磁性納米材料在循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測中的研究進(jìn)展

程世博 謝敏

(生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點實驗室，武漢430072；武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，武漢430072)

磁性納米材料在循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測中的研究進(jìn)展

程世博 謝敏*

(生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點實驗室，武漢430072；武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，武漢430072)

近年來，磁性納米材料由于其獨特的物理和化學(xué)性質(zhì)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。本文介紹磁性納米材料在細(xì)胞分離中的應(yīng)用情況，重點介紹其在循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離檢測中的研究進(jìn)展。

磁性納米材料；循環(huán)腫瘤細(xì)胞；分離；檢測

目前，癌癥是僅次于心血管疾病的人類第二大殺手，癌癥死亡率的90%與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，癌細(xì)胞從原發(fā)腫瘤脫落，進(jìn)入血液或淋巴循環(huán)系統(tǒng)，成為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)，其中一些具有高度轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)中存活下來，并進(jìn)一步發(fā)展為遠(yuǎn)端器官轉(zhuǎn)移腫瘤。CTCs作為原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶之間的鏈接以及腫瘤生物學(xué)和轉(zhuǎn)移的窗口，不僅是研究腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)過程和機(jī)制的一個重要切入點，而且可作為具有腫瘤(包括轉(zhuǎn)移灶)代表性的“液體活檢”(liquid biopsy)樣品，是指導(dǎo)個體化腫瘤診療的絕佳標(biāo)本[1,2]。研究證明，CTCs的檢測對于腫瘤患者早期診斷、術(shù)后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移監(jiān)測、抗腫瘤藥物敏感性評估以及選擇個體化的治療策略具有非常重要的意義[3－6]。

CTCs的分離主要是針對細(xì)胞的密度、尺寸、表面分子等生物物理特性進(jìn)行，包括密度梯度離心法[7]、基于尺寸的過濾法[8－11]以及基于表面特異性分子的免疫分離法等[12－17]。2004年，美國食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)了利用納米免疫磁珠實現(xiàn)CTCs富集的CellSearch檢測平臺[18－20]。該系統(tǒng)對CTCs的檢測具有良好的再現(xiàn)性，已在臨床應(yīng)用。隨著納米科技的發(fā)展，以納米顆粒[21－26]、納米線或納米纖維[27－32]、納米材料和結(jié)構(gòu)[33－39]為基礎(chǔ)的CTCs捕獲平臺，可有效增大細(xì)胞與捕獲靶點的接觸幾率，減少納米顆粒吸附對細(xì)胞活力和分析檢測的影響，從而提高細(xì)胞的捕獲效率和檢測準(zhǔn)確性，有助于實現(xiàn)CTC富集檢測的一體化。王樹濤研究員[27,30,38,40－43]的一系列研究工作表明，納米結(jié)構(gòu)與細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)存在三維拓?fù)湎嗷プ饔茫瑢?xì)胞捕獲及分離具有增強效應(yīng)，為探索制備高效的CTCs分離器件提供了新思路。

微流控技術(shù)可以實現(xiàn)對流體的精確操縱，適合用于CTCs的分離和捕獲[44－48]。2007年，Toner教授課題組[49]制備出用于CTCs分離的微流控芯片“CTC-chip”，成功用于癌癥患者外周血中CTCs的特異性檢測。此后，該課題組又研制了含有PDMS(聚二甲基硅氧烷)魚骨結(jié)構(gòu)的第二代芯片[50]，以及用于分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞簇的“Cluster-Chip”[51]，進(jìn)一步提高了CTCs的分離效果，推動了微流控芯片技術(shù)在CTCs分離中的應(yīng)用。通過優(yōu)化微流控芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計，改變芯片中細(xì)胞的運動模式，提高細(xì)胞與基底的接觸頻率，結(jié)合納米材料與細(xì)胞的三維拓?fù)湎嗷プ饔?，制備NanoVelcro芯片[29－32,52,53]，可實現(xiàn)少量血液樣品中CTCs的快速、高效捕獲。

以微流控芯片和納米技術(shù)為基礎(chǔ)的CTCs檢測技術(shù)有望滿足臨床診斷中樣品量少、檢測通量高、實時快速的檢測需求，在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。但是，基于免疫磁分離的CellSearch系統(tǒng)仍然是FDA批準(zhǔn)的唯一指定CTCs檢測平臺，可見磁性納米材料在CTCs分離檢測中具有重要地位。本文簡要介紹磁性納米材料制備和表面修飾的方法，重點討論磁性納米材料在CTCs檢測中的應(yīng)用進(jìn)展，探討磁性納米材料在CTCs檢測中的發(fā)展方向。

1 磁性納米材料的制備和表面修飾

1.1 磁性納米材料的制備

磁性納米材料是一類能夠被外加磁場操控的納米材料的統(tǒng)稱，通常由具有鐵磁性的鐵、鈷、鎳及其相應(yīng)的化合物組成，其中，以鐵或鐵化合物組成的磁性納米材料應(yīng)用較多。磁性納米粒子應(yīng)用廣泛，研究較早，制備方法也較為多樣，除常見的物理和化學(xué)方法外，還可使用生物法從生物體內(nèi)提取磁性納米材料。物理法是指借助物理手段，獲得磁性納米材料的方法，主要包括高能球磨法、濺射法、蒸發(fā)冷凝法等。物理方法制備磁性納米材料對儀器設(shè)備要求較高，但可進(jìn)行批量制備。生物法可依托眾多生物體內(nèi)自身存在的磁性納米材料，借助分離手段，提取生物相容性好的磁性納米材料，但是此法受產(chǎn)率和產(chǎn)量的限制，難以做到大規(guī)模生產(chǎn)。相比物理法和生物法，化學(xué)合成在磁性納米材料的合成、組裝、表面修飾和功能集成等方面展現(xiàn)出較大的優(yōu)勢，可制備出不同性能的磁性納米材料。

磁性納米粒子的化學(xué)制備方法種類繁多，包括沉淀法、化學(xué)氣相沉積、微乳液、油相高溫分解等。其中油相高溫分解法，利用有機(jī)溶劑的高沸點性，使前體在高溫下分解并結(jié)晶成核、生長，通過控制原料濃度、反應(yīng)時間以及投入的晶核大小可以方便控制粒子粒徑、形狀、晶型，得到單分散、粒徑小且均一、飽和磁化強度高的超順磁性納米顆粒。磁性納米材料的超順磁性是指，沒有外加磁場的情況下，磁性納米顆粒不會表現(xiàn)出磁性，若施加外加磁場，則會被磁化，就像順磁性一樣，而且磁化率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于順磁體的磁化率。因此，合成和使用超順磁性納米材料一直是當(dāng)前的研究熱點。磁性納米材料的粒徑必須小到一定尺寸才能具備超順磁性，但是粒徑越小，比表面積越大，表面能越高，納米材料越不穩(wěn)定。因此，有效利用超順磁性納米顆粒，需對其進(jìn)行表面修飾或包覆處理，提高其穩(wěn)定性的同時，還可與其他納米材料進(jìn)行功能集成，制備多功能磁性納米材料。

1.2 磁性納米材料的表面修飾

超順磁性納米材料可以經(jīng)SiO2等無機(jī)材料包覆，得到具有良好化學(xué)惰性、膠體穩(wěn)定性和生物相容性的磁性納米顆粒；此外，通過表面聚合或表面吸附等方式在超順磁性納米材料表面修飾具有不同結(jié)構(gòu)或功能的高分子材料，可以得到諸如溫敏磁性納米顆粒等具有特殊性能的磁性納米材料。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，將超順磁性納米材料與其他功能性納米材料進(jìn)行復(fù)合或組裝，在解決磁性納米顆粒穩(wěn)定性的同時，可制備新型的功能性磁性納米材料。Nie等[54]將磁性納米材料和量子點包埋進(jìn)SiO2微球的內(nèi)部，制備了熒光磁性納米材料。武漢大學(xué)龐代文教授課題組[55]采用層層自組裝的方式將量子點和磁性納米材料組裝于納米載體表面，通過控制量子點和磁性納米材料的組裝種類或?qū)訑?shù)制備具有不同熒光性能和不同磁響應(yīng)性能的可尋址熒光-磁性雙編碼納米材料，滿足高通量分析應(yīng)用的需要。此外，將磁性納米材料與金或石墨烯等材料復(fù)合，制備多種復(fù)合型磁性納米材料，可以滿足生物醫(yī)學(xué)分析檢測的應(yīng)用。

經(jīng)無機(jī)材料或高分子包覆的磁性納米材料以及與功能材料復(fù)合的多功能磁性納米材料表面富含―COOH或―NH2等功能基團(tuán)和大量的表面電荷，易與各種生物分子偶聯(lián)，實現(xiàn)生物功能化。偶聯(lián)功能性生物分子可采用直接法和間接法兩種方式。直接法即將生物分子通過共價鍵直接偶聯(lián)于磁性納米材料表面，制備具有生物靶向的磁性納米材料；間接法通常是利用鏈霉親和素和生物素之間的相互作用，將鏈霉親和素修飾的磁性納米材料與生物素化的生物分子進(jìn)行連接，從而制備生物分子衍生化的磁性納米材料。由于1個鏈霉親和素分子可以和4個生物素分子偶聯(lián)，因此通過間接方式制備的生物功能性磁性納米材料往往較直接偶聯(lián)法表面偶聯(lián)更多的生物分子，可提高生物分子在磁性納米材料表面的固載效率，便于進(jìn)行后續(xù)應(yīng)用。

2 磁性納米材料在細(xì)胞分離中的應(yīng)用

磁性納米材料由于其磁性的特點，使其在生物醫(yī)學(xué)的眾多領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用，其中在磁共振成像[56－58]、磁熱治療[59]、磁生物分離[60]、靶向載藥[61]和模擬酶催化[62]應(yīng)用等方面的研究較為廣泛和充分。細(xì)胞分離是磁性納米粒子在磁生物分離領(lǐng)域應(yīng)用最早的實例。20世紀(jì)70年代后期，Molday等[63]首創(chuàng)將磁性載體技術(shù)用于細(xì)胞分離。他們先用熒光染料標(biāo)記磁性復(fù)合微球，進(jìn)一步在其表面偶聯(lián)抗體或外源凝集素，用于血紅細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的磁場分離。與傳統(tǒng)的細(xì)胞分離技術(shù)相比(如流式細(xì)胞分離技術(shù)，F(xiàn)ACS)，磁免疫細(xì)胞分離技術(shù)不需要復(fù)雜的裝置，在外加磁場或普通磁鐵作用下即可實現(xiàn)靶細(xì)胞的分離，分離過程簡單，易于操作。近年來，隨著磁性納米材料的制備及表面修飾技術(shù)的發(fā)展，磁性納米材料在磁免疫細(xì)胞分離領(lǐng)域的應(yīng)用取得了長足的進(jìn)步。目前，磁性納米材料已經(jīng)可以用于血樣中CTCs的分離和檢測。下文將結(jié)合磁性納米材料的性能介紹磁性納米材料在CTCs分離和檢測中的應(yīng)用進(jìn)展。

2.1 磁性納米材料用于CTCs的分選

磁性納米材料用于細(xì)胞分選源于20世紀(jì)70年代，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，美國FDA于2004年批準(zhǔn)基于免疫磁分離的CellSearch系統(tǒng)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌的預(yù)后評估、無進(jìn)展生存期和總生存期的預(yù)測，并分別于2007年和2008年批準(zhǔn)其用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌及前列腺癌的輔助性診療。CellSearch系統(tǒng)利用修飾了包被抗上皮細(xì)胞黏附因子(EpCAM)抗體的磁性納米顆粒，通過抗原抗體反應(yīng)識別血液中所有表達(dá)EpCAM的細(xì)胞，利用磁場的磁力將結(jié)合了納米顆粒的細(xì)胞與血樣中其他細(xì)胞分離，進(jìn)一步通過熒光染料標(biāo)記的一抗(抗CD45抗體、抗細(xì)胞角蛋白(CK)8，18/19抗體)結(jié)合細(xì)胞核DAPI熒光染色試劑共同鑒別CTCs。經(jīng)免疫磁分離及熒光染色后，細(xì)胞尺寸大于5 μm，且DAPI+/CK+/CD45－則被鑒定為CTCs，而白細(xì)胞則是DAPI+/CK－/CD45+。雖然，基于免疫磁分離的CTCs分離(CellSearch)系統(tǒng)已經(jīng)成功商品化并用于臨床測試，但是該系統(tǒng)每次分析需要7.5 mL血樣，且CTCs分離效率較低，因此發(fā)展新型的磁性納米材料用于快速、高效地分離CTCs成為當(dāng)前的研究熱點。

眾所周知，細(xì)胞表面存在著幾十到幾百納米的表面結(jié)構(gòu)，如絲狀偽足、片狀偽足、微絨毛等。2009年，Desai教授小組[64]的研究表明，細(xì)胞與納米結(jié)構(gòu)微球表面的作用力遠(yuǎn)高于細(xì)胞與平滑微球表面的作用力，顯示了細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)與納米材料之間密切的相互作用。因此制備具有納米結(jié)構(gòu)的磁性材料，利用其表面的拓?fù)涮卣髟鰪姴牧吓c細(xì)胞間的三維拓?fù)湎嗷プ饔?，可提高?xì)胞分離效率?；诖?，Huang等[65]制備了具有巨噬細(xì)胞形貌的磁性納米材料。他們將巨噬細(xì)胞與磁性納米顆粒孵育，利用巨噬細(xì)胞的吞噬性能將納米顆粒胞吞于細(xì)胞內(nèi)部。隨后，以胞吞了磁性納米粒子的巨噬細(xì)胞為模板，在細(xì)胞表面進(jìn)行硅化處理并高溫煅燒，制備了具有細(xì)胞形貌的仿生磁性材料。在仿生磁性材料表面修飾抗體后，可獲得具有拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、磁響應(yīng)性、細(xì)胞靶向的多功能生物捕獲探針用于癌細(xì)胞的識別和捕獲。

為了提高CTCs的分離效率，除了構(gòu)建具有拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的磁性材料用于增強與細(xì)胞的相互作用外，提高磁性納米材料的磁響應(yīng)性，避免由于磁球磁響應(yīng)較慢造成細(xì)胞分離過程的損失是當(dāng)前磁性納米材料研究的另一個重要課題。Wen等[66]以納米級聚苯乙烯/丙烯酰胺共聚球為載體，通過層層自組裝的方式在納米球表面組裝多層磁性納米γ-Fe2O3，通過控制納米γ-Fe2O3的組裝層數(shù)調(diào)節(jié)磁性納米材料的磁響應(yīng)性。結(jié)果顯示，在納米微球表面組裝5層γ-Fe2O3后，磁性納米材料的粒徑為380 nm，飽和磁化強度為34.9 emu?g－1，可在1 min內(nèi)被磁力架全部分離，說明其具有粒徑小、飽和磁化強度高和磁響應(yīng)速度快的特點。上述磁性材料進(jìn)一步通過硅烷化修飾用以增強材料穩(wěn)定性，并修飾anti-EpCAM抗體后，可構(gòu)建快速響應(yīng)并能保持長時間穩(wěn)定的磁性納米探針，用于CTCs的快速分離和檢測。CTCs分選實驗表明，該探針與血液樣品孵育5 min即可實現(xiàn)靶細(xì)胞94%以上的捕獲效率，且分離后的細(xì)胞約90%保持良好活力。該磁性材料優(yōu)異的磁學(xué)性能、化學(xué)穩(wěn)定性和細(xì)胞分離特性，使其有望進(jìn)行商品化生產(chǎn)，進(jìn)入臨床應(yīng)用。

除了受磁性納米材料本身的影響，納米材料表面修飾的生物靶分子也會影響磁性納米探針的性能。目前，磁性納米材料表面一般修飾抗EpCAM的抗體用于CTCs的特異性識別，除此之外，功能性多肽修飾[67]的磁性納米材料亦可用于血液中少量癌細(xì)胞的檢測。近期，F(xiàn)ierer等[68]發(fā)現(xiàn)SpyLigase可催化蛋白連接，實現(xiàn)不可逆的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，從而將具有識別功能的抗體或類抗體(affibody，具有細(xì)胞識別功能的類似抗體的蛋白)進(jìn)行聚合形成蛋白多聚物。磁球與細(xì)胞的接觸面有限，因此在磁球表面連接盡可能多的抗體用于細(xì)胞識別，則可以大大提高細(xì)胞捕獲效率。將上述經(jīng)SpyLigase處理后形成的多聚類抗體與磁球偶聯(lián)，可有效提高磁球表面生物靶分子的固定量，實現(xiàn)對細(xì)胞表面抗原表達(dá)量少的靶細(xì)胞的高效識別和捕獲。因此，從新型磁性納米材料制備及有效固定生物分子兩個角度出發(fā)，探討性能優(yōu)異的磁性納米生物探針的制備方法可以為CTCs分選研究提供新的契機(jī)。

2.2 磁性納米復(fù)合材料用于CTCs的分選

磁性納米材料可以與其他功能性納米材料復(fù)合制備復(fù)合型磁性納米材料，用于CTCs的分選研究。近期，我們課題組[69]利用超聲自組裝的方法將量子點和磁性納米顆粒包埋進(jìn)兩親性羧甲基殼聚糖的內(nèi)部，制備了超順磁性的熒光-磁性納米材料。該法具有制備簡單的優(yōu)勢，所得產(chǎn)物熒光強度高、磁響應(yīng)速度快、生物相容性好，在其表面偶聯(lián)表皮生長因子(EGF)后，成功用于血液中表達(dá)表皮生長因子受體的少量癌細(xì)胞的特異性識別、捕獲及熒光成像。Shi等[70]在磁性納米顆粒表面通過共價偶聯(lián)碳納米點制備了具有雙光子熒光及磁學(xué)性能的碳納米點-磁性納米復(fù)合材料。該材料表面偶聯(lián)抗Glypican-3(肝癌特異性表達(dá)抗原)的抗體后，可以特異性識別和檢測摻雜于15 mL血樣中的10個癌細(xì)胞，捕獲效率達(dá)91%。由于該探針具有磁可操控性的同時，具有雙光子熒光性能，因此，從血樣中分離的少量癌細(xì)胞可以直接進(jìn)行雙光子熒光成像，實現(xiàn)了分離和檢測同步進(jìn)行，為CTCs的快速高靈敏分析奠定基礎(chǔ)。Wu等[71]通過高溫?zé)岱纸夥椒ㄖ苽浜?殼型Fe3O4/Au磁性納米顆粒，粒徑為(6.2±0.8)nm，具有磁響應(yīng)性的同時由于金殼層的包覆還可進(jìn)行暗場反射成像。該材料粒徑較小，在其表面偶聯(lián)不同的抗體后可以用于細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)抗原的特異性標(biāo)記。實驗表明，F(xiàn)e3O4/Au納米顆粒分別標(biāo)記抗EpCAM抗體、抗HER2抗體、抗EGFR抗體及抗CK抗體后可制備多種納米生物探針，用于結(jié)腸癌、乳腺癌及皮膚癌細(xì)胞的特異性識別和暗場反射成像。腫瘤細(xì)胞具有異質(zhì)性，聯(lián)合使用不同抗體修飾的兩種Fe3O4/Au納米探針相比于使用一種納米生物探針，可以大大提高癌細(xì)胞的捕獲效率，如：抗HER2抗體修飾的Fe3O4/Au納米探針對SK-BR-3細(xì)胞的捕獲效率是(69±7)%，而聯(lián)合使用抗HER2抗體修飾的Fe3O4/Au及抗EpCAM抗體修飾的Fe3O4/Au后對SK-BR-3細(xì)胞的捕獲效率為(93±10)%，說明使用多種抗體針對細(xì)胞表面多種腫瘤標(biāo)志物可以提高細(xì)胞的捕獲效率。

此外，Wang等[72]制備了具有上轉(zhuǎn)換熒光性能的磁性納米材料，在其表面偶聯(lián)抗EpCAM的抗體后用于血液中少量癌細(xì)胞的分離。由于該材料具有上轉(zhuǎn)換熒光性能，可以擯除傳統(tǒng)熒光成像中系統(tǒng)自發(fā)熒光的影響，因此經(jīng)磁分離的細(xì)胞可以直接進(jìn)行上轉(zhuǎn)換熒光成像，實現(xiàn)癌癥病人樣品中CTCs的捕獲和上轉(zhuǎn)換熒光分析。Yang等[73]制備了磁性氧化石墨烯，可用于磁分離和電化學(xué)檢測，在其表面偶聯(lián)抗PSMA抗體后，實現(xiàn)血液中PSMA蛋白及PSMA陽性表達(dá)的PCa前列腺癌細(xì)胞的分離和電化學(xué)檢測。該工作利用磁性氧化石墨烯實現(xiàn)了腫瘤標(biāo)志物和腫瘤細(xì)胞的分離和檢測。以上研究表明，發(fā)展新型的磁功能性納米材料，利用磁分離的同時，發(fā)揮材料的光學(xué)或電學(xué)性能，可以實現(xiàn)CTCs的高靈敏檢測。

2.3 磁性納米材料與物理分離結(jié)合用于CTCs的分選

癌細(xì)胞與血液中白細(xì)胞、紅細(xì)胞或血小板等血液成分，在尺寸、密度、變形性及黏附性等物理特性方面均存在明顯的差異，因此，研究者可以利用上述差異將血液中CTCs與其他血液成分進(jìn)行分離，如：基于密度的離心分離法[7]以及基于尺寸大小的尺寸排阻分離法[8,9]等。上述基于CTCs物理性質(zhì)的分離方法操作簡單，對細(xì)胞損傷小且利于后續(xù)檢測。但是由于CTCs尺寸與部分血細(xì)胞尺寸有交叉，如果物理參數(shù)選擇不當(dāng)會使CTCs產(chǎn)率偏低或者與白細(xì)胞共存，特異性較差。將基于物理性質(zhì)的分離方式與免疫磁分離相結(jié)合，同時發(fā)揮物理分離與免疫分離兩種分離方式的優(yōu)勢，可提高CTCs的分離效率和純度。

Chung等[74]將抗EpCAM抗體修飾的3.28 μm磁性微球與摻雜了少量MCF-7細(xì)胞的血液樣品孵育。隨后將血樣注入固定有半環(huán)形磁鐵的特制注射式過濾器，采用免疫磁分離除去大量的血細(xì)胞，分離純化出MCF-7細(xì)胞。隨后，再經(jīng)過直徑13 mm、孔徑為5 μm的濾膜過濾，進(jìn)一步去除MCF-7細(xì)胞里存在的少量其他血細(xì)胞，從而達(dá)到分離純化血液中少量癌細(xì)胞的目的。實驗結(jié)果顯示，該方法可以對0.5 mL血液中摻雜的10個MCF-7細(xì)胞達(dá)到70%的分離純化效率。Zhang等[75]使用了與Chung等類似的分離方式，所不同的是他們將3 μm的磁性微球與含有癌細(xì)胞的血液孵育后，采取了先尺寸分離再免疫磁分離的方式。血液樣品與磁球孵育后，首先經(jīng)過直徑3.5 mm、孔徑8 μm的濾膜過濾，之后再經(jīng)過免疫磁分離，得到磁球標(biāo)記的癌細(xì)胞。實驗表明，磁球與癌細(xì)胞結(jié)合后可以有效避免過濾時細(xì)胞的變形性；同時磁球增大細(xì)胞的尺寸，進(jìn)而可以選擇較大孔徑的濾膜，從而去除絕大多數(shù)白細(xì)胞，降低白細(xì)胞在濾膜上的殘留；最后，濾膜上的細(xì)胞還可經(jīng)進(jìn)一步磁分離，去除尺寸分離時殘留的少量白細(xì)胞，大大提高了癌細(xì)胞的分離純度。該法對每毫升血液摻雜有50－200個癌細(xì)胞的分離效率達(dá)90%以上，對摻雜5－10個癌細(xì)胞的分離效率可達(dá)80%。值得一提的是，由于該法使用了尺寸分離和免疫磁分離兩種分離模式，大大提高了癌細(xì)胞的分離純度，回收的癌細(xì)胞純度達(dá)98%以上。上述研究表明，將免疫磁分離技術(shù)與基于物理特性的分離方法相結(jié)合，可以對CTCs的分離效率和分離純度有明顯的提升，為CTCs相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

2.4 磁性納米材料與微流控芯片結(jié)合用于CTCs的分選

微流控芯片是利用微機(jī)械、微電子技術(shù)制備的含有小尺度(從微米到納米)通道、腔、閥、泵等微結(jié)構(gòu)的流體器件。微流控芯片通過不同結(jié)構(gòu)設(shè)計，調(diào)節(jié)芯片的流體特性，結(jié)合生物工程及納米技術(shù)，在CTCs檢測方面展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。一系列研究表明，微流控芯片用于CTCs分析時，所需樣品量小，無須對血液樣品進(jìn)行前處理，且流動的流體環(huán)境可有效除去血液中的其他細(xì)胞，對CTCs的分離純度較高，可用于血液中CTCs的高通量、快速檢測。但是，基于微流控芯片裝置捕獲的CTCs往往固定于芯片內(nèi)，很難進(jìn)行回收利用；因此，將微流控芯片與磁性納米材料相結(jié)合，利用微流控芯片的流體性能以及磁性納米材料的可操控性，構(gòu)建微流控磁免疫分離平臺，獲得活力好、純度高的CTCs，方便進(jìn)行后續(xù)分析和檢測。

基于微流控芯片的磁免疫分離體系一般以芯片為載體，將表面連接抗體的磁性納米顆粒與含靶細(xì)胞的血樣混合后通入芯片中，通過芯片集成的磁場及芯片的流體作用實現(xiàn)CTCs的磁分離及洗滌等步驟[76－80]?；谏鲜鲈恚琄im等[76]構(gòu)建了基于微流控芯片的CTCs免疫磁分離平臺。他們在微流控芯片底部電鍍鎳鐵金屬線陣列，在外加磁場誘導(dǎo)下，鎳鐵導(dǎo)線陣列會產(chǎn)生磁場梯度。當(dāng)anti-EpCAM修飾的磁性納米顆粒與含SK-BR-3細(xì)胞的血樣混合并通入芯片中，被磁球識別的SK-BR-3細(xì)胞會在誘導(dǎo)磁場及流體的作用下，發(fā)生側(cè)向磁泳。最終，SK-BR-3細(xì)胞通過側(cè)向磁泳移動至固定區(qū)域，從而實現(xiàn)高效、高純度的CTCs分離。實驗結(jié)果顯示，在流體流速為每小時5 mL時，該裝置對血液中摻雜的少量癌細(xì)胞能實現(xiàn)90%的分離效率和97%的分離純度。值得一提的是，該裝置分離的CTCs保持了較好的活力，方便用于基因分析等后續(xù)檢測。

Toner及其合作者在微流控芯片用于CTCs分離和檢測方面做出了大量開創(chuàng)性的工作。他們制備了“CTC-chip”[49]和魚骨芯片[50]等，將其成功用于血液中少量癌細(xì)胞的檢測。近期，為了得到活力好的CTCs，他們將微流控芯片與磁免疫分離相結(jié)合，制備了“CTC-iChip”[81]用于CTCs的捕獲。該芯片主要包括兩部分：第一部分主要是基于CTCs與血液成分在尺寸及變形性等物理特性上的差異，利用流體的確定性側(cè)向位移(deterministic lateral displacement)作用除去血液中紅細(xì)胞、血小板及多余磁珠；第二部分，在慣性聚焦(inertial focusing)流體力的作用下結(jié)合磁泳技術(shù)將磁球標(biāo)記的CTCs和白細(xì)胞分離。該裝置可使用正選和負(fù)選兩種方式分離CTCs，不同之處在于所用磁球表面標(biāo)記抗體的種類：若采用anti-EpCAM抗體修飾的磁珠，磁珠與CTCs結(jié)合，通過該裝置可得到磁球標(biāo)記的CTCs，即為正選；若采用anti-CD45或anti-CD66b抗體標(biāo)記的磁珠與血液孵育，白細(xì)胞被磁球標(biāo)記后通過慣性聚焦和磁泳除去，從而得到未被標(biāo)記的CTCs，即為負(fù)選。該“CTC-iChip”的負(fù)選模式適用于EpCAM表達(dá)較弱或不表達(dá)的CTCs分離，且對CTCs活性基本無影響，分離后的CTCs可進(jìn)行培養(yǎng)、增殖及后續(xù)基因分析，有望用于基于CTCs的個性化腫瘤診斷和治療。

Kelley及其合作者[82]將微流控芯片與磁免疫分離結(jié)合用于血液中CTCs的異質(zhì)性分析。他們設(shè)計了具有V型結(jié)構(gòu)域的微流控芯片用于CTCs的捕獲，并運用了類似圣誕樹的結(jié)構(gòu)在同一芯片的不同區(qū)域?qū)崿F(xiàn)不同流速控制，將結(jié)合有不同數(shù)目磁球的CTCs固定在不同的V型結(jié)構(gòu)域中，用于癌細(xì)胞亞類分析。實驗過程中，當(dāng)含有靶細(xì)胞的血樣與磁性納米材料孵育后，通入到含有磁場和V型結(jié)構(gòu)的微流控芯片中，細(xì)胞在不同流速下受到流體的牽引力會有不同，流速越大，細(xì)胞所受牽引力越大；與此同時，細(xì)胞與磁球結(jié)合后在磁場作用下會受磁吸引力影響，當(dāng)細(xì)胞所受磁吸引力大于或與流體的牽引力相當(dāng)時，細(xì)胞則被固定在V型區(qū)域，細(xì)胞表面抗原表達(dá)量多則被固定在高流速區(qū)域，細(xì)胞表面抗原表達(dá)量低則被固定在低流速區(qū)，實現(xiàn)癌細(xì)胞的分類。通過該裝置，他們成功實現(xiàn)了EpCAM表達(dá)量不同的3種癌細(xì)胞，即Vcap(前列腺癌細(xì)胞)、SK-BR-3(乳腺癌細(xì)胞)、MDA-MB-231(乳腺癌細(xì)胞)的分類分析，并將該方法用于癌癥病人血樣中的CTCs分型檢測。近期，該課題組設(shè)計了具有雙重分離性能的微流控芯片，結(jié)合兩種修飾不同適配體(anti-EpCAM或anti-HER2)的磁珠，可以同時對SK-BR-3及MDA-MB-361兩種乳腺癌細(xì)胞表面EpCAM及HER2表達(dá)量的高低進(jìn)行定性和定量檢測[83]。以上研究表明，微流控芯片與磁免疫分離相結(jié)合，不僅可以用于CTCs的無損分離，還可用于CTCs異質(zhì)性分析和檢驗，在未來CTCs的研究中將發(fā)揮重要作用。

2.5 可分解磁性納米材料用于CTCs的捕獲和釋放

發(fā)展有效的技術(shù)手段，滿足CTCs高效捕獲的同時，實現(xiàn)CTCs無損傷釋放，獲取具有高生物活力的CTCs，是當(dāng)前的研究熱點。目前，基于核酸適配體[29]、溫敏材料[28,53]的智能化傳感界面已成功實現(xiàn)CTCs可逆捕獲和釋放；此外，光[9,32]和電信號[84]誘導(dǎo)下的CTCs釋放研究也取得了一定進(jìn)展。免疫磁分離作為CTCs捕獲的重要手段，在捕獲CTCs的同時，將CTCs與磁球有效解離，方便CTCs的后續(xù)分析和培養(yǎng)，是目前亟待解決的重要問題。

為了實現(xiàn)上述目的，Huang等[65]以二硫鍵為橋在磁球表面修飾了鏈霉親和素并固定了生物素化的抗EpCAM抗體，用于識別和捕獲MCF-7細(xì)胞。該磁球特異性識別MCF-7細(xì)胞后，加入二硫蘇糖醇(DTT)用于破壞二硫鍵，切斷磁球與抗EpCAM抗體的連接，使得磁球與細(xì)胞解離，成功實現(xiàn)了MCF-7細(xì)胞的捕獲和釋放。該類磁性納米材料與生物靶分子的連接是可逆的，我們稱其為可分解磁性納米材料。

近期，我們課題組在可分解磁性納米材料的制備及用于CTCs的捕獲和釋放方面也開展了一系列工作，我們成功制備了化學(xué)[85]、生物[16]及光敏感[86]3類可分解磁性納米探針用于CTCs的捕獲和釋放。我們利用了鈣離子交聯(lián)形成的海藻酸鈉殼層可以被EDTA破壞和瓦解的原理，在熒光磁性納米材料表面形成了海藻酸鈉殼層，并將海藻酸鈉-鏈霉親和素偶聯(lián)物組裝于熒光磁性納米材料表面，用于進(jìn)一步連接生物素化的抗EpCAM抗體分子。隨后，利用EDTA對鈣離子的螯合作用，實現(xiàn)對海藻酸鈉殼層的破壞，從而達(dá)到釋放抗體分子的目的，可以用于SK-BR-3細(xì)胞的特異性捕獲和有效釋放。

此外，我們采用化學(xué)偶聯(lián)的方法制備了Steptag多肽衍生化的二抗，通過Streptag與Streptactin工程化蛋白的特異性識別作用將其固定在修飾有Streptactin的磁性納米材料表面，進(jìn)一步結(jié)合可識別CTCs的一抗之后，用于CTCs的捕獲。由于biotin可以競爭性結(jié)合Streptactin與Steptag相互作用的位點，加入biotin后，多肽修飾的二抗連同一抗會從磁性材料表面競爭性解離，從而實現(xiàn)CTCs的可逆釋放。我們將該方法用于17例癌癥病人血液中CTCs的捕獲，分別檢出2－215個CTCs，并成功得到釋放后癌癥病人的CTCs。

最近，我們又以光敏分子7-氨基香豆素為橋在磁球表面固定抗EpCAM抗體，用于CTCs的捕獲。7-氨基香豆素可在365 nm或800 nm的光照射下釋放與之化學(xué)鍵連的分子，用其做橋連接磁球和抗EpCAM抗體可以在光照條件下實現(xiàn)CTCs與磁球的有效分離。我們也成功將該探針用于13例腫瘤患者血液中CTCs的捕獲和光控釋放。

可分解磁性納米材料具有磁可操控性以及刺激響應(yīng)性，修飾上特定的生物分子后，可以用于CTCs的捕獲；同時，在特定的信號刺激下，磁球和CTCs有效解離，方便對CTCs的后續(xù)分析和培養(yǎng)等生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。但是，目前可分解磁性納米材料的種類還比較少，應(yīng)用效果也有待進(jìn)一步提高。

3 總結(jié)與展望

近年來，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，磁性納米材料的合成和制備工藝取得了巨大進(jìn)步，具有光學(xué)、電學(xué)及刺激響應(yīng)性等功能的復(fù)合磁性納米材料的制備和合成工藝亦有顯著提高。上述材料在CTCs捕獲、檢測、釋放等方面都發(fā)揮了重要作用。與此同時，將免疫磁分離與微流控平臺相結(jié)合，同時發(fā)揮免疫磁分離的磁操控特性以及微流控芯片的流體操控特性，實現(xiàn)CTCs的無損捕獲，獲得活力好、純度高的CTCs，方便對其進(jìn)行后續(xù)分析、培養(yǎng)以及耐藥性實驗，從而實現(xiàn)腫瘤的個性化診療，是當(dāng)前CTCs的研究熱點。因此，制備性能優(yōu)異的磁性納米材料，并與微流控平臺相結(jié)合，發(fā)展?jié)M足臨床需求的CTCs分離方法是當(dāng)前磁性納米材料用于CTCs分選的重點，也是未來的發(fā)展方向。

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Progress in Detection of Circulating Tumor Cells by Magnetic Nanomaterials

CHENG Shi-BoXIE Min*
(Key Laboratory of Analytical Chemistry for Biology and Medicine(Ministry of Education),Wuhan 430072,P.R.China; College of Chemistry and Molecular Sciences,Wuhan University,Wuhan 430072,P.R.China)

Recently,magnetic nanomaterials are widely applied in biomedical area owing to their unique physical and chemical properties.Herein,we introduce the progress of application of magnetic nanomaterials in cell separation,especially,in detection of circulating tumor cells from human whole blood.

Magnetic nanomaterials;Circulating tumor cells;Separation;Detection

G64；O65；R73

*通訊作者，Email:mxie@whu.edu.cn

國家自然科學(xué)基金(81071227，21575110)

10.3866/PKU.DXHX201607001

www.dxhx.pku.edu.cn