牛奶體細(xì)胞數(shù)檢測(cè)的研究進(jìn)展

嚴(yán)建軍，高　炎,高　飛

(1.寧波市計(jì)量測(cè)試研究院, 浙江 寧波　315048；2.浙江工業(yè)大學(xué) 計(jì)算機(jī)學(xué)院, 杭州　310023)

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牛奶體細(xì)胞數(shù)檢測(cè)的研究進(jìn)展

嚴(yán)建軍1，高炎2,高飛2

(1.寧波市計(jì)量測(cè)試研究院, 浙江 寧波315048；2.浙江工業(yè)大學(xué) 計(jì)算機(jī)學(xué)院, 杭州310023)

摘要：快速準(zhǔn)確的牛奶體細(xì)胞數(shù)檢測(cè)對(duì)于保證牛奶品質(zhì)和監(jiān)測(cè)奶牛健康具有重要意義;從牛奶體細(xì)胞數(shù)的基本概念、牛奶體細(xì)胞對(duì)牛奶的影響、國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)程、牛奶體細(xì)胞數(shù)檢測(cè)方法、相關(guān)檢測(cè)儀器的發(fā)展等方面對(duì)牛奶體細(xì)胞數(shù)檢測(cè)的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，分析了各種檢測(cè)方法和檢測(cè)儀器的優(yōu)缺點(diǎn)，指出了作為熱點(diǎn)方法之一的基于計(jì)算機(jī)視覺(jué)的牛奶體細(xì)胞數(shù)檢測(cè)關(guān)鍵是體細(xì)胞圖像分割與識(shí)別的準(zhǔn)確性、識(shí)別速度以及相應(yīng)自動(dòng)化儀器的研制。

關(guān)鍵詞：牛奶體細(xì)胞數(shù)；計(jì)算機(jī)視覺(jué)；圖像處理；檢測(cè)儀器

0引言

根據(jù)《2007-2008年中國(guó)乳制品市場(chǎng)調(diào)查與投資咨詢(xún)研究報(bào)告》顯示，未來(lái)的5~10年內(nèi)行業(yè)收入將保持20%以上的增長(zhǎng)速度，中國(guó)奶制品消費(fèi)仍存在翻倍的增長(zhǎng)空間，因此中國(guó)乳品行業(yè)在今后較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)都將處于不斷增長(zhǎng)階段，而在食品安全事故頻發(fā)的今天，要想實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的長(zhǎng)久戰(zhàn)略，中國(guó)乳制品企業(yè)無(wú)疑要在乳制品安全和品質(zhì)檢測(cè)方面有所突破。

為發(fā)展乳業(yè)，近幾年國(guó)家陸續(xù)修訂了部分舊標(biāo)準(zhǔn)，引進(jìn)了一些國(guó)外的概念與標(biāo)準(zhǔn)，其中值得重點(diǎn)關(guān)注的就是牛奶體細(xì)胞數(shù)(somatic cell count，SCC)的標(biāo)準(zhǔn)[1]。偏高的SCC意味著奶牛具有炎癥或處于亞健康狀態(tài)，快速準(zhǔn)確的牛奶體細(xì)胞數(shù)檢測(cè)對(duì)于保證牛奶品質(zhì)和監(jiān)測(cè)奶牛健康都具有重大意義。國(guó)外學(xué)者、公司圍繞著牛奶體細(xì)胞數(shù)的檢測(cè)作了大量的研究工作與市場(chǎng)化運(yùn)作，取得了相當(dāng)?shù)某晒?，而我?guó)對(duì)這方面的工作進(jìn)展較緩慢，下面從牛奶體細(xì)胞數(shù)的基本概念、牛奶體細(xì)胞對(duì)牛奶的影響、國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)程、牛奶體細(xì)胞數(shù)檢測(cè)方法、相關(guān)檢測(cè)儀器的發(fā)展等方面作研究綜述。

1什么是牛奶體細(xì)胞數(shù)

SCC是指每毫升牛奶中的體細(xì)胞總數(shù)[2]，該指標(biāo)偏高意味著就表明奶?？赡芴幱趤喗】禒顟B(tài)或疾病狀態(tài)[3]。SCC最早由美國(guó)提出，然后法國(guó)、德國(guó)、瑞典、荷蘭和英國(guó)等在20世紀(jì)開(kāi)始在此領(lǐng)域開(kāi)展了大量的研究，并把SCC作為奶牛健康和原料奶質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)，納入原料奶收購(gòu)的計(jì)價(jià)體系，用于指導(dǎo)奶牛養(yǎng)殖。

2牛奶體細(xì)胞對(duì)牛奶的影響

正常情況下，牛奶中體細(xì)胞數(shù)在20~30萬(wàn)個(gè)/mL；當(dāng)乳房外傷或發(fā)生疾病(如乳房炎等)時(shí)，體細(xì)胞數(shù)一般超過(guò)50萬(wàn)個(gè)/mL，此時(shí)可判斷奶牛感染病菌可能性很大，乳房炎發(fā)病率較高。為進(jìn)一步量化判斷奶牛生病的情況，目前通常采用加利福尼亞檢測(cè)法CMT的標(biāo)準(zhǔn)[6]，如表1所示。

表1　CMT判斷標(biāo)準(zhǔn)

圖1　牛奶體細(xì)胞數(shù)常用檢測(cè)方法與理化特性關(guān)系示意

從上述分析看，牛奶體細(xì)胞數(shù)反映了牛奶產(chǎn)量、質(zhì)量及奶牛的健康狀況，是奶牛乳房健康狀況的重要指標(biāo)，也反映了一個(gè)地區(qū)或國(guó)家奶牛業(yè)發(fā)展的管理狀況[4]。因此，乳制器生產(chǎn)廠家在檢測(cè)原料奶時(shí)，不僅要從蛋白質(zhì)和脂肪含量來(lái)判斷原料奶的質(zhì)量，還應(yīng)以乳中的SCC含量來(lái)判斷牛奶的質(zhì)量，這不僅有利于保障消費(fèi)者的健康，還有利于生產(chǎn)廠家保證產(chǎn)品質(zhì)量，降低產(chǎn)品成本，獲得更多的經(jīng)濟(jì)利益。

3牛奶體細(xì)胞數(shù)研究進(jìn)程

上世紀(jì)70-80年代，發(fā)達(dá)國(guó)家逐漸

將SCC納入監(jiān)測(cè)范疇[7-8]。美國(guó)聯(lián)邦法律規(guī)定，對(duì)冷卻罐奶進(jìn)行5次體細(xì)胞數(shù)檢測(cè)，其中3次的體細(xì)胞數(shù)小于75萬(wàn)個(gè)/mL才能銷(xiāo)售[9]。絕大多數(shù)專(zhuān)家、獸醫(yī)師認(rèn)為，體細(xì)胞數(shù)小于20萬(wàn)個(gè)/mL為正常，超過(guò)則為異常[10-11]。美國(guó)Pennsylvania State of University[12]和Cornell University[13]對(duì)牛奶體細(xì)胞數(shù)和感染牛的比例關(guān)系進(jìn)行了研究。將牛奶體細(xì)胞數(shù)用于牛場(chǎng)管理與奶牛健康監(jiān)測(cè)的主要體現(xiàn)在DHI(dairy herd improvement)體系中。DHI最早出現(xiàn)在1906年的歐洲[14]，稱(chēng)為奶牛牛群改良計(jì)劃，經(jīng)過(guò)100多年的完善應(yīng)用，逐步成為國(guó)際上通用的奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定體系及牛場(chǎng)管理方案，它主要通過(guò)定期檢測(cè)奶牛的乳脂率、產(chǎn)奶量、體細(xì)胞數(shù)、蛋白量等等指標(biāo)形成測(cè)定報(bào)告，以此作為奶牛健康、牛場(chǎng)管理效率的依據(jù)，其中由于其他相關(guān)指標(biāo)與體細(xì)胞數(shù)存在著一定的相關(guān)關(guān)系，因此，體細(xì)胞數(shù)成為了DHI體系中最重要的指標(biāo)[15]。目前發(fā)達(dá)國(guó)家DHI測(cè)定率較高，如德國(guó)、丹麥、瑞典、荷蘭、加拿大等測(cè)定率分別達(dá)到了100%、92%、85%、84.5%和65.8%，美國(guó)引入DHI較歐洲晚，自上世紀(jì)50年代開(kāi)始規(guī)模性實(shí)施DHI，并于70到80年代將SCC引入DHI中[16]，至2011年乳牛存欄920萬(wàn)頭，產(chǎn)奶量為8 898.6萬(wàn)噸，奶牛減少1/2而其產(chǎn)奶量卻增加了1.8倍[17]。

我國(guó)在實(shí)施DHI體系方面起步較晚，最早于1994年與加拿大合作，在上海、杭州、西安三地建立了DHI實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)過(guò)近20年的發(fā)展，截止2011年，我國(guó)已建成23個(gè)奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定實(shí)驗(yàn)室，參測(cè)牛場(chǎng)1 054個(gè)，參測(cè)奶牛頭數(shù)46.7萬(wàn)頭，提供DHI報(bào)告累計(jì)100余萬(wàn)份，體細(xì)胞數(shù)由66.1萬(wàn)mL-1降低到42.1萬(wàn)mL-1，按當(dāng)前參測(cè)奶牛頭數(shù)計(jì)算，直接經(jīng)濟(jì)效益增加12億元[17]。目前，上海、北京、天津和西安是中國(guó)范圍內(nèi)SCC測(cè)試規(guī)模較大的城市，然而，DHI的測(cè)定率僅為5%左右與歐美發(fā)達(dá)國(guó)家比較還有一定的差距，加拿大在慶祝DHI成立100周年之際，我國(guó)還有不少地方連SCC是什么也未知。事實(shí)上，體細(xì)胞的高低直接反映了一個(gè)牧場(chǎng)的總體管理水平，目前我國(guó)存在著牛場(chǎng)管理人員對(duì)DHI測(cè)定認(rèn)識(shí)不足、SCC檢測(cè)方法與儀器落后等不足。

4牛奶體細(xì)胞數(shù)主要檢測(cè)方法

鑒于牛奶體細(xì)胞數(shù)的重要性，國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)牛奶體細(xì)胞的不同理化特性展開(kāi)了深入的研究并提出了不同的體細(xì)胞數(shù)檢測(cè)方法，具體分為直接檢測(cè)法與間接檢測(cè)法，如圖1所示。下面詳細(xì)綜述每種方法的基本原理及其優(yōu)缺點(diǎn)。

4.1間接檢測(cè)法

4.1.1CMT法

1957年，O. W. Schalm[6]最早提出CMT(california mastitis test)，稱(chēng)為加利福尼亞細(xì)胞數(shù)測(cè)定法，其方法原理是牛奶中的體細(xì)胞遇到氫氧化鈉(NaOH)、烷基芳基磺酸(alkylaryl sulfonic acid)、烷基芒硫酸鹽(Alkyl mans sulfate)或溴甲酚紅紫(bromocresol purple)等表面活性試劑將收縮凝固并釋放出去氧核糖核酸(DNA)，同時(shí)產(chǎn)生凝聚，體細(xì)胞越多，凝聚狀態(tài)越強(qiáng)，凝聚塊越多，通過(guò)統(tǒng)計(jì)這些凝聚塊可估算體細(xì)胞的數(shù)量。

CMT法快速、敏感，價(jià)格便宜，方法簡(jiǎn)單，所需設(shè)備少，結(jié)果較為準(zhǔn)確，與直接鏡檢體細(xì)胞數(shù)、過(guò)氧化氫酶活性等也有較好的關(guān)聯(lián)性(R=0.89)[19]，環(huán)境溫度影響小，外源物質(zhì)(如毛發(fā))不會(huì)影響結(jié)果，適用于個(gè)體奶牛或總奶樣的檢驗(yàn)；不足之處在于它只是體細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量，人為因素影響較大，需專(zhuān)門(mén)培訓(xùn)人員固定做此項(xiàng)檢查。有時(shí)CMT法會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，如牛乳不新鮮或末乳等，最佳奶樣為泌乳量中期的牛奶。另外，由于細(xì)菌產(chǎn)生的毒素會(huì)破壞體細(xì)胞，臨床乳腺炎陽(yáng)性的牛奶會(huì)表現(xiàn)為陰性。

4.1.2WMT法

WMT(wisconsin mastitis test)由D. I. Thompson于1964年提出[20]，稱(chēng)為威斯康辛乳腺炎檢測(cè)法，它是對(duì)總奶樣進(jìn)行檢驗(yàn)。WMT的原理基礎(chǔ)與CMT類(lèi)似，所用表面活性試劑也一樣，即利用活性試劑促使體細(xì)胞釋放DNA并產(chǎn)生凝聚。WMT檢測(cè)以毫米為單位進(jìn)行記錄，具體而言，首先建立WMT測(cè)試值與體細(xì)胞數(shù)的映射表，即T={(WMTi,SCCi) |i=1, 2, …, 33}，如表2所示，然后，在操作時(shí)將定量的待測(cè)奶樣與等量的活性試劑在帶有刻度的試管中混合8~10 s后，將試管傾斜，讓混合物排出，15 s后恢復(fù)垂直位置，等待1 min后讀取留在試管中混合物的高度，令其為WMTk，通過(guò)查表，則對(duì)應(yīng)的SCCk即為相應(yīng)的體細(xì)胞數(shù)。牛奶中體細(xì)胞越多，形成的膠體就會(huì)越多，讀取的數(shù)值WMTk也越高。

表2　WMT檢測(cè)值與體細(xì)胞數(shù)映射表[23]

WMT法認(rèn)為WMTk小于8 mm時(shí)為理想奶樣，且WMTk小于19 mm時(shí)其測(cè)定精度較高，而超過(guò)19 mm的牛奶需要更為精確和嚴(yán)格的方法(如顯微鏡檢法)來(lái)測(cè)定[21]。與CMT相比，WMT法較為簡(jiǎn)便，應(yīng)用較為廣泛，其結(jié)果不是估計(jì)而是測(cè)定，因此增加了實(shí)驗(yàn)的客觀性，但需較復(fù)雜的設(shè)備，測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)，其與直接鏡檢法的相關(guān)性與CMT大致相當(dāng)(R=0.88)[22]。

4.1.3DNA法

DNA檢測(cè)法的原理基礎(chǔ)是體細(xì)胞中的DNA含量與體細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性。Urbanová等[24]建立了DNA含量與體細(xì)胞數(shù)之間的相關(guān)性，其換算系數(shù)為λ=106個(gè)體細(xì)胞/8毫克DNA，具體檢測(cè)時(shí)，仍然通過(guò)活性試劑促使體細(xì)胞被破壞并釋放出DNA，然后采用分光光度計(jì)測(cè)定得到DNA的重量A，若其對(duì)應(yīng)的體積為V毫升，則檢測(cè)結(jié)果按SCC=A*λ/V進(jìn)行計(jì)算。該方法顯示出與標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡檢測(cè)較高的一致性，達(dá)0.997，具有比傳統(tǒng)DNA原理方法如CMT、WMT等更高的精度。然而，其重現(xiàn)性以及DNA含量與體細(xì)胞數(shù)本身的相關(guān)性未見(jiàn)批露，同時(shí)由于DNA分離所固有的困難性，DNA含量的精確含量本身就帶有很大的誤差，目前僅在實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證了其可行性，難以在奶場(chǎng)或牛奶加工現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模應(yīng)用。

4.1.4ATP法

ATP法(adenosine triphosphate, ATP)早期成功用于鮮肉、牛奶等領(lǐng)域的細(xì)菌檢測(cè)中[25]，后來(lái)被用于牛奶體細(xì)胞數(shù)的檢測(cè)，其基本原理是利用體細(xì)胞內(nèi)的ATP在熒光素酶的作用下，熒光素與ATP結(jié)合產(chǎn)生的熒光和ATP濃度成正比，由此可以通過(guò)測(cè)定熒光的強(qiáng)度來(lái)間接測(cè)定ATP的濃度，從而測(cè)定牛奶體細(xì)胞數(shù)[26-27]。文獻(xiàn)[27]通過(guò)BLW0401微量光度計(jì)與顯微鏡檢法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，建立了熒光度與體細(xì)胞數(shù)的線(xiàn)性相關(guān)性，其相關(guān)性為0.905 6，初步驗(yàn)證了該方法的可行性，該方法不具重現(xiàn)性。

4.1.5EC法

電導(dǎo)率(electrical conductivity, EC)檢測(cè)法的基本原理是奶牛乳房發(fā)生炎癥時(shí)，所分泌乳汁的鈉、氯、HCO3-離子的濃度增加，引起電導(dǎo)率的增加，而電導(dǎo)率與體細(xì)胞數(shù)之間存在著正相關(guān)性[28-30]。郭慶等[29]通過(guò)實(shí)驗(yàn)建立了電導(dǎo)率與體細(xì)胞數(shù)的擬合曲線(xiàn)關(guān)系：y=3.013x2-7.081x+9.306，y表示電導(dǎo)率，x表示體細(xì)胞數(shù)，其中體細(xì)胞計(jì)數(shù)與電導(dǎo)率測(cè)定儀器分別采用CMT奶牛乳房炎診斷試劑和CONscan 型數(shù)顯電導(dǎo)率儀。方海田等[30]利用Bently-Somacount-150 型體細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和DDS-11A型數(shù)顯電導(dǎo)率儀分別測(cè)定給定奶樣的體細(xì)胞計(jì)數(shù)與電導(dǎo)率，然后利用曲線(xiàn)擬合得到電導(dǎo)率與體細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系：y=0.5838Ln(x)+4.0807，其中y表示電導(dǎo)率，x表示體細(xì)胞數(shù)，Ln表示自然對(duì)數(shù)，其相關(guān)性達(dá)0.933 4。該方法操作雖然簡(jiǎn)單且有一定準(zhǔn)確性，然而由于奶牛種屬、年齡、胎次、溫度、季節(jié)以及其他代謝疾病的影響，其電導(dǎo)率與體細(xì)胞數(shù)之間的正相關(guān)量化模型并不統(tǒng)一且不穩(wěn)定，由此導(dǎo)致體細(xì)胞數(shù)存在較大差異[31]，電導(dǎo)率目前主要用于定性檢測(cè)奶牛乳腺炎。

4.1.6pH法

正常牛奶的pH值通常在6.5~6.8之間，然而隨著體細(xì)胞數(shù)量的增加，其酸堿度值也可能超過(guò)7.0[32]。當(dāng)奶牛發(fā)生乳腺炎時(shí)，毛細(xì)血管的滲透性增加，偏堿性的血液成分進(jìn)入到牛奶中，從而導(dǎo)致牛奶的pH值增加[32]。測(cè)試時(shí)，通常采用溴百里酚藍(lán)試劑，根據(jù)對(duì)應(yīng)的1~4檔顏色值，可區(qū)分出乳腺炎的程度或類(lèi)型。Mijnen 等[33]認(rèn)為pH法與SCC、電導(dǎo)率等方法之間相關(guān)性較弱，其檢測(cè)價(jià)值有限。Marschke等[34]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明pH值對(duì)于從大范圍中區(qū)分正常與非正常乳腺的敏感度均等。劉文進(jìn)等[35]嘗試建立體細(xì)胞數(shù)與pH值之間的定量關(guān)系，并在酒精陽(yáng)性乳實(shí)驗(yàn)中給出了如表3所示的對(duì)應(yīng)關(guān)系，該關(guān)系是否具有推廣性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。郭慶等[36]則通過(guò)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明pH在6.5～6.8和6.8～7.0之間時(shí)，體細(xì)胞數(shù)的顯著性差異較明顯(P>0.05)。Tabidi 等[37]通過(guò)比較證明pH法在識(shí)別隱性乳腺炎方面其敏感度優(yōu)于CMT方法。通過(guò)與CMT方法對(duì)比指出pH法是一種定性方法，該方法對(duì)于識(shí)別隱性乳房炎具有較好的敏感性，具有操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)查看等優(yōu)點(diǎn)，但與其他類(lèi)型的乳房炎以及與牛體體細(xì)胞數(shù)之間的相關(guān)性較差。

表3　牛奶體細(xì)胞數(shù)與pH的對(duì)應(yīng)關(guān)系[35]

4.1.7黏度法

與CMT、DNA法類(lèi)似，黏度(Gel Formation)法的基本原理在于利用活性試劑促使體細(xì)胞釋放出DNA之后，牛奶將變稠，體細(xì)胞越多，則釋放的DNA越多，牛奶的黏度也越高，利用這種體細(xì)胞數(shù)與黏度之間的相關(guān)性，通過(guò)黏度值可測(cè)算其體細(xì)胞數(shù)[38]。唐平[39]通過(guò)實(shí)驗(yàn)初步建立了牛奶體細(xì)胞數(shù)與黏度、溫度之間的線(xiàn)性關(guān)系如下：SCC=4.787 44×η+3.727 55×T-89.913 37，其中η表示黏度，可用黏度計(jì)進(jìn)行測(cè)量，T表示溫度，其自相關(guān)性系數(shù)達(dá)0.99以上(P<0.001)，通過(guò)與直接鏡檢法的比較也無(wú)顯著性差異。Atasever等[40]在實(shí)驗(yàn)中證明利用黏度方法測(cè)算體細(xì)胞數(shù)具有很高的重現(xiàn)性，然而與直接鏡檢法相比，則其相關(guān)性偏低(R=0.783，P<0.01)。黏度法具有簡(jiǎn)單方便的優(yōu)點(diǎn)，但其對(duì)于精確測(cè)量體細(xì)胞數(shù)仍有較大的誤差，且其取值受溫度、種群等影響較大，適用于快速、粗略的體細(xì)胞數(shù)檢測(cè)。

4.1.8REP法

介質(zhì)在外加電場(chǎng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生感應(yīng)電荷而削弱電場(chǎng)，原外加電場(chǎng)(真空中)與介質(zhì)中電場(chǎng)的比值即為相對(duì)介電常數(shù)(relative electric permittivity, REP)，它與頻率相關(guān)。利用REP法進(jìn)行體細(xì)胞數(shù)檢測(cè)的基本原理在于，具有完整細(xì)胞質(zhì)的體細(xì)胞在低頻電場(chǎng)下不容易極化，只具有較低的相對(duì)介電常數(shù)，但在某種特定頻率的電場(chǎng)下會(huì)產(chǎn)生極化并具有較高的相對(duì)介電常數(shù)，而這種相對(duì)介電常數(shù)值會(huì)隨著體細(xì)胞數(shù)的增加而增加，呈現(xiàn)一定的正相關(guān)關(guān)系[41-42]。Grillo等[43]通過(guò)2年的實(shí)驗(yàn)證明在溫度為10 ℃～34 ℃、電壓為100 mV以及電場(chǎng)頻率為300 kHz的情況下，相對(duì)介電常數(shù)與SCC之間的正相關(guān)關(guān)系最佳(R=0.988 1)，如式(1)所示，其中T表示溫度，R表示在該環(huán)境下測(cè)得的相對(duì)介電常數(shù)。該方法與電導(dǎo)率法相比，具有較好的準(zhǔn)確度與重現(xiàn)性，結(jié)果與直接鏡檢法具有良好的正相關(guān)性，尤其對(duì)于檢測(cè)隱性乳腺炎時(shí)具有較低的假陽(yáng)性和假陰性，但對(duì)于22 ℃～30 ℃時(shí)體細(xì)胞數(shù)在30萬(wàn)/mL左右時(shí)，其誤差率將達(dá)到20%~30%。

(1)

4.1.9IRT法

紅外熱成像法(Infrared thermography，IRT)用于檢測(cè)牛奶體細(xì)胞數(shù)的基本原理在于受感染的奶牛乳房表面溫度與牛奶體細(xì)胞數(shù)存在著一定的正相關(guān)關(guān)系[44]。Polat等[45]通過(guò)實(shí)驗(yàn)建立了受感染奶牛乳房表面溫度與體細(xì)胞數(shù)之間的計(jì)算模型：USST=32.12+0.49×ln(SCC)，其中USST為表面溫度，℃，SCC為體細(xì)胞數(shù)，單位為103mL-1，在其實(shí)驗(yàn)中，其相關(guān)性為R=0.85(P<0.000 1)。具體檢測(cè)時(shí)，可使用紅外熱成像儀在大約1.5米的距離對(duì)奶牛乳房進(jìn)行熱成像，根據(jù)得到的溫度值及其相關(guān)關(guān)系模型可估算出其SCC[46]。紅外熱成像法所檢測(cè)表面溫度與體細(xì)胞數(shù)的正相關(guān)性一般，以估算為主，尤其在SCC<40萬(wàn)mL-1時(shí)其相關(guān)性迅速下降，而其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單方便，用于隱性乳腺炎的檢測(cè)時(shí)準(zhǔn)確度較高。

4.1.10其他檢測(cè)法

崔傳金等[47]基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立了溫度、電導(dǎo)率和電容等綜合參數(shù)與體細(xì)胞數(shù)之間的預(yù)測(cè)模型，其正確檢出率達(dá)到95%。吳海云等[48]以標(biāo)準(zhǔn)的碘酊染色顯微鏡體細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果為基準(zhǔn)，采用支持向量回歸的方法試圖建立奶樣電阻、電雙層電容等電參數(shù)與體細(xì)胞數(shù)之間的預(yù)測(cè)模型，該模型對(duì)于1級(jí)、2級(jí)和3級(jí)乳腺炎的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證較準(zhǔn)確，它為牛奶體細(xì)胞數(shù)在線(xiàn)檢測(cè)提供了一種較新的思路，但對(duì)N級(jí)奶樣的體細(xì)胞預(yù)測(cè)精度及檢出正確度有待進(jìn)一步研究與提高。

4.2直接檢測(cè)法

間接檢測(cè)方法主要是通過(guò)檢測(cè)牛奶體細(xì)胞所具備的不同物理、化學(xué)特性值并通過(guò)它們與體細(xì)胞數(shù)量之間的相關(guān)關(guān)系式進(jìn)行體細(xì)胞數(shù)估算，可以快速區(qū)分健康與患乳腺炎的奶牛，但對(duì)于詳細(xì)區(qū)分乳腺炎奶牛的病癥嚴(yán)重程度則作用有限。直接檢測(cè)方法用于體細(xì)胞計(jì)數(shù)具有準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。

4.2.1人工鏡檢法

人工鏡檢法是指直接采用顯微鏡觀察載玻片上的牛奶樣品并由人工對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法[49]，其基本步驟由如下幾步構(gòu)成[50]：(1)配置染色液，首先將54 mL乙醇和40 mL四氯乙烷混合搖勻并置于65 ℃的水溶液中加熱3分鐘，再加入0.6 g甲基蘭，混勻降溫至4 ℃，最后加入6 mL冰醋酸，常溫保存；(2)用微量注射器將10 μL生鮮奶樣注射到1 cm2的載玻片上，在恒溫箱中放平、干燥，浸入染色液，最后形成均勻玻片；(3)利用300~500倍顯微鏡觀察玻片上的染色細(xì)胞，根據(jù)一定的準(zhǔn)則得到體細(xì)胞計(jì)數(shù)。將上述傳統(tǒng)鏡檢法的染色液改成特制的熒光劑，則改進(jìn)為熒光鏡檢法[51]，由于熒光細(xì)胞與背景的對(duì)比更加明顯，使體細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)現(xiàn)更加容易。

人工鏡檢法依靠實(shí)驗(yàn)員通過(guò)顯微鏡觀察載玻片中的奶樣并得到其中的體細(xì)胞數(shù)量，具有較高的準(zhǔn)確度，是標(biāo)定其他體細(xì)胞計(jì)數(shù)方法、儀器的標(biāo)準(zhǔn)，但存在操作繁瑣、勞動(dòng)量太大等不足，適用于小樣本的精確檢測(cè)，同時(shí)由于奶樣容易干燥等因素，重現(xiàn)性較差。

4.2.2電脈沖法

電脈沖法的基本原理是當(dāng)新鮮奶樣中的體細(xì)胞通過(guò)由2個(gè)電極構(gòu)成的狹縫時(shí)，這2個(gè)電極之間的電阻值因?yàn)轶w細(xì)胞的存在而增加，電極之間的電壓值隨之加大并產(chǎn)生電脈沖，每通過(guò)一個(gè)體細(xì)胞也將產(chǎn)生一個(gè)電脈沖，利用相關(guān)儀器檢測(cè)電脈沖的數(shù)量即可得到體細(xì)胞數(shù)[52]。電脈沖法檢測(cè)時(shí)間短，結(jié)果與人工鏡檢法有著幾乎一致的相關(guān)性[53]，但該方法需要事先設(shè)定脈沖的臨界值，且需較長(zhǎng)時(shí)間的校正才能達(dá)到穩(wěn)定測(cè)量。

4.2.3光脈沖法

光脈沖法的基本原理是首先用溴化乙錠(Ethidium bromide)等高靈敏度的熒光劑對(duì)鮮奶樣品進(jìn)行染色，然后在檢測(cè)時(shí)讓被染色的體細(xì)胞逐個(gè)通過(guò)一條流路縫隙，該縫隙被設(shè)計(jì)得足夠小以使體細(xì)胞僅能一個(gè)一個(gè)通過(guò)，這些體細(xì)胞在通過(guò)流路時(shí)會(huì)被觀察室的藍(lán)光激發(fā)并發(fā)出紅色光，它會(huì)被光電倍增器放大并作為光脈沖進(jìn)行計(jì)數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)牛奶體細(xì)胞數(shù)的檢測(cè)[21，54]。光脈沖法具有速度快、重復(fù)性好等特點(diǎn)，適用于集中大樣品檢測(cè)，但其結(jié)果通常會(huì)比人工鏡檢法偏大[54]。

4.2.4計(jì)算機(jī)視覺(jué)鏡檢法

隨著數(shù)字圖像技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外開(kāi)始尋求基于計(jì)算機(jī)視覺(jué)的體細(xì)胞數(shù)檢測(cè)方案。G.L. Pettipher[55]早在1982年就提出了半自動(dòng)的用于細(xì)胞計(jì)數(shù)的圖像分析程序。Michael等[56]提出了幾種自適應(yīng)的細(xì)胞大小閾值選擇算法。Gustavo J. Grillo等[57]提出了一種基于PC的低成本的視頻顯微鏡系統(tǒng)，用于檢測(cè)鮮牛奶中的體細(xì)胞數(shù)。J. S. Moon[51]利用數(shù)碼顯微鏡采集到奶樣圖像，然后利用模式識(shí)別方法得到體細(xì)胞數(shù)。劉俊麗[58]認(rèn)為圖像處理在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，但是對(duì)牛奶的細(xì)胞圖像的研究是目前圖像處理中較新的課題之一。劉海霞[23]指出，牛乳中的細(xì)胞主要是體細(xì)胞，并提出一種基于圖像連通判別的牛奶體細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。薛河儒等[59]對(duì)牛乳體細(xì)胞彩色圖像分割方法展開(kāi)了研究，提出了基于數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)及融合技術(shù)的二維彩色圖像分割方法，其不足之處在于牛奶涂片與成像方法、堆積細(xì)胞分離方法等缺乏有效處理。其中用到的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法主要有連通計(jì)數(shù)法[60]、連通曲線(xiàn)計(jì)數(shù)法[61]。

5相關(guān)檢測(cè)儀器的發(fā)展情況

目前， 在奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)與牛奶加工廠中，牛奶體細(xì)胞計(jì)數(shù)主要依靠大型的體細(xì)胞計(jì)數(shù)儀完成，比較有代表性的產(chǎn)品包括采用電脈沖法的丹麥Foss公司的Fossomatic 5000系列體細(xì)胞分析儀[21]、荷蘭Delta公司的Somascope計(jì)數(shù)儀[62]、美國(guó)Bentley公司的Somacount 150計(jì)數(shù)儀[51]，等等；采用光脈沖法的有美國(guó)Bechman公司的庫(kù)爾特計(jì)數(shù)儀(Coulter Somatic Cell Counter)[52]。這類(lèi)儀器檢測(cè)速度較快，準(zhǔn)確率較高，但操作流程復(fù)雜，設(shè)備單價(jià)與使用成本均較高，同時(shí)，它們不是由形態(tài)學(xué)特點(diǎn)辨識(shí)各類(lèi)白細(xì)胞，所以不能觀察白細(xì)胞形態(tài)，也不能保留樣本。另一方面，隨著數(shù)字圖像技術(shù)的發(fā)展，基于計(jì)算機(jī)視覺(jué)牛奶體細(xì)胞計(jì)數(shù)儀也陸續(xù)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，代表性產(chǎn)品如美國(guó)Bentley公司的Somacount 300計(jì)數(shù)儀[63]、瑞典的DeLaval計(jì)數(shù)儀(DeLaval Cell Counter)[64]、韓國(guó)C-reader體細(xì)胞計(jì)數(shù)儀CRP-200[51，65]，這些儀器價(jià)格均較高。

集成間接檢測(cè)法的整機(jī)計(jì)數(shù)儀目前較少，通常采用輔助儀器測(cè)量得到相應(yīng)的理化特性值，然后通過(guò)相關(guān)性預(yù)測(cè)模型計(jì)算得到體細(xì)胞數(shù)，例如DNA法采用分光光度計(jì)測(cè)量DNA含量、ATP法利用微量光度計(jì)檢測(cè)ATP光強(qiáng)、EC法利用電導(dǎo)率儀檢測(cè)奶樣的電導(dǎo)率、pH法利用溴百里酚藍(lán)試劑檢測(cè)pH值、黏度法采用黏度計(jì)檢測(cè)奶樣的黏度值、IRT法利用紅外熱成像儀檢測(cè)奶牛乳房表面溫度，等等。

我國(guó)對(duì)于顯微細(xì)胞檢測(cè)儀器的研制工作始于 20世紀(jì)60年代，主要集中在在血細(xì)胞方面[66]，如1965年上海生產(chǎn)的第一代血球計(jì)數(shù)儀，上海XF503型、北京生化儀器廠的仿COULTERZF型、南京XF-1型、濟(jì)南DXJ-1型等其他血球計(jì)數(shù)儀，這些都屬于僅能計(jì)數(shù)紅細(xì)胞和白細(xì)胞的儀器。牛奶體細(xì)胞數(shù)檢測(cè)儀器的研制始于近幾年，如牛博士快速檢測(cè)儀[67]，該儀器采用理化檢測(cè)方法。

6小結(jié)

綜上所述，牛奶體細(xì)胞數(shù)是體現(xiàn)奶源健康的重要指標(biāo)，國(guó)內(nèi)外研究者圍繞著其意義、檢測(cè)方法、檢測(cè)儀器等展開(kāi)了大量的研究。一方面，間接檢測(cè)法與SCC之間的相關(guān)性較差，通常用于體細(xì)胞數(shù)的估算，而精確檢測(cè)SCC有助于區(qū)分那些處于臨界狀態(tài)的奶牛健康情況，尤其有助于識(shí)別處于亞健康或隱性乳腺炎的奶牛，這對(duì)持續(xù)改善奶場(chǎng)管理具有重要意義；另一方面，基于電脈沖或光脈沖的牛奶體細(xì)胞計(jì)數(shù)儀雖然可實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞數(shù)的精確計(jì)數(shù)，但這些儀器昂貴、操作成本高、結(jié)果無(wú)法復(fù)現(xiàn)；隨著數(shù)字圖像處理技術(shù)的發(fā)展，基于計(jì)算機(jī)視覺(jué)的牛奶體細(xì)胞檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越明顯，如操作簡(jiǎn)單、結(jié)果可重現(xiàn)、單次檢測(cè)成本低、檢測(cè)速度等，逐漸成為近十年來(lái)該領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，國(guó)外雖有相應(yīng)的儀器但價(jià)格昂貴，我國(guó)奶場(chǎng)主要依賴(lài)進(jìn)口的電脈沖或光脈牛奶體細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，因此，在這一新興領(lǐng)域，我國(guó)急需加強(qiáng)研究以獲得自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，而其關(guān)鍵是牛奶體細(xì)胞圖像分割與識(shí)別的準(zhǔn)確性、識(shí)別速度以及相應(yīng)自動(dòng)化檢測(cè)儀器的研制。

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Review on Detection of Milk Somatic Cell Count

Yan Jianjun1， Gao Yan2，Gao Fei2

(1.Ningbo Research Institute of Measurement and Test, Ningbo315048, China;2.College of Computer Science and Technology, Zhejiang University of Technology, Hangzhou310023, China)

Abstract:Rapid detecting milk somatic cell count is important and meaningful for guaranteeing quality of milk and monitoring health of dairy cow. First, the detection of milk somatic cell count was reviewed from five aspects including concept of milk somatic cell count, influence of somatic cell count upon milk, research progress of milk somatic cell count, method of detecting milk somatic cell count and relevant detecting instrument. Second, advantages and disadvantages of current detecting methods were discussed and compared. Finally, detecting milk somatic cell count based on computer vision was pointed out as a research trend of which the key is to segment and identify the cells rapidly and concisely and develop the relevant detecting instrument.

Keywords：somatic cell count; computer vision; image processing; detecting instrument

文章編號(hào)：1671-4598(2016)02-0005-06

DOI：10.16526/j.cnki.11-4762/tp.2016.02.002

中圖分類(lèi)號(hào)：TP311

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

作者簡(jiǎn)介：嚴(yán)建軍(1966-)，男，浙江余姚人，本科，高工，主要從事電子測(cè)量技術(shù)方向的研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(12412135);浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LY13F020029, LQ14F020004);寧波市重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013C11032)。

收稿日期：2015-08-22；修回日期：2015-09-20。

高飛(1974-)，男，四川鄰水人，博士，教授，主要從事計(jì)算機(jī)視覺(jué)與圖像處理方向的研究。