緩釋核殼結(jié)構(gòu)利用基因傳遞用于骨缺損的研究

包丹丹，林福星，汪謨貞，葛學(xué)武，趙 宇

緩釋核殼結(jié)構(gòu)利用基因傳遞用于骨缺損的研究

包丹丹1，林福星2，汪謨貞2，葛學(xué)武2，趙 宇1

目的利用巰基烷基化殼聚糖（TACS）與質(zhì)粒形成納米粒子，在其外圍包裹羥丁基殼聚糖（HBC）用以增加納米粒子穩(wěn)定性，并賦予其緩釋的功能。方法利用骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP4）-綠色熒光蛋白（EGFP）融合基因的負(fù)電性與TACS的正電性相互作用形成核結(jié)構(gòu)（TACS-pBMP4-EGFP），再與HBC相互作用形成核殼結(jié)構(gòu)（TACS/HBC-pBMP4-EGFP）。利用動態(tài)光散射，透射電鏡，凝膠電泳，體外轉(zhuǎn)染，Western blot及動物成骨實驗驗證TACS、HBC對pBMP4-EGFP的包裹及緩釋。結(jié)果隨著氮磷比增加，TACS-pBMP4-EGFP直徑逐漸減小。當(dāng)?shù)妆却笥?時，TACS-pBMP4-EGFP直徑小于200 nm，包裹HBC后，TACS/HBC-pBMP4-EGFP粒徑小幅度增加且電勢趨于中性，易于被細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)出BMP4。流式細(xì)胞儀和Western blot結(jié)果均顯示隨著轉(zhuǎn)染時間增加，核殼結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染率逐漸增高。兔橈骨缺損修復(fù)過程中，X線片可見攜載核殼結(jié)構(gòu)的缺損處骨密度明顯增高，皮質(zhì)骨連續(xù)性較好，呈骨性愈合。結(jié)論TACS/HBC-pBMP4-EGFP具有良好的緩釋功能和成骨能力。

殼聚糖；骨形態(tài)發(fā)生蛋白；轉(zhuǎn)染；緩釋；骨缺損；修復(fù)

骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（bone morphogenetic protein4，BMP4）現(xiàn)已成為研究成骨誘導(dǎo)的熱點，外源性植入BMP4雖然可以誘導(dǎo)骨形成，但持續(xù)時間短。因此基因治療成為骨缺損研究有效可行的方法。近年來，基因治療在治療艾滋病，癌癥以及基因紊亂等疾病引起了人們廣泛的興趣［1］。成功的基因治療依賴于載體能否將基因成功的運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)部［2］。雖然病毒載體轉(zhuǎn)染效率較高，但在病毒再生，免疫性以及致癌性方面存在潛在風(fēng)險［3］。殼聚糖的衍生物作為新型的轉(zhuǎn)染試劑，有較高的轉(zhuǎn)染效率，較好的生物相容性以及生物可降解性。利用BMP4-綠色熒光蛋白（enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP）融合基因的負(fù)電性與巰基烷基化殼聚糖（thiolated N-alkylated chitason，TACS）的正電性相互作用形成核結(jié)構(gòu)（TACS-pBMP4-EGFP），再與羥丁基殼聚糖（hydroxylbutyl chitason，HBC）相互作用形成核殼結(jié)構(gòu)（TACS/HBC-pBMP4-EGFP），核殼結(jié)構(gòu)可以很好的將質(zhì)粒傳遞到細(xì)胞內(nèi)部并有較好的表達(dá)效果，因其包裹有殼結(jié)構(gòu)的HBC，穩(wěn)定性較好，可以防止質(zhì)粒提前釋放，給予核殼結(jié)構(gòu)緩釋的功能及基因治療骨缺損的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料人腎上皮細(xì)胞（293T細(xì)胞）由安徽醫(yī)科大學(xué)免疫實驗室提供。pBMP4-EGFP質(zhì)粒由上海吉凱基因公司完成。質(zhì)粒抽取試劑盒購于北京天根生化科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、澳洲胎牛血清（FBS）購于美國Invitrogen公司；BMP4抗體購于英國Abcom公司；FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑購于美國Promega公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。儀器由安徽醫(yī)科大學(xué)免疫實驗室提供。實驗動物由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1TACS和HBC的制備 殼聚糖經(jīng)堿化、溴代十二烷取代后，丙酮、乙醚和去離子水分別洗滌后干燥，得到TACS［4］。然后與巰基乙酸混合，縮合、避光反應(yīng)3 d，透析、冷凍干燥即可制備HBC。

1.2.2核殼結(jié)構(gòu)的制備 根據(jù)TACS以及質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，TACS平均163分子量含有一個胺基（即氮），質(zhì)粒平均325分子量含有一個磷，于是在質(zhì)粒含量一定的情況下調(diào)控加入的TACS的質(zhì)量不同就可以調(diào)控最終的氮磷比。按照一定的氮磷比，將TACS與pBMP4-EGFP混合于PBS緩沖液中，室溫靜置30 min形成TACS-pBMP4-EGFP［5］。再加入與TACS等量的HBC，室溫靜置30 min，HBC即被吸附至TACS-pBMP4-EGFP表面形成核殼結(jié)構(gòu)［6］。

1.2.3凝膠電泳 制備出氮磷比為0.5、1、2、4、8、16的核及核殼結(jié)構(gòu)備用，以每孔均含0.4μg質(zhì)粒的核及核殼結(jié)構(gòu)加入0.8%瓊脂糖凝膠中，120 V電壓下電泳50 min。再將瓊脂糖凝膠置于5μg/ml溴化乙錠溶液中，20 min后取出凝膠，紫外透射儀觀察并記錄結(jié)果。

1.2.4體外轉(zhuǎn)染 將293T細(xì)胞以3×104/孔接種于24孔板，待細(xì)胞融合80%，棄去培養(yǎng)液，每孔加入含2μg質(zhì)粒的氮磷比為16的核殼結(jié)構(gòu)與不含血清的培養(yǎng)液，TACS-pBMP4-EGFP作為對照組。4 h后，棄去培養(yǎng)液，加入含血清的培養(yǎng)液。觀察轉(zhuǎn)染1、3、5 d時熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀以及Western blot結(jié)果。

1.2.5Western blot 分別收集轉(zhuǎn)染1、3、5 d的細(xì)胞，PIRA裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min 4℃離心15 min，吸取上清液。以BCA方法進(jìn)行蛋白定量，每孔上樣量30μg。BPM4抗體1∶1 000稀釋，二抗羊抗鼠IgG（H+L）1∶5 000稀釋。ECL法曝光，保存圖像。圖像用Image J軟件計算各條帶密度灰度值，以目的蛋白的與β-actin的比值作為蛋白表達(dá)相對含量。

1.2.6細(xì)胞毒性試驗 將96孔板分4組，每組5個復(fù)孔，重復(fù)實驗3次。種板24 h后，棄培養(yǎng)基，實驗組1中加入含1.2μg質(zhì)粒的TACS-pBMP4-EGFP的納米粒子，實驗組2中加入含1.2μg質(zhì)粒的TACS/HBC-pBMP4-EGFP納米粒子，對照組中加入含等質(zhì)量質(zhì)粒的promega/pBMP4-EGFP作為陽性對照組，全細(xì)胞培養(yǎng)液作為陰性對照組以及另設(shè)一調(diào)零孔。溫箱孵育24 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加100μl培養(yǎng)基和10μl MTT溶液（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。每孔加入100μl Formanzan溶劑，37℃放置4 h。于570 nm波長處測吸光度（optical density，OD）值，并計算細(xì)胞相對增殖率（relative growth ratio，RGR），RGR（%）=（OD實驗組值-OD空白組值）/（OD對照組值-OD空白組值）×100%。

1.2.7動物模型的制備及成骨檢測 將3月齡新西蘭雄性白兔12只麻醉滿意后，消毒鋪巾，于雙側(cè)前肢充分暴露橈骨中段，用咬骨鉗形成18 mm長的橈骨完全性骨缺損。實驗組骨缺損處植入含TACS/ HBC-pBMP4-EGFP的脫細(xì)胞骨材料，對照組只植入脫細(xì)胞骨材料。分別于術(shù)后0、4、8周拍攝雙前肢X線，觀察缺損部位成骨情況。小。氮磷比為4時，TACS-pBMP4-EGFP電勢變?yōu)檎?，且粒徑小?00 nm。氮磷比為16時，TACS-pBMP4-EGFP粒徑為124 nm，此時適合細(xì)胞內(nèi)吞。加入HBC形成核殼結(jié)構(gòu)后，粒徑稍增大，電勢更趨近中性，意味著核殼結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增加。見圖2。

2 結(jié)果

2.1 核及核殼結(jié)構(gòu)的形態(tài)結(jié)構(gòu)表征利用透射電鏡觀察核及核殼結(jié)構(gòu)形態(tài)。氮磷比為16時，TACS-pBMP4-EGFP粒徑約100 nm，且分布較均一，見圖1A。TACS/HBC-pBMP4-EGFP表面可見一層厚度約為20 nm的殼結(jié)構(gòu)，見圖1B。

2.2 動態(tài)光散射氮磷比為0.5時，TACS-pBMP4-EGFP粒徑約為2 000 nm，電勢為-17.2 mV，此時TACS-pBMP4-EGFP不能完全壓縮質(zhì)粒。增加TACS，氮磷比逐漸增大，TACS-pBMP4-EGFP粒徑減

2.3 凝膠電泳實驗當(dāng)?shù)妆却笥诘扔?時，TACS-pBMP4-EGFP和TACS/HBC-pBMP4-EGFP可以較好得壓縮質(zhì)粒。見圖3。

2.4 體外轉(zhuǎn)染TACS-pBMP4-EGFP在1、3、5 d的綠色熒光點沒有明顯差別，TACS/HBC-pBMP4-EGFP的綠色熒光點逐漸增加，見圖4。流式細(xì)胞儀顯示，TACS/HBC-pBMP4-EGFP在1 d、3 d、5 d的流式結(jié)果分別為3.16%，11.25%和20.6%，見圖5。這表明了核殼結(jié)構(gòu)的緩釋作用。

2.5 Westernblot隨著轉(zhuǎn)染時間的增加核殼結(jié)構(gòu)表達(dá)的BMP4量在遞增，見圖6。

2.6 細(xì)胞毒性試驗3組細(xì)胞RGR分別為（87.97 ±0.31）%、（91.69±0.32）%、（79.94±0.28）%，見圖7。1和2組細(xì)胞存活率高于陽性對照組（P＜0.05）。說明與promege相比，TACS和HBC的毒性更低。

2.7 X線片檢查術(shù)后4周時實驗組骨缺損處密度增加，可見片狀陰影；對照組無明顯改變。術(shù)后8周時實驗組骨缺損可見骨痂形成，呈骨性愈合，皮質(zhì)骨連續(xù)性較好；對照組無明顯改變，見圖8。證明了TACS/HBC-pBMP4-EGFP是一個治愈骨缺損可行的方法。

3 討論

此外最重要的部分就是質(zhì)粒的釋放，現(xiàn)在最常用的刺激響應(yīng)釋放質(zhì)粒可以達(dá)到很好的轉(zhuǎn)染效果。但是他們往往沒有緩釋的能力，這在治療類似于骨缺損之類的疾病上有著一定的劣勢。

首先，納米粒子的粒徑的大小對于轉(zhuǎn)染的效果有著至關(guān)重要的影響，即聚合物是否可以將質(zhì)粒壓縮到一個合適的大小。如果所形成的納米粒子的粒徑過于大的話，那么它不容易被細(xì)胞所內(nèi)吞到內(nèi)部。通常情況下納米粒子的直徑在小于200 nm的時候可以很好的被細(xì)胞所內(nèi)吞。其次，納米粒子在被細(xì)胞內(nèi)吞之后通常會進(jìn)入到內(nèi)涵體之中，為了達(dá)到轉(zhuǎn)染的目的需要從內(nèi)涵體逃逸出來，核殼結(jié)構(gòu)因為具有較多的胺基，所以有質(zhì)子海綿泵的效果可以使得納米粒子成功的從內(nèi)涵體逃逸處來。因此核殼結(jié)構(gòu)具有較高的轉(zhuǎn)染效率。

骨缺損治療是一個緩慢的過程，一次性將質(zhì)粒全部釋放并不能保證持續(xù)的治療效果。本研究采用的核殼結(jié)構(gòu)有良好的緩釋功能，為治療骨缺損以及類似的病癥提供了一個良好的平臺。兔繞骨缺損修復(fù)模型中，攜載有TACS/HBC-pBMP4-EGFP的實驗組骨缺損4周、8周時骨密度明顯增高，出現(xiàn)骨性愈合。對照組未見明顯差異。因此，推測利用巰基烷基化殼聚糖和羥丁基殼聚糖作為BMP4質(zhì)粒的載體用于治療骨缺損是一個可行的方法。

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［3］ Behr J P.Synthetic gene transfer vectors II：Back to the Future［J］.AccountsChem Res，2012，45（7）：980-4.

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［5］ 趙慧清，盧華定，王 昆，等.透明質(zhì)酸修飾殼聚糖/pDNA納米微球的制備及體外轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞［J］.中華實驗外科雜志，2011，28（7）：1029-32.

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Gene delivery based on sustained releasing core-shell structure for therapy against bone defect

Bao Dandan1，Lin Fuxing2，Wang Mozhen2，et al
（1Dept of Plastic，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Division of Chemistry and Materials，University of Science and Technology of China，Hefei 230031）

ObjectiveTo explore the effects of core-shell structure in releaseing plasmid and repairing of bone defect.MethodsThiolated N-alkylated chitason and hydroxylbutyl chitason were taken to interact with eGFP-BMP plasmid to form TACS/HBC-pBMP4-EGFP.Then dynamic light scattering，Transmission Electron Microscope，agarose gel electrophoresis，vitro transfection，western blot and vivo experiment to test whether they could delivery plasmid into cell and their ability of sustained release.ResultsWith addition of thiolated N-alkylated chitason，the diameter of formed nanoparticle became smaller.When the N/P ratio was 8，the diameter of nanoaprticle was less than 200 nm.After forming a shell out of nanoparticle by addition of hydroxylbutyl chitason，the diameter became a litter larger and the zeta potential came tomore neutral.We took advantage of some plasmid which contains both the base pair sequence of eGFP and BMP plasmid.The expression of eGFPwas tested by flow cytometry and the expression of BMP was examined by Western blot.X-ray showed thatmore woven bone-like tissue were visible and trabecular-like structure was formed in the erperiment group.ConclusionTACS/HBC-pBMP4-EGFP owns the ability of sustained release and may be used to repaire bone defect.

chitason；bonemorphogenetic protein4；transfection；sustained release；bone defect；repaire

A

1000-1492（2016）03-0358-05

時間：2016/1/28 14：23：10 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.022.html

2015-12-08接收

國家自然科學(xué)基金資助項目（編號：81171829）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科，合肥 230022

2中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)材料與化學(xué)研究部，合肥 230031

包丹丹，女，碩士研究生；

趙 宇，男，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zhaoyuzj@aliyun.com

R 33；R 318-33