定量檢測HCMV pp67 m RNA快速診斷人巨細(xì)胞病毒活動性感染

鐘 峰，趙 俊，張業(yè)婷，姚 瑤，王明麗

定量檢測HCMV pp67 m RNA快速診斷人巨細(xì)胞病毒活動性感染

鐘 峰，趙 俊，張業(yè)婷，姚 瑤，王明麗

目的建立實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（Real time RT-qPCR）方法，檢測外周血中人巨細(xì)胞病毒（HCMV）pp67 mRNA的拷貝數(shù)，用于臨床快速診斷HCMV活動性感染。方法采用RT-qPCR測定86份癌癥患者外周血標(biāo)本中的HCMV pp67 mRNA拷貝數(shù)，并與HCMV pp65抗原血癥檢測及HCMV分離培養(yǎng)的實驗結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果86例癌癥患者中，HCMV病毒分離檢測陽性率3.49%（3例）；實時熒光定量RT-PCR檢測陽性率17.44%（15例），靈敏度為100%，特異性為85.54%；HCMV pp65抗原血癥檢測陽性率為10.47%（9例），靈敏度為66.7%，特異度為92.8%。兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。通過受試者工作特征（ROC）曲線分析，RT-qPCR檢測每2×105個外周血白細(xì)胞中HCMV拷貝數(shù)的截斷點值為201.5；此病毒拷貝數(shù)可作為診斷HCMV活動性感染的參考閾值。結(jié)論應(yīng)用RT-qPCR檢測HCMV活動性感染，靈敏度高、特異性好；并能夠為抗病毒治療供重要的參考依據(jù)。

人巨細(xì)胞病毒；pp67 mRNA；實時熒光定量RTPCR；活動性感染

人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）屬皰疹病毒β亞科，為雙鏈DNA病毒。在人群中感染普遍，我國人群感染率高達(dá)90%以上［1］。HCMV在原發(fā)性感染后會潛伏于人體組織內(nèi)并形成終身感染［2］。通常對免疫正常人無危害，但對免疫功能低下人群可造成致死性損傷［3-4］。研究［5］顯示，在腫瘤組織中檢測到HCMV核酸及抗原，表明HCMV感染可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)。HCMV pp67是由UL65基因編碼的一種病毒結(jié)構(gòu)性皮層蛋白，是HCMV復(fù)制晚期表達(dá)的基因產(chǎn)物。因此，pp67 mRNA的檢出能夠表明病毒呈活動性感染狀態(tài)［6］。臨床研究［7］表明，目前對HCMV早期活動性感染的診斷，遠(yuǎn)不能達(dá)到臨床需求，存在盲目用藥或藥物毒性反應(yīng)發(fā)生等不良反應(yīng)。為了更好地預(yù)防和控制HCMV活動性感染，該研究以HCMVpp67 mRNA為靶基因，定量檢測HCMV基因拷貝數(shù)，目的是建立一個更適用于臨床需求的科學(xué)檢測方法，為臨床快速診斷與抗病毒治療用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與病毒株人胚成纖維細(xì)胞株由安徽醫(yī)科大學(xué)微生物教研室自行制備，PCR鑒定排除皰疹病毒污染。HCMV AD169毒株由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物教研室提供，本實驗室保存。

1.2 病例資料收集2015年1月5日～2月13日安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年科癌癥患者外周血標(biāo)本86份，使用EDTA-K2抗凝管收集患者靜脈血3 ml，分別用于實時熒光定量PCR及pp65抗原血癥檢測和病毒分離。

1.3 實驗試劑與儀器DMEM培養(yǎng)基、小牛血清（美國Gibco公司）；mRNAiso Blood抽提試劑盒、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD18-TVector（日本Takara公司）；HCMV Brite Trubo Kit（荷蘭IQ公司）；DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒（杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司）；SYBR Green I Master、熒光定量PCR Lightcycler?480儀（瑞士Roche公司）。

1.4 PCR引物以GenBank中選擇病毒復(fù)制所必需的在各株間具有高度保守性的HCMV晚期基因（pp67基因）序列進(jìn)行引物設(shè)計，由上海Invitrogen公司合成。pp67上游引物為5′-AAAAGAGACCGCGTCTCTGG-3′，下游引物為5′-TAGAGCCTGAGATGATGATG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為202 bp。以HCMV Town株的UL144基因為模板合成PCR引物，UL144上游引物為：5′-TCGTATTACAAAAAGCGGAGAGGAT-3′，下游引物為5′-ACTCAGACACGGTTCCGTAA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為736 bp。

1.5 病毒分離將第5～7代的HF細(xì)胞制成1× 105個/ml細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞瓶，置5%CO237℃溫箱培養(yǎng)?？鼓獦?biāo)本處理：將抗凝管采集的患者靜脈血3 ml靜置1 h后，于4℃2 000 r/min離心10 min，取離心后得到的白細(xì)胞0.2 ml接種至已長成單層的HF細(xì)胞，37℃孵育1 h，更換維持液，置5%CO2孵育箱37℃培養(yǎng)。接種標(biāo)本的細(xì)胞每周傳代1次，每天通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞有無CPE。

1.6 HCMVpp65抗原血癥應(yīng)用荷蘭IQ公司生產(chǎn)的HCMV Brite Turbo Kit（L14041）檢測血標(biāo)本中白細(xì)胞HCMV pp65抗原。試劑盒檢測步驟：使用裂解液去除紅細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min收集白細(xì)胞；調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×105/ml，制備涂片；固定破膜；加入一抗，孵育60 min；加入二抗，孵育30 min；封片，熒光顯微鏡下讀片，判讀結(jié)果。

1.7 熒光定量RT-PCR方法建立

1.7.1標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建 采用mRNAiso Blood抽提試劑盒，從感染HCMV AD169株的細(xì)胞內(nèi)提取總RNA，RT-PCR擴(kuò)增并制備pp67基因的目的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過回收純化后與pMD18-T載體連接成重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，挑取陽性克隆，用AxyPrep小提質(zhì)粒試劑盒提質(zhì)粒，用PCR對重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。根據(jù)重組質(zhì)粒的光密度（optical density，OD）值換算出重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)，梯度稀釋后作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.7.2熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件 實時熒光定量PCR反應(yīng)條件（循環(huán)參數(shù)）：95℃5 min；95℃10 s，60℃20 s 72℃20 s（40循環(huán)）40℃10 s。20μl總體積最適反應(yīng)體系為：引物0.5μmol 1μl、SYBER Green IMaster 10μl、H2O 6μl、DNA模板2.0μl。

1.7.3靈敏度及穩(wěn)定性試驗 以制備的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行10倍系列梯度稀釋，取8個稀釋度的mRNA按反應(yīng)條件和體系進(jìn)行熒光定量RT-PCR，以不同模板濃度的擴(kuò)增曲線所在的Ct值確定此方法的靈敏度。并以批內(nèi)每個稀釋度的2個復(fù)孔進(jìn)行平行試驗。

1.7.4特異性試驗 分別對與HCMV同種屬的其它皰疹病毒如HSV1、HSV2和VZV進(jìn)行RNA抽提并作為模板，并設(shè)立正常細(xì)胞對照及空白對照，在相同的反應(yīng)體系和擴(kuò)增參數(shù)條件下進(jìn)行實時熒光定量RT-PCR。鑒定該方法的特異性。

1.7.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 將標(biāo)準(zhǔn)品從4.08×107拷貝數(shù)/μl依次10倍系列稀釋，共計7個濃度梯度。每個稀釋度進(jìn)行2次重復(fù)，以平均Ct值為橫坐標(biāo)，模板濃度的對數(shù)為縱坐標(biāo)自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 結(jié)果判定病毒分離結(jié)果著重在鏡下觀察接種標(biāo)本后的HF細(xì)胞單層上在4周內(nèi)有無出現(xiàn)HCMV特征性CPE；對CPE陽性者，取樣進(jìn)行PCR，檢測HCMV UL144基因。陽性的PCR產(chǎn)物經(jīng)測序比對后，方可確認(rèn)為病毒分離陽性；HCMV pp65抗原血癥檢測陽性結(jié)果的認(rèn)定為，在熒光顯微鏡下觀察到HCMV pp65陽性細(xì)胞的細(xì)胞核呈均勻的蘋果綠熒光，以2×105個多形核白細(xì)胞中pp65抗原陽性細(xì)胞≥1個為陽性；全血HCMV實時熒光定量PCR檢測結(jié)果以全血HCMV mRNA拷貝數(shù)≥最低檢測限為陽性。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料進(jìn)行χ2檢測。ROC曲線及最佳截斷點評估熒光定量RT-PCR診斷的價值，以曲線下面積表示。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離CPE觀察及分離株鑒定

2.1.1細(xì)胞CPE觀察 鏡下觀察在86份接種了臨床標(biāo)本的細(xì)胞單層上，發(fā)現(xiàn)病毒分離陽性的細(xì)胞明顯變圓、腫脹、折光性增強(qiáng)、形態(tài)及排列不規(guī)則、細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，呈典型的巨細(xì)胞病毒特征性CPE現(xiàn)象。見圖1。

2.1.2分離株鑒定 本次實驗成功分離出3例HCMV臨床病毒株。PCR檢測陽性產(chǎn)物由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司對分離的病毒株進(jìn)行UL144基因鑒定，測序結(jié)果經(jīng)過BLAST比對顯示，被測基因片段序列與GenBank報道Town株序列匹配達(dá)98%，確認(rèn)為HCMV臨床病毒分離株。見圖2。

2.2 HCMVpp65抗原血癥檢測86份樣本中，檢測HCMV pp65抗原血癥陽性患者9例（陽性率10.47%），熒光顯微鏡下觀察HCMV pp65陽性細(xì)胞核呈現(xiàn)出均勻綠色熒光（圖3B），陽性細(xì)胞數(shù)≥1/2 ×105外周血白細(xì)胞判為陽性，陽性標(biāo)準(zhǔn)品對照由試劑盒提供（圖3A）。紅色熒光為伊文斯蘭襯染細(xì)胞激發(fā)出的紅光。

2.3 HCMVpp67mRNA熒光定量RT-PCR方法的建立本次實驗成功建立了HCMV pp67 mRNA熒光定量RT-PCR方法，構(gòu)建了HCMV的陽性標(biāo)準(zhǔn)品，制作了標(biāo)準(zhǔn)曲線，擴(kuò)增效率達(dá)到1.786，反應(yīng)靈敏度達(dá)到4.08×10 copies/μl，對于已構(gòu)建的陽性樣本為特異性擴(kuò)增，而陰性對照物無特異性擴(kuò)增，組內(nèi)與組間重復(fù)性良好。

2.3.1靈敏度及穩(wěn)定性試驗 實時熒光定量RTPCR檢測HCMV pp67 mRNA擴(kuò)增曲線，呈典型的S形上升曲線，模板在每兩個相鄰的稀釋度之間的Ct值相差約3個單位，實驗檢測模板最低含量限度為40.8拷貝數(shù)/μl。每個稀釋度重復(fù)的平行對照Ct值基本一致，表明實驗體系的穩(wěn)定性良好，見圖4。

2.3.2特異性試驗 檢測所構(gòu)建方法的特異性，對HCMV、HSV1、HSV2、VZV、正常細(xì)胞對照的DNA模板進(jìn)行熒光定量RT-PCR，非靶目的DNA對照組無熒光曲線的增長，只有HCMV病毒對照組出現(xiàn)陽性擴(kuò)增曲線，此結(jié)果顯示該方法有良好的特異性見圖5。

2.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別用10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，以模板拷貝數(shù)的對數(shù)作為橫坐標(biāo)。以平均Ct值為縱坐標(biāo)，生成出一條直線型的標(biāo)準(zhǔn)曲線：方程為Y=-3.97log（X）+42.65，斜率為-3.970，擴(kuò)增效率為1.786，見圖6。

2.4 HCMVpp67mRNA熒光定量PCR與pp65抗原血癥檢測結(jié)果比較對86份患者全血進(jìn)行檢測，HCMV pp67 mRNA熒光定量PCR陽性為15例，陽性率17.44%。HCMV pp65抗原血癥檢測陽性9例，陽性率10.47%。這兩種方法所得結(jié)果符合率為90.70%。兩種檢測方法結(jié)果之間進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，應(yīng)用校正χ2檢驗公式，即HCMV pp67mRNA熒光定量PCR檢測陽性率與pp65抗原血癥檢測陽性率相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=30.308，P＜0.01）。

2.5 HCMVpp67mRNA熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果與病毒分離的比較病毒分離陽性樣本（3例）中RT-qPCR檢測全為陽性，RT-qPCR檢測陰性樣本（71例）中病毒分離未見陽性。RT-qPCR檢測方法靈敏度為100%，特異性為85.54%，陽性預(yù)測值（PPV）0.20，陰性預(yù)測值（NPV）1.00，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=9.372，P＜0.05）。

2.6 HCMV熒光定量RT-PCR最佳診斷閾值的確定以靈敏度為縱坐標(biāo)，誤診率（1-特異度）為橫坐標(biāo)，在SPSS17.0軟件上作ROC曲線并計算曲線下面積。HCMV熒光定量RT-PCR檢測方法的ROC曲線下面積為0.823，準(zhǔn)確性較好。以Youden指數(shù)接近1時對應(yīng)的數(shù)值為cutoff值，得到cutoff值為201.5拷貝數(shù)/2×105PBLs，提示此方法檢測的cutoff值可作為臨床診斷HCMV活動性感染的指標(biāo)。見圖7。

3 討論

HCMV基因復(fù)制具有時序性，分為立即早期（IE）、早期（E）和晚期（L）基因，活動性感染的重要標(biāo)志就是晚期基因的出現(xiàn)。目前pp65抗原血癥檢測被廣泛認(rèn)為是HCMV活動性感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”［8］。但是這種方法也存在一些缺點：實驗工作量多，耗時長，觀察結(jié)果需要專業(yè)熟練的技術(shù)人員，技術(shù)不能夠標(biāo)準(zhǔn)化，精確的臨床確診參考閾值仍然沒有確定。HCMV pp67 mRNA是病毒復(fù)制晚期表達(dá)的基因，文獻(xiàn)［9］報道pp67 mRNA檢測與IE基因比較，前者能夠更好地反映HCMV在體內(nèi)活動性感染。

本研究對86份癌癥患者外周血白細(xì)胞樣本進(jìn)行檢測。以熒光定量RT-PCR和HCMV pp65抗原血癥檢測結(jié)果相比較，二者符合率為90.70%。通過ROC曲線分析，熒光定量RT-PCR檢測的cutoff值為201.5拷貝數(shù)/2×105PBLs，對應(yīng)靈敏度為73.33%，特異度為72.26%。但是由于標(biāo)本數(shù)量過少及檢測方法有待進(jìn)一步優(yōu)化，實驗數(shù)據(jù)有待進(jìn)一步提高。

惡性腫瘤現(xiàn)已成為我國人口死亡的主要原因之一，現(xiàn)主要治療手段有手術(shù)、化療和放療，而在殺死癌細(xì)胞的同時也會殺死大量正常細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤患者免疫功能大大降低，并由此誘導(dǎo)HCMV再激活而導(dǎo)致活動性感染。與此同時，HCMV活動性感染對腫瘤細(xì)胞周期的影響、參與腫瘤細(xì)胞的凋亡及調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，對腫瘤的發(fā)展起到重要的作用，并能夠增加腫瘤的惡性程度［10-11］，目前研究［12-14］表明，HCMV感染與腫瘤細(xì)胞數(shù)量及惡性程度有關(guān)。將抑制HCMV復(fù)制及調(diào)節(jié)病毒基因編碼的mRNA表達(dá)作為腫瘤治療的一個新靶目標(biāo)，能夠拓展腫瘤治療的一個新領(lǐng)域，為臨床治療腫瘤提供新的思路，同時也能預(yù)防并減少因HCMV活動性感染造成器官損傷，包括肺炎、腸炎、視網(wǎng)膜炎等終末器官綜合征。

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The quantitative detection of human cytomegalovirus pp67 mRNA in rapid diagnosis of active human cytomegalovirus infection

Zhong Feng，Zhao Jun，Zhang Yeting，et al
（Dept of Microbiololgy，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo explore the detection of HCMV pp67mRNA in peripheral blood by RT-PCR for the diagnosis of HCMV active infection.MethodsThe peripheral blood samples of 86 postoperative cancer patients were measured by the real-time quantitative PCR（RT-PCR）.The resultswere compared with pp65 antigenemia test and HCMV virus isolation.ResultsIn the 86 cancer patients，15 patientswere positive in pp67mRNA RT-PCR，9 patientswere positive in pp65 antigenemia test，3 patients were positive in virus isolation.The sensitivity of HCMV pp67 mRNA RT-PCR was 100%，and the specificity was 87.9%，the sensitivity of HCMV pp65 antigenemia was 66.7%and the specificity was 92.8%，the difference was statistically significant（P＜0.05）.The result of ROC curve analysis showed the cutoff value of real-time RT-qPCR is 201.5copies/2×105Peripheral blood leucocyte cells，these hint this virus content can be used as a reference threshold of HCMV active infection.ConclusionThe sensitivity and specificity of the RT-qPCR are good，which can provide fast and accurate diagnosis of HCMV active infection，and lay the basis for clinical antiviral treatment.

human cytomegalovirus；pp67 mRNA；Real time RT-PCR；active infection

R 373.9

A

1000-1492（2016）03-0324-05

時間：2016/1/28 14：23：10 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.006.html

2015-12-25接收

國家自然科學(xué)基金（編號：30872253）；安徽省教育廳自然科學(xué)重大研究項目（編號：KJ2012ZD08）

安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，合肥 230032

鐘 峰，男，碩士研究生；

王明麗，女，教授，碩士導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：1952987441 @qq.com