礎(chǔ)上，對主要的影響條件進行了改進，對紅棗果實總酚超聲輔助提取工藝進行了優(yōu)化。

2.1紅棗中總酚含量的測定方法的優(yōu)化

2.1.1檢測波長的確定

準確移取濃度為40 μg/mL沒食子酸標準溶液1 mL，進行顯色反應(yīng)，用紫外可見分光光度計在500nm~ 850 nm波長范圍進行掃描，以確定最大吸收波長為測定波長。沒食子酸標準溶液經(jīng)顯色反應(yīng)后的吸收光譜圖見圖2。

其吸收曲線顯示，在760 nm波長處體系有最大吸收峰，故試驗選擇760 nm為測量波長。

2.1.2 Na2CO3溶液用量的確定

酚類化合物需要在堿性條件下將鎢鉬酸還原顯色，體系中的Na2CO3溶液是顯色反應(yīng)的支持介質(zhì)[9]。精密吸取5份濃度為40 μg/mL的沒食子酸標準溶液1 mL，分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 25 %的Na2CO3溶液，按試驗方法顯色后，以相應(yīng)的試劑空白作參比，在760 nm波長處測定吸光度，以確定堿性溶液用量對比色效果的影響，選擇最佳的Na2CO3用量。Na2CO3用量對測定結(jié)果的影響見圖3。

圖2沒食子酸經(jīng)Folin-Ciocalteu試劑顯色后的吸收光譜Fig.2 Absorption spectra of gallic acid reacted with Folin-Ciocalteu reagent

圖3 Na2CO3用量對測定結(jié)果的影響Fig.3 Effect of dosage of Na2CO3on absorbency

當Na2CO3的用量為2 mL時有最大吸光值。由此可見Na2CO3溶液的加入量會影響體系的比色效果，顯色反應(yīng)對Na2CO3溶液的用量具有依賴性。當加入堿的濃度和加入量為2 mL 25 %的Na2CO3時體系顯色反應(yīng)較為完全。

2.1.3 Folin試劑用量的確定

Folin-Ciocalteu試劑的用量以及它與Na2CO3溶液的比例也會影響體系的比色效果。精密吸取6份濃度為40 μg/mL的沒食子酸標準溶液各1 mL，分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL Folin試劑，按試驗方法顯色后，以相應(yīng)的試劑空白作參比，在760 nm波長處測定吸光度，以確定最佳的顯色劑用量。Folin試劑用量對測定結(jié)果的影響見圖4。

近日，在由金正大集團主辦的中國首屆親土狀元選拔大賽洛川站現(xiàn)場，菩堤鄉(xiāng)果農(nóng)楊華鵬向記者介紹：“往年，蘋果豐收，但供過于求賣不上價；今年當?shù)靥O果的地頭收購價格比去年高出了1-2元/斤。親土1號幫助我們種出了優(yōu)質(zhì)高價果。這不，聽說有狀元選拔賽，趕緊帶著自家蘋果來參賽了?！?/p>

顯色劑的用量對比色效果具有一定的影響。當顯色劑濃度較低時吸光度較低，隨著顯色劑加入量的增加，比色體系的吸光值也隨之增加，并且吸光值的增加趨勢比較明顯。當顯色劑的添加量超過1.5 mL后，比色體系的吸光值逐漸降低，因此比色體系中顯色劑的添加量定為1.5 mL較合適。

圖4 Folin試劑用量對測定結(jié)果的影響Fig.4 Effect of dosage of Folin-Ciocalteu on absorbency

2.1.4最佳水浴溫度和時間的確定

顯色反應(yīng)溫度對顯色效果有一定的影響，過低或者過高都不利于總酚的顯色。精密吸取5份40 μg/mL的沒食子酸標準溶液1 mL，按照試驗方法顯色后，分別在20、30、50、70、90℃水浴加熱30 min，冷卻后測量吸光度值，以確定反應(yīng)溫度對比色效果的影響。水浴溫度和時間對測定結(jié)果的影響見圖5。

圖5吸光值隨反應(yīng)溫度的變化Fig.5 The Absorbance at different reaction temperature

隨著水浴溫度的升高，顯色反應(yīng)速度加快，吸光度也逐漸增大，在30℃時吸光度達到最大值，隨著溫度高于30℃條件下，吸光度逐漸降低。這表明顯色反應(yīng)生成的藍色物質(zhì)在高溫下不穩(wěn)定，所以本試驗確定顯色反應(yīng)溫度為30℃。

酚類化合物與顯色劑反應(yīng)需要一個過程，時間過短顯色反應(yīng)不完全從而影響顯色結(jié)果。精密吸取3份40 μg/mL的沒食子酸標準溶液1 mL，按照試驗方法顯色后，在30℃分別水浴加熱5、10、20、30、40、50、60、80、100、120 min，冷卻后測量吸光度值，以確定比色體系反應(yīng)完全所需要的時間。吸光值隨反應(yīng)溫度的變化結(jié)果見圖6。

在最佳反應(yīng)溫度30℃下，總酚在50 min后可充分顯色，之后隨著時間的延長吸光度值基本保持穩(wěn)定，因此選擇60 min。

2.2紅棗果實中總酚提取方法的優(yōu)化

圖6吸光值隨反應(yīng)時間的變化Fig.6 The Absorbances at different reaction time

表1正交試驗水平編碼Table 1 Levels of the factors in orthogonal experiment

釆用正交試驗對紅棗總酚的提取條件進行優(yōu)化，正交試驗結(jié)果如表2所示。總酚提取工藝方差分析結(jié)果見表3。

表2 L9（34）正交試驗結(jié)果Table 2 The result of orthogonal experiment L9（34）

表3總酚提取工藝方差分析Table 3 The total phenol extraction process of analysis of variance

從極差分析中可以看出，各因素對紅棗總酚得率的影響主次順序為：甲醇體積分數(shù)（A）>料液比（B）>提取次數(shù)（D）>提取時間（C）。極值最小的提取時間（C）因素為誤差項進行方差分析，甲醇體積分數(shù)（A）因素影響顯著（P<0.01），其他因素則無顯著性影響。最佳提取工藝組合為：A1B2C2D2，即甲醇濃度50 %，提取時間為30 min，料液比1∶10（g/mL），提取次數(shù)2次。在該工藝條件下，紅棗總酚的得率最高。

2.3穩(wěn)定性試驗

取紅棗果肉樣品，按正交試驗選定的最優(yōu)提取方法制備總酚樣品溶液，按單因素試驗選定的最優(yōu)檢測方法進行總酚含量的測定，分別于顯色反應(yīng)（60 min）穩(wěn)定后每10 min測定一次吸光度。穩(wěn)定性測定結(jié)果如圖7所示。

圖7紅棗總酚穩(wěn)定性Fig.7 Stability of total phenolic contents in Dried Jujubes samples

結(jié)果表明：在0~2 h內(nèi)測定值仍比較穩(wěn)定，60 min后吸光度略有下降，其RSD為0.578 %。

2.4重復(fù)性

取同一份紅棗果肉樣品，按選定方法制備樣品溶液，樣品平行處理6次，測定吸光度，計算吸光度值A(chǔ)的相對標準偏差，RSD為1.32 %，表明該試驗方法的重復(fù)性良好。

2.5加樣回收

精密稱取6份果肉樣品各0.3 g，分成3組，各組分別加入對照品溶液100 μg，按試驗方法測定吸光度，并計算加樣回收率和相對標準偏差，結(jié)果如表4所示。

表4回收率試驗結(jié)果Table 4 The results of recovery experiment

平均回收率為98.79 %，RSD為1.71 %，符合方法要求的回收率，表明該紅棗總酚提取方法和測定方法可用于總酚含量的測定。

2.6總酚含量測定結(jié)果

分別對12個不同品種紅棗果肉和果核中總酚含量進行測定，結(jié)果見表5。

表5不同品種紅棗樣中總酚含量Table 5 Total phenolic contents in different Dried Jujubes cultivars

由表5可以看出，紅棗不同品種果實果肉中的平均總酚含量為1378.05mg/100g，變幅為751.25mg/100 g。其中哈密大棗中含量最高是1837.48 mg/100 g，新疆小圓棗的含量最低為1 086.23 mg/100 g。

紅棗不同品種果核中的平均總酚含量為243.77 mg/ 100 g，變幅為91.20 mg/100 g。哈密大棗中含量最高是296.15 mg/100 g，金昌1號的總酚含量最低為204.95 mg/100 g。經(jīng)方差分析可知同一個品種紅棗果肉和的果核中總酚含量差異顯著（P<0.05），果肉中總酚含量約為果核的6倍。

3　結(jié)論

由于不同研究文獻中Folin-Ciocalteu比色法的比色條件有一定的差異，對于不同的樣品材料會產(chǎn)生比較大的誤差[9]。本文采用單因素試驗對Folin-Ciocalteu比色法對測定紅棗總酚含量進行系統(tǒng)的研究，以沒食子酸作為標準品，沒食子酸在濃度為0~100 μg/mL內(nèi)與其吸光值有良好的線性關(guān)系（r = 0.998 8）；檢測波長經(jīng)試驗測定為760 nm，紅棗提取液在Folin-Ciocalteu試劑1.5 mL、25 % Na2CO3溶液2.0 mL、反應(yīng)溫度30℃、反應(yīng)時間60 min的條件下，測定其760 nm處的吸光值；采用正交試驗對紅棗多分的溶劑提取工藝進行了研究，確定了最佳提取工藝條件為：甲醇濃度50 %，提取時間30 min，料液比1∶10（g/mL），提取次數(shù)2次。平均回收率為98.79 %，RSD為1.71 %。該法是檢測紅棗中總酚含量的可靠方法。

測定加過表明：此次涉及的12個紅棗品種總酚較高，但不同品種間含量差異顯著，果肉中總酚含量為1 837.48 mg/100 g~1 086.23 mg/100 g，果核中總酚含量為296.15 mg/100 g~204.95 mg/100 g。朱銳等的研究表明，同一品種紅棗間因栽培環(huán)境和管理措施不同棗果中的營養(yǎng)成分存在差異[6]。本研究中12個供試品紅棗品種均采自同一樣地，栽培環(huán)境和管理措施一致，說明不同品種紅棗間的總酚含量及抗氧化活性存在差異主要與紅棗的基因型有關(guān)。

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Determination of Total Polyphenols in Different Parts of Jujubae Fruetus Growing in Xinjiang

YANG Lu1，NUERBIYE2，LI Hong1，*
（1.Xinjiang Academy of Forestry，Urumqi 830000，Xinjiang，China；2.College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，Xinjiang，China）

Abstract：The study was to investigate an optimal Folin -Ciocalteu colorimetric method to determine polyphenols in Dried Jujubes systematically，and to provide an effective way to estimate the polyphenols for the value of Dried Jujubes. Gallic acid was used as a standard substance to determine total polyphenol contents in different parts of Dried Jujubes growing in Xinjiang by Folin-Ciocaheu Colorimetry. With the content of total phenols as index，effects of solvent concentration，solid-liquid ratio extraction time and times on extraction technology of total phenols were investigated by L9（34）orthogonal test，in order to define preparation method of the test solution for determination. The results showed that when the concentration of Folin- Ciocalteu reagent was 1.5 mL and the concentration of 25 %Na2CO3was 2 mL，reaction 60 min in 30℃，there was a good linearity relationship between absorption value with the concentration from 0-100 μg/mL in 760 nm（R2= 0.998 8））. The total phenol in Dried Jujubes in 1∶10（g/mL）to 50 % methanol for 30 min would with two times be preferably extracted.Theaveragespikedrecoverywas98.79%，witha RSDof1.71%．Theextractionanddeterminationmethods were suitable for the determination of total phenol in Jujubae Fruetus samples．The same total phenol contents differences between the pulp and core is larger，pulp total phenol content is about 6 times of core of the fruit.

Key words：Jujubae Fruetus；total polyphenols；orthogonal test；single factor test；Folin-Ciocalteu colorimetry

收稿日期：2014-08-26

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.036

*通信作者：李宏（1962—），男，研究員，博士，主要從事林果栽培和綜合利用研究。

作者簡介：楊璐（1985—），女（漢），碩士，主要從事植物資源化學(xué)與生物活性物質(zhì)研究。

基金項目：特色林果重大病蟲持續(xù)高效綠色防控技術(shù)研究（項目編號：201130102-3）