菠菜霜霉病菌快速分子檢測方法研究

李 京,張祥林,王 翀,李亞偉,張小菊

(1.新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局，烏魯木齊830063；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊830052)

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菠菜霜霉病菌快速分子檢測方法研究

李 京1,2,張祥林1,王 翀1,李亞偉1,張小菊1

(1.新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局，烏魯木齊830063；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊830052)

摘要：【目的】菠菜霜霉病，由專性寄生病原菌Peronospora farinosa f. sp. Spinaciae引起，是世界上菠菜Spinacia oleracea種植中最為重要的經(jīng)濟(jì)型病害。建立菠菜霜霉病菌快速分子檢測方法?！痉椒ā繉⒉げ怂共【M(jìn)行顯微鏡的形態(tài)鑒定；提取DNA、PCR擴(kuò)增、克隆、酶切、測序、序列比對與分析；采用巢式PCR技術(shù)檢測菠菜霜霉病:第一輪采用通用引物ITS1/ITS4，第二輪采用特異性引物SMPF/SMPR?！窘Y(jié)果】該菌與霜霉屬的形態(tài)特征描述一致，確定菠菜患有霜霉病；測序結(jié)果經(jīng)Blast比對分析與Peronospora effusa同源性達(dá)100%；巢式PCR技術(shù)也特異性的檢測到了菠菜霜霉病菌?！窘Y(jié)論】建立針對菠菜霜霉病的快速分子檢測技術(shù)。

關(guān)鍵詞:菠菜霜霉病、酶切、巢式PCR

0引 言

【研究意義】菠菜霜霉病是由專性寄生菌Peronosporafarinosaf. sp.Spinaciae引起，該病在全世界的菠菜種植中都是一種毀滅性的病害[1,2]。菠菜霜霉病是一種多發(fā)性真菌病害，尤其在氣候冷且多雨的情況下發(fā)病率高，傳播速度快[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】對于菠菜霜霉病分子方面的研究國外報(bào)道較多，Young-Joon CHOI等[4]對引起菠菜霜霉病的病原Peronosporaeffusa以及霜霉屬的其他種結(jié)合病原的形態(tài)特征做了同源性分析。Klosterman, S. J.等[5]采用了ASP-PCR的方法成功將引起菠菜霜霉病的病原Peronosporaeffusa與引起甜菜霜霉病的病原Peronosporaschachtii檢測出來?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】國內(nèi)對于菠菜霜霉病的分子檢測技術(shù)目前還沒有相關(guān)報(bào)道，大部分報(bào)道是針對菠菜霜霉病的形態(tài)特征及防止措施?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用通用性引物ITS1/ITS4擴(kuò)增ITS區(qū)，進(jìn)而設(shè)計(jì)出針對菠菜霜霉病菌的特異性引物SMPF/SMPR。通過巢式PCR的方法來檢測引物的特異性。

1材料與方法

1.1　材 料

1.1.1 主要試劑

實(shí)驗(yàn)所用PCR試劑、所用引物與探針均購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，植物基因組DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購于天根生物科技(北京)有限公司，PMD18-T載體購于大連寶生物工程公司，實(shí)驗(yàn)所有的測序均在北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.1.2供試菌株(表1)

表1供試材料、寄主和來源
Table 1Materials,hosts and their sources

序號(hào)NO分類地位寄主來源SequencenoClassificationstatusHostSource1A.tenuissima(Fr.)Wiltshire棗新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局2A.triticinaPrasada小麥新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局3PhomamacdonaldiiBoerma向日葵新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局4Peronospora.variabilis藜新疆伊犁尼勒克縣5Bremialactucae萵筍新疆烏魯木齊市大棚蔬菜基地6Peronosporaeffusa菠菜新疆烏魯木齊市三坪農(nóng)場

1.1.3形態(tài)鑒定

用滅過菌的手術(shù)刀輕輕刮取菠菜霜霉病葉片背面的灰色霉層或者用滅菌的解剖針挑取霉層， 觀察孢囊梗及孢子囊的形態(tài)特征。

1.2　菠菜霜霉病的分子鑒定

1.2.1DNA提取

用試劑盒(Plant Genomic DNA Kit)提取菠菜霜霉病葉、正常菠菜葉片以及供試材料的核酸，并使用分光光度計(jì)ND-1000測定核酸的濃度。

1.2.2rDNA-ITS區(qū)通用引物擴(kuò)增

采用真菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔ITS區(qū)通用引物ITS1/ITS4[6,7]，對提取的核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如下：

ITS1: 5’- CTTGCGTTGATTACGTCCC- 3’。

ITS4 :5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3’。

PCR反應(yīng)體系總體積20 μL,其中2×TaqPCR Green Mix 12.5 μL，10 μM上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 9.5 μL，模板2 μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性 1 min，55℃ 退火40 s，72℃延伸 90 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min[8]。

將PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠，1×TAE電泳緩沖液，90V電壓條件下電泳35 min，置凝膠成像系統(tǒng)中觀察分析。

1.2.3克隆及測序

為了能膠回收成功，在電泳時(shí)將膠的濃度增大，電壓調(diào)低，電泳時(shí)間延長，能將片段大小差距不大的條帶分開，然后在紫外透射儀下將目的片段切下，按照膠回收試劑盒的步驟將所需片段回收，克隆到PMD18-T載體并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑菌、搖菌，最后按照質(zhì)粒小提試劑盒的步驟從搖的菌液中提取質(zhì)粒，并將質(zhì)粒進(jìn)行酶切及PCR電泳檢測。

1.2.4質(zhì)粒酶切鑒定

酶切體系：3 dH2O 11 μL，10×Buffer 2 μL，重組質(zhì)粒6 μL，EcoRⅠ 0.5 μL，HindШ 0.5 μL。37℃水浴過夜，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5測 序

將陽性重組質(zhì)粒送北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序。

1.2.6特異性引物的設(shè)計(jì)與合成

將測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對分析，利用生物學(xué)軟件DNAMAN與Primer設(shè)計(jì)針對菠菜霜霉病的特異性引物，然后再次進(jìn)行Genbank blast數(shù)據(jù)庫的特異性比對設(shè)計(jì)出引物SMPF和SMPR。合成的引物配成100m母液，使用時(shí)稀釋10倍，引物保存于-20℃冰箱里。

1.3　菠菜霜霉病巢式PCR檢測

1.3.1特異性引物PCR退火溫度的優(yōu)化

用特異性引物SMPF/SMPR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將退火溫度設(shè)置6個(gè)梯度：55、56、57、58、59和60℃。

1.3.2巢式PCR檢測

供試材料菠菜霜霉病葉、萵苣霜霉病葉、藜霜霉病葉、棗黑斑病菌、小麥葉疫病菌、向日葵黑莖病菌、菠菜正常葉片，按照上述核酸提取的方法來提取核酸，用引物ITS1/ITS4進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增,引物SMPF/SMPR進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。

PCR反應(yīng)體系總體積20 μL： 2×TaqPCR Green Mix 12.5 μL，10 μM上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 9.5 μL，模板2 μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 1 min，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。

2結(jié)果與分析

2.1　形態(tài)鑒定結(jié)果

經(jīng)顯微鏡觀察并拍照可以看出：孢囊梗為二叉狀銳角分支3～8次，末端尖銳，孢子囊為卵圓形或橢圓形，大小(13.8～32.7 )μm×(10.4～22.3 )μm。圖1

A:孢囊梗；B:卵孢子；C、D:孢子囊

A:sporangiophore;B: Oospore;C、D: sporangia

圖1菠菜霜霉病菌鏡檢形態(tài)
Fig.1 The morphology of Spinach Downy Mildew Pathogen through microscopy

2.2　菠菜霜霉病分子鑒定

2.2.1通用引物ITS1/ITS4 PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用通用引物ITS1和ITS4分別對菠菜病葉、菠菜正常葉片DNA進(jìn)行PCR。電泳結(jié)果顯示：菠菜正常葉片出現(xiàn)一條500 bp左右的條帶，菠菜霜霉病葉出現(xiàn)一條800 bp左右的條帶和一條500 bp左右的條帶，由此可知800 bp左右的條帶為菠菜霜霉病菌的DNA條帶[9]。圖2

M:DL2000 Marker；1-2:菠菜正常葉片DNA；3-5:菠菜霜霉病葉；6:空白

M:DL2000 Marker; 1-2:the DNA of health spinach leaf; 3-5: the DNA of spinach downy mildew leaf;6: blank

圖2ITS1/ITS4引物擴(kuò)增結(jié)果
Fig.2The PCR amplified result by primer ITS1/ITS4

2.2.2 重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

經(jīng)藍(lán)白斑篩選、PCR擴(kuò)增及EcoRⅠ、HindШ雙酶切鑒定，篩選出含有正確插入片段的重組質(zhì)粒。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出：菠菜霜霉病菌DNA重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增，可以得到800 bp左右的片段。大小與插入片段相同，重組的質(zhì)粒EcoRⅠ、HindШ雙酶切，在Marker 2 000上方出現(xiàn)與PMD18-T質(zhì)粒大小(2 692 bp)大致相同。下方得到800 bp左右的片段，片段大小與插入片段大小大致相同。圖3，圖4

M:DL2000 Marker；1:菠菜霜霉病菌；2:空白

M:DL2000 Marker; 1:the DNA of spinach downy mildew pathogen; 2: blank

圖3菠菜霜霉病菌重組質(zhì)粒PCR結(jié)果
Fig.3The result that ITS1/ITS4 clones Spinach downy mildew pathogen

M:DL2000 Marker；1:菠菜霜霉病菌；2:空白

M:DL2000 Marker; 1:the DNA of spinach downy mildew pathogen; 2: blank

圖4菠菜霜霉病菌重組質(zhì)粒酶切結(jié)果
Fig.4The result that ITS1/ITS4 clones Spinach downy mildew pathogen

2.2.3測序結(jié)果

菠菜霜霉病的重組質(zhì)粒測序結(jié)果顯示：所克隆的目的片段的為847 bp(圖6)，與預(yù)期的片段大小基本一致。在NCBI上進(jìn)行BLAST比對此序列與已公布的Peronosporaeffusa(AF528560.1)同源性達(dá)100%，同Genbank上公布的霜霉屬其他菌的同源性高達(dá)95%以上。

2.3 　特異性引物設(shè)計(jì)

將測序結(jié)果在Genbank上進(jìn)行Blast比對，下載已經(jīng)發(fā)布的菠菜霜霉病菌以及其他寄主的霜霉病菌ITS區(qū)序列通過DNAMAN進(jìn)行多序列比對，設(shè)計(jì)出了特異性引物SMPF和SMPR。產(chǎn)物片段大小為414 bp。

SMPF:5’- GGGTTATCCCTGGAAGTATGC- 3’；

SMPR:5'- ATGCCACACAACCGAAGTC-3’。

M:DL2000 Marker;1:菠菜霜霉病葉;2:萵苣霜霉病葉;3:向日葵黑莖病菌;4:菠菜正常葉片;5:小麥葉疫病菌;6:藜霜霉病葉;7:棗黑斑病菌;8:空白

M:DL2000 Marker;1: the DNA of health Spinach leaf;2: the DNA of lettuce downy mildew leaf;3: the DNA of sunflower black stem pathogen;4: the DNA of health spinach leaf;5: the DNA of wheat leaf blight pathogen;6: the DNA of quinoa downy mildew leaf;7: the DNA of jujube black spot pathogen;8:blank

圖5ITS1/ITS4 巢式PCR第一輪擴(kuò)增結(jié)果
Fig.5The first amplification result of Nest-PCR of the primer ITS1/ITS4

2.4 　巢式PCR檢測

采用通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，第二輪用特異性引物SMPF/SMPR進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示：菠菜霜霉病葉在第一輪擴(kuò)增中出現(xiàn)了800 bp和500 bp左右的兩條條帶，第二輪擴(kuò)增僅出現(xiàn)了一條400 bp左右的條帶；菠菜正常葉片第一輪擴(kuò)增出現(xiàn)500 bp左右的條帶，第二輪擴(kuò)增無條帶出現(xiàn)；萵苣霜霉病葉和向日葵黑莖病菌在第一輪擴(kuò)增中均出現(xiàn)了一條約800 bp的條帶，第二輪都無條帶出現(xiàn)；棗黑斑病菌在第一輪擴(kuò)增中出一條約500 bp的條帶，在第二輪擴(kuò)增中無條帶出現(xiàn)；小麥葉疫病菌在第一輪擴(kuò)增中出現(xiàn)了一條約700 bp的條帶，在第二輪擴(kuò)增中無條帶出現(xiàn)；藜霜霉病葉第一輪擴(kuò)增出現(xiàn)約800 bp和700 bp兩條條帶。圖5、圖6

M:DL2000 Marker；1:菠菜霜霉病葉；2:萵苣霜霉病葉；3:向日葵黑莖病菌;4:菠菜正常葉片；5:小麥葉疫病菌；6:藜霜霉病葉；7:棗黑斑病菌；8:空白

M:DL2000 Marker;1: the DNA of health Spinach leaf;2: the DNA of lettuce downy mildew leaf;3: the DNA of sunflower black stem pathogen;4: the DNA of health spinach leaf;5: the DNA of wheat leaf blight pathogen;6: the DNA of quinoa downy mildew leaf;7: the DNA of jujube black spot pathogen;8:blank

圖6SMPF/SMPR巢式PCR第二輪擴(kuò)增結(jié)果
Fig.6The second amplification result of Nest-PCR of the primer SMPF/SMPR

3討 論

雖然易建平等[10]提出了挑取孢子在解剖鏡下壓碎后提取核酸的方法[10]，但是為了能夠快速有效的提取菠菜霜霉菌的核酸實(shí)驗(yàn)采用了提取患病葉片的核酸，在克隆過程中通過膠回收來獲得菠菜霜霉菌的DNA[11,12]。

目前國內(nèi)對于菠菜霜霉病的分子形態(tài)學(xué)研究還處于初級(jí)階段，針對菠菜霜霉病的分子檢測方法還沒有建立，實(shí)驗(yàn)采用巢式PCR方法建立了常規(guī)分子檢測方法，實(shí)現(xiàn)了菠菜霜霉病的快速分子檢測。實(shí)驗(yàn)只涉及到常規(guī)PCR檢測技術(shù)，但在實(shí)時(shí)熒光PCR檢測技術(shù)方面還有很大發(fā)展的空間。

4結(jié) 論

通過鏡檢確定了該病菌為霜霉病菌，通過分子鑒定(實(shí)驗(yàn)采用巢式PCR的方法)出菠菜霜霉病菌與Peronosporaeffuse的同源性最高，更進(jìn)一步確定了該霜霉病的種類。擴(kuò)增ITS區(qū)實(shí)現(xiàn)了菠菜霜霉病的快速檢測。

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Fund project:Supported by The Scientific Research Project of General Administration of Quality Supervision (201310091)

Rapid Detection Spinach Downy Mildew Pathogen by Molecular Method

LI Jing1,2, ZHANG Xiang-lin1, WANG Chong1, LI Ya-wei1, ZHANG Xiao-ju1

(1.XinjiangEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Urumqi830063,China; 2.CollegeofAgronomy,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China)

Abstract：【Objective】 Spinach downy mildew disease, caused by the obligate pathogen Peronospora farinosa f. sp. spinaciae, is the most economically important spinach (Spinacia oleracea) disease.【Objective】The purpose of this study is to establish the molecular method of rapid detection of spinach downy mildew pathogen.【Method】 First of all, the morphology of spinach downy mildew pathogen should be identified by microscope; then the second process was DNA extraction, PCR amplification, cloning, enzyme digestion, sequencing, the sequence alignment and analysis; and finally, the spinach downy mildew was detected by using nested PCR technique. The first amplification was to use the universal primer ITS1/ITS4 and the second amplification was to use the specific primer SMPF/SMPR.【Result】Microscopy results showed that the fungus were consistent with the description of Peronospora morphology, so we made sure that spinach were infected with downy mildew disease; The homology of sequencing results of the blast analysis with Peronospora effuse was 100%; nested PCR technology also specially detected spinach downy mildew pathogen.【Conclusion】This study established the rapid detection spinach downy mildew pathogen by molecular method but the technique of Real-time quantitative PCR needs more exploration.

Key words:spinach downy mildew; enzyme digestion; nested-PCR

通訊作者:張祥林(1964-)，男，新疆人，研究員，研究方向?yàn)榉肿又参锊±韺W(xué),(E-mail)XL6479@163.com

作者簡介:李京(1990-)，女，山東人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参餀z疫病害,(E-mail)13579981032@163.com

基金項(xiàng)目:國家質(zhì)檢總局科研項(xiàng)目(201310091)

收稿日期：2015-09-20

中圖分類號(hào)：S41

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-4330(2016)02-0346-06

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2016.02.022