一種高效省時(shí)的利用磷酸鈣轉(zhuǎn)染DNA的改進(jìn)方法

黃　進(jìn),傅吉強(qiáng),張慶華*

(同濟(jì)大學(xué)a.生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，b.醫(yī)學(xué)院，中國(guó) 上?！?00092)

?

一種高效省時(shí)的利用磷酸鈣轉(zhuǎn)染DNA的改進(jìn)方法

黃進(jìn)a,傅吉強(qiáng)b,張慶華a*

(同濟(jì)大學(xué)a.生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，b.醫(yī)學(xué)院，中國(guó) 上海200092)

摘要對(duì)傳統(tǒng)磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行改進(jìn)，即在經(jīng)胰酶消化處理成懸浮狀態(tài)的293T細(xì)胞懸液中直接加入磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑,而不需待其貼壁后再加轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染．通過(guò)比較懸浮和貼壁狀態(tài)下293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞增殖和熒光強(qiáng)度等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)這兩種轉(zhuǎn)染方法的各項(xiàng)指標(biāo)沒(méi)有顯著性差異．結(jié)果表明，293T細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下進(jìn)行磷酸鈣轉(zhuǎn)染與傳統(tǒng)的貼壁轉(zhuǎn)染能夠達(dá)到同等效果，在用胰酶消化的單細(xì)胞懸液中直接加入磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，不影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果，節(jié)省了操作步驟，縮短了操作時(shí)間．

關(guān)鍵詞293T細(xì)胞；磷酸鈣；貼壁狀態(tài)；懸浮狀態(tài)；細(xì)胞轉(zhuǎn)染

An Efficient and Time-Saving Method for DNA Transfection Using Calcium Phosphate

HUANGJina,FuJi-qiangb,ZHANGQing-huaa*

(a.School of Life Science and Technology, b.School of Medicine, Tongji University, Shanghai 200092, China)

AbstractThe use of calcium phosphate for the transfection of adherent cells was a traditional and popular yet complicated and time-consuming method. In this paper, this traditional method is further improved through the direct addition of calcium phosphate transfection reagent into the trypsinized 293T cell suspension solution, instead of adding transfection reagent after the cells were adhered to the bottom. By comparison with such indicators as transfection efficiency, cell proliferation and fluorescence intensity of 293T cells in suspended status and adherent status, we found no significant difference between the two transfection methods with regard to these indicators. Based on the results from this work, the use of calcium phosphate in transfecting 293T cells in suspended status could be same efficient and effective as the traditional adherent transfection method. With the transfection efficiency unaffected, our method of directly adding calcium phosphate transfection reagent into the trypsinized single-cell suspension solution is not only experimentally simplified in procedure but also time-saving in operation.

Key words293T cells; calcium phosphate; adherent status; suspended status; cell transfection

目前有多種細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，例如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法[1]、基因鳥槍法、電穿孔法[2]、顯微注射法[3]和磷酸鈣共沉淀法等．脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法雖然操作簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)染效率較高，但脂質(zhì)體價(jià)格昂貴，且細(xì)胞毒性較大；基因鳥槍法速度快，簡(jiǎn)單易行，成本較低，但不適用于真核細(xì)胞；電穿孔法轉(zhuǎn)染效率高，但所需儀器較貴，對(duì)細(xì)胞損傷較大；顯微注射法整合效率高，不需載體，但需精密儀器，技術(shù)難度大，且價(jià)格昂貴；磷酸鈣轉(zhuǎn)染所需材料價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)染效率高，適用范圍廣，且細(xì)胞毒性較低．所以，在很多DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，多用磷酸鈣作為轉(zhuǎn)染試劑．

利用磷酸鈣將攜帶有外源基因的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞，是一種操作簡(jiǎn)單且應(yīng)用廣泛的方法[4]．磷酸鈣共沉淀是基于磷酸鈣-DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染方法，在DNA的轉(zhuǎn)染過(guò)程中，磷酸鈣-DNA復(fù)合物黏附到細(xì)胞膜上并通過(guò)胞吞作用進(jìn)入靶細(xì)胞[5]，被轉(zhuǎn)染的DNA隨即整合到靶細(xì)胞的染色體中，從而產(chǎn)生有不同基因型和表型的穩(wěn)定克隆．這種方法不僅適用于多種細(xì)胞，而且還具有生物相容性和降解性[6]．磷酸鈣與DNA形成的復(fù)合物顆粒太大或太小都會(huì)影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率．在磷酸鈣與DNA的混合過(guò)程中，雖然在大部分的弱堿性范圍內(nèi)都會(huì)形成復(fù)合物顆粒，但只有在較短的孵育時(shí)間(例如1 min)、極小的pH范圍內(nèi)形成的顆粒才能很好地被細(xì)胞攝取，從而獲得較高的轉(zhuǎn)染效率[7]．

通常利用磷酸鈣轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞是在鋪板并待其貼壁以后進(jìn)行．但是在貼壁轉(zhuǎn)染時(shí)，只有暴露于培養(yǎng)基的上半部分細(xì)胞表面可以直接接觸到磷酸鈣-DNA復(fù)合物．進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，需要在轉(zhuǎn)染前一天進(jìn)行細(xì)胞鋪板，操作繁瑣且耗時(shí)[8]．而細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下直接進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞和磷酸鈣-DNA復(fù)合物都均勻分散于培養(yǎng)基中，293T細(xì)胞和磷酸鈣-DNA復(fù)合物同時(shí)沉降，在細(xì)胞貼壁的過(guò)程中，整個(gè)細(xì)胞表面(包括貼于培養(yǎng)皿的下半部分細(xì)胞表面)都會(huì)附著磷酸鈣-DNA復(fù)合物．所以相對(duì)來(lái)說(shuō)，懸浮狀態(tài)下進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染可以使細(xì)胞表面附著更多的磷酸鈣-DNA復(fù)合物，保證其能攝入足量的磷酸鈣-DNA復(fù)合物顆粒．因此，可以在貼壁細(xì)胞經(jīng)胰酶消化成懸浮狀態(tài)之后、細(xì)胞鋪板之前的足量細(xì)胞懸液(例如鋪10個(gè)dish)中直接加入孵育好的磷酸鈣-DNA復(fù)合物，立即混勻，即進(jìn)行懸浮轉(zhuǎn)染，然后依次鋪板．這種方法合并了細(xì)胞鋪板和細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)程，省去了貼壁轉(zhuǎn)染時(shí)逐個(gè)平皿滴加磷酸鈣-DNA復(fù)合物的過(guò)程(這個(gè)過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)，磷酸鈣-DNA復(fù)合物顆粒很容易過(guò)大而影響轉(zhuǎn)染效果)．所以，懸浮轉(zhuǎn)染比傳統(tǒng)的貼壁轉(zhuǎn)染操作更簡(jiǎn)便、更省時(shí)且適合大規(guī)模操作[9]．本研究基于磷酸鈣轉(zhuǎn)染細(xì)胞的以上特點(diǎn)，對(duì)比293T細(xì)胞在懸浮和貼壁狀態(tài)下的轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞增殖和熒光強(qiáng)度等指標(biāo)，從而獲得了比傳統(tǒng)貼壁轉(zhuǎn)染更加簡(jiǎn)便省時(shí)且高效的293T細(xì)胞磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法，即懸浮轉(zhuǎn)染．

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種與質(zhì)粒大腸桿菌菌株Dpα，包裝質(zhì)粒psPAX2，包膜蛋白質(zhì)粒pMD2G，載體質(zhì)粒pRRL-EF1α-eGFPLuc-WPRE，同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院臨床轉(zhuǎn)化中心實(shí)驗(yàn)室保存．

1.1.2細(xì)胞株人腎胚胎(human embryonic kidney, HEK)293T細(xì)胞，同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院臨床轉(zhuǎn)化中心實(shí)驗(yàn)室保存．

1.1.3試劑各種限制性內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs公司，達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM) 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen Gibco公司，胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen Gibco公司，青霉素和鏈霉素溶液(以下簡(jiǎn)稱雙抗)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，聚凝胺(Polybrene)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，0.25%Typsin-EDTA購(gòu)自美國(guó)Invitrogen Gibco公司,氯化鈣購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)．

1.2方法

1.2.1載體質(zhì)粒pRRL-EF1α-eGFPLuc-WPRE的設(shè)計(jì)載體質(zhì)粒pRRL-EF1α-eGFPLuc-WPRE(如圖1)有5′端呼吸道荷包病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列5′RSV-LTR，剪接供體SD，病毒顆粒蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)因子應(yīng)答件RRE，剪接受體SA，中央多嘌呤序列cPPT，長(zhǎng)啟動(dòng)子EF1α，增強(qiáng)型的綠色熒光蛋白eGFP，熒光素酶Luciferase，土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件WPRE和3′端長(zhǎng)末端重復(fù)序列等系列元件組成．運(yùn)用BamHⅠ和SpeⅠ等限制性內(nèi)切酶和DNA重組技術(shù)將目的基因eGFP-Luciferase克隆到慢病毒載體質(zhì)粒上．

1.2.2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染取293T細(xì)胞鋪于6孔板中，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，共分3組，每組3個(gè)重復(fù)樣孔，并編號(hào)，第1組為對(duì)照組，第2組為貼壁轉(zhuǎn)染組，第3組為懸浮轉(zhuǎn)染組，用含有雙抗(青霉素終濃度為0.833 mkat/L(即50 U/mL)，鏈霉素終濃度為50 g/L)的完全DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS)2 mL進(jìn)行培養(yǎng)．24 h后，將第3組孔中細(xì)胞用200 μL胰酶消化1 min，然后加DMEM完全培養(yǎng)基終止，使細(xì)胞成懸浮狀態(tài)．第2組和第3組同時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒的磷酸鈣轉(zhuǎn)染，首先每孔按照100 μL ddH2O,15 μL 2 mol/L CaCl2和2 μg載體質(zhì)粒的量放于EP管中，并混勻，然后將等體積2×Hebs加入EP管中(需在液面以下加，邊加邊混勻，不超過(guò)20 s)，靜置30 s，隨即將磷酸鈣-DNA復(fù)合物懸液貼液面均勻散開(kāi)加入到相應(yīng)孔中，然后將6孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)．30 min后，在40倍光學(xué)顯微鏡下觀察6孔板培養(yǎng)基中沉淀大小及密度，然后再次將6孔板放回細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)．轉(zhuǎn)染12~16 h后，每孔用2 mL新鮮DMEM完全培養(yǎng)基換液處理．

1.2.3病毒包裝用三質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞制備皰疹性口炎病毒的包膜糖蛋白(vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein, VSV-G)假型慢病毒顆粒[10]．取293T細(xì)胞鋪于6孔板中，每孔1×106個(gè)細(xì)胞，共3組，每組3個(gè)重復(fù)樣孔，并編號(hào)，第1組為對(duì)照組，第2組為貼壁轉(zhuǎn)染組，第3組為懸浮轉(zhuǎn)染組，用含有雙抗的完全DMEM培養(yǎng)基(濃度同1.2.2)2 mL進(jìn)行培養(yǎng)．24 h后，將第3組孔中細(xì)胞用200 μL胰酶消化1 min，然后加DMEM完全培養(yǎng)基終止，使細(xì)胞成懸浮狀態(tài)．將第2組和第3組進(jìn)行質(zhì)粒的磷酸鈣轉(zhuǎn)染，首先將每孔按照100 μL dd H2O,15 μL 2 mol/L CaCl2,0.75 μg psPAX2,0.5 μg pMD2G和2 μg載體質(zhì)粒的量放于EP管中，并混勻，然后將等體積2×Hebs加入EP管中(需在液面以下加，邊加邊混勻，不超過(guò)20 s)，靜置30 s，隨即將磷酸鈣-DNA復(fù)合物懸液貼液面均勻散開(kāi)加入到相應(yīng)孔中，然后將6孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)．30 min后，在40倍光學(xué)顯微鏡下觀察6孔板培養(yǎng)基中沉淀大小及密度，然后再次將6孔板放回細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)．轉(zhuǎn)染12~16 h后，每孔用2 mL新鮮DMEM完全培養(yǎng)基換液處理．轉(zhuǎn)染48 h后，分別收集6孔板中每孔的培養(yǎng)基于1.5 mL EP管中，2 000 r/min離心5 min使細(xì)胞碎片沉于管底．

1.2.4病毒感染取293T細(xì)胞鋪于6孔板中，每孔1×106個(gè)細(xì)胞，共分3組，每組3個(gè)重復(fù)樣孔，并編號(hào)，第1組為對(duì)照組，第2組為貼壁包裝病毒感染組，第3組為懸浮包裝病毒感染組，用含有雙抗的完全DMEM培養(yǎng)基(濃度同1.2.2)2 mL進(jìn)行培養(yǎng)．24 h后，吸去每孔的培養(yǎng)基，將1.2.3步驟收集的上清液依次貼孔壁緩慢加入到相應(yīng)的孔中，組別應(yīng)與1.2.3步驟中組別一一對(duì)應(yīng)，即第1組每孔加1.5 mL對(duì)照組培養(yǎng)上清，第2組每孔加1.5 mL貼壁轉(zhuǎn)染組病毒上清，第3組每孔加1.5 mL懸浮轉(zhuǎn)染組病毒上清，然后將6孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)．

1.2.5細(xì)胞計(jì)數(shù)在質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后，病毒包裝48 h后和病毒感染48 h后，分別用200 μL胰酶消化相應(yīng)細(xì)胞，然后將10 μL細(xì)胞懸液與10 μL 0.4%臺(tái)盼蘭染液進(jìn)行混合，取10 μL混合液滴加于血球計(jì)數(shù)板蓋玻片邊緣，使混合液緩緩滲入血球計(jì)數(shù)室內(nèi)，在10倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，比較第1組、第2組和第3組之間細(xì)胞增殖情況．

1.2.6流式細(xì)胞檢測(cè)在進(jìn)行1.2.5步驟細(xì)胞計(jì)數(shù)的同時(shí)，收取足量細(xì)胞利用BD流式細(xì)胞儀在FITC通道中進(jìn)行流式分析．

1.2.7熒光成像在細(xì)胞計(jì)數(shù)和流式分析前，將質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后，病毒包裝48 h后和病毒感染48 h后的6孔板細(xì)胞置于熒光倒置顯微鏡下進(jìn)行熒光成像檢測(cè)．

1.2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，樣本以t檢驗(yàn)分析其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，當(dāng)P<0.05時(shí)，判定具有顯著性差異．

2結(jié)果

2.1磷酸鈣-DNA復(fù)合物沉淀顆粒觀察

293T細(xì)胞在貼壁狀態(tài)和懸浮狀態(tài)下瞬時(shí)轉(zhuǎn)染30 min后，在40倍光學(xué)顯微鏡下觀察磷酸鈣-DNA復(fù)合物顆粒的形成狀況(如圖2)，發(fā)現(xiàn)兩種狀態(tài)下的細(xì)胞培養(yǎng)基中磷酸鈣-DNA復(fù)合物顆粒大小適中，分布均勻，并且顆粒在培養(yǎng)基中不停地顫動(dòng)．當(dāng)這些復(fù)合物顆粒附著于細(xì)胞表面以后，會(huì)以胞吞的形式被攝入胞內(nèi)．

2.2貼壁和懸浮狀態(tài)下293T細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效果比較

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h以后，分別對(duì)兩種狀態(tài)下轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行流式分析(如圖3)，每組進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn).發(fā)現(xiàn)貼壁狀態(tài)下轉(zhuǎn)染的第2組轉(zhuǎn)染效率為91.3%±1.2%，在懸浮狀態(tài)下轉(zhuǎn)染的第3組轉(zhuǎn)染效率為89.5%±1.5%，第2組和第3組經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較，P>0.05，沒(méi)有顯著性差異，說(shuō)明在懸浮狀態(tài)下細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率與貼壁狀態(tài)一致，兩組轉(zhuǎn)染效率均較高，達(dá)到了細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)所需要求．瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h以后，對(duì)照組、貼壁轉(zhuǎn)染組和懸浮轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞數(shù)分別為(1.24±0.18)×106/mL,(9.13±0.18)×105/mL和(9.25±0.35)×105/mL．每組進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，B組和C組經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較，P>0.05，沒(méi)有顯著性差異.由于轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞本身有毒性作用，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)目略低于對(duì)照組，但貼壁轉(zhuǎn)染組和懸浮轉(zhuǎn)染組細(xì)胞計(jì)數(shù)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明在懸浮狀態(tài)下進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞增殖沒(méi)有影響．將6孔板置于10倍熒光倒置顯微鏡下進(jìn)行熒光成像(如圖4，彩圖見(jiàn)封三)，可見(jiàn)貼壁轉(zhuǎn)染組和懸浮轉(zhuǎn)染組細(xì)胞陽(yáng)性率均較高，且兩組熒光強(qiáng)度相近．通過(guò)流式分析發(fā)現(xiàn)，貼壁轉(zhuǎn)染組和懸浮轉(zhuǎn)染組熒光強(qiáng)度分別為(3.23±0.08)×106和(3.02±0.15)×106，懸浮狀態(tài)下進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染的熒光強(qiáng)度與貼壁狀態(tài)下轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光強(qiáng)度對(duì)比，P>0.05，沒(méi)有顯著性差異．根據(jù)以上結(jié)果得出，293T細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下進(jìn)行磷酸鈣轉(zhuǎn)染并不影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果，且轉(zhuǎn)染效率高，熒光強(qiáng)度好，滿足了細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的要求．

A：貼壁細(xì)胞；B：懸浮細(xì)胞A: adherent cells; B suspended cells圖2　兩種細(xì)胞狀態(tài)下磷酸鈣-DNA復(fù)合物顆粒形成狀況Fig.2　The distribution of calcium phosphate-DNA complex in two status of cells

A:貼壁轉(zhuǎn)染組；B懸浮轉(zhuǎn)染組A: Cell transfection in adherent status; B: Cell transfection in suspended status圖3　兩種細(xì)胞狀態(tài)下的細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染流式檢測(cè)Fig.3　Flow cytometry of cell transient transfection in two status

A：對(duì)照組明場(chǎng)圖；B：對(duì)照組熒光圖；C：貼壁轉(zhuǎn)染組明場(chǎng)圖；D：貼壁轉(zhuǎn)染組熒光圖；E：懸浮轉(zhuǎn)染組明場(chǎng)圖；F：懸浮轉(zhuǎn)染組熒光圖A: Bright filed image of the control group; B: Fluorescence image of the control group; C: Bright filed image of the adherent transfection group; D: Fluorescence image of the adherent transfection group; E: Bright filed image of the suspended transfection group; F: Fluorescence image of the suspended transfection group圖4　瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞熒光成像Fig.4　Fluorescence image after 48 h of transient transfection

2.3貼壁和懸浮狀態(tài)下的病毒包裝及病毒感染效果比較

以磷酸鈣為轉(zhuǎn)染試劑，在貼壁和懸浮狀態(tài)下進(jìn)行三質(zhì)粒系統(tǒng)的病毒包裝，每組進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn).轉(zhuǎn)染48 h后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行流式分析(如圖5)和計(jì)數(shù)．流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，貼壁和懸浮狀態(tài)下轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為94.6%±1.7%和96.5%±2.1%．通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)得到對(duì)照組、貼壁轉(zhuǎn)染組和懸浮轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞數(shù)分別為(5.65±0.21)×106/mL,(3.55±0.07)×106/mL和(3.60±0.14)×106/mL，貼壁轉(zhuǎn)染組和懸浮轉(zhuǎn)染組細(xì)胞數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P>0.05，沒(méi)有顯著性差異．同時(shí)，收集病毒上清感染293T細(xì)胞，每組進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn).感染48 h后，細(xì)胞感染效率分別為50.9%±1.3%和48.1%±1.6%(如圖6)，對(duì)照組、貼壁包裝感染組和懸浮包裝感染組細(xì)胞數(shù)分別為(3.98±0.04)×106/mL,(4.00±0.07)×106/mL和(3.99±0.08)×106/mL.三組細(xì)胞數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P>0.05，沒(méi)有顯著性差異．每組進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn).通過(guò)熒光成像檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，貼壁包裝感染組和懸浮包裝感染組細(xì)胞陽(yáng)性率均較高，熒光強(qiáng)度較高(如圖7，彩圖見(jiàn)封三)．通過(guò)流式分析發(fā)現(xiàn)，貼壁包裝感染組和懸浮包裝感染組細(xì)胞熒光強(qiáng)度為(1.77±0.37)×105和(2.04±0.30)×105，兩組細(xì)胞熒光強(qiáng)度經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P>0.05，沒(méi)有顯著性差異．根據(jù)以上結(jié)果，轉(zhuǎn)染48 h后，貼壁和懸浮狀態(tài)下進(jìn)行病毒包裝的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均達(dá)到90%以上，且沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；貼壁包裝和懸浮包裝得到的病毒感染效率均較高，細(xì)胞陽(yáng)性率可達(dá)50%，且沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異．因此，293T細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下進(jìn)行病毒包裝得到的病毒和貼壁狀態(tài)包裝得到的病毒感染效果一致．

A:貼壁轉(zhuǎn)染組；B懸浮轉(zhuǎn)染組A: Cell transfection in adherent status; B: Cell transfection in suspended status圖5　兩種細(xì)胞狀態(tài)下的病毒包裝流式檢測(cè)Fig.5　Flow cytometry of virus packaging in two status

A：貼壁狀態(tài)下包裝得到的病毒液感染效率；B：懸浮狀態(tài)下包裝得到的病毒液感染效率A: Infection efficiency of viruses obtained in adherent status; B: Infection efficiency of viruses obtained in suspended status圖6　兩種細(xì)胞狀態(tài)下包裝得到的病毒液感染293T細(xì)胞48 h后的流式檢測(cè)Fig.6　Flow cytometry of 293T cells infected by viruses obtained in different status after 48 h

A：對(duì)照組熒光圖；B：貼壁包裝病毒感染熒光圖；C：懸浮包裝病毒感染熒光圖A: Fluorescence image of the control group; B: Fluorescence image of the infection of virus packaged in adherent status; C: Fluorescence image of the infection of virus packaged in suspended status圖7　病毒感染48 h后的細(xì)胞熒光成像Fig.7　Fluorescence image after 48 h of virus infection

3討論

磷酸鈣共沉淀法是Graham等[11]于1973年建立的，利用細(xì)胞的內(nèi)吞作用將磷酸鈣-DNA復(fù)合物攝入細(xì)胞[12-13]，雖然磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞也有一定毒性[14]，但其毒性較弱，因此該法常作為常規(guī)方法用于多種細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染，且轉(zhuǎn)染效率高，可獲得短暫或長(zhǎng)期表達(dá)．細(xì)胞的磷酸鈣轉(zhuǎn)染是一項(xiàng)相對(duì)復(fù)雜的過(guò)程，且中間操作環(huán)節(jié)不能有效控制，所以很容易導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率時(shí)高時(shí)低．在轉(zhuǎn)染過(guò)程中，如果能有效掌握操作的關(guān)鍵點(diǎn)，比如溶液的pH值、顆粒的大小、質(zhì)粒DNA的用量、培養(yǎng)基中的細(xì)胞數(shù)目等，將會(huì)極大地提高細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率[15]．由于傳統(tǒng)磷酸鈣轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞過(guò)程較為復(fù)雜，操作不當(dāng)很容易使轉(zhuǎn)染效率降低．因此，本實(shí)驗(yàn)將磷酸鈣轉(zhuǎn)染過(guò)程進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化與改進(jìn)，將貼壁細(xì)胞處理成懸浮狀態(tài)，分別從細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞增殖和熒光強(qiáng)度等方面評(píng)估細(xì)胞在貼壁和懸浮狀態(tài)下的轉(zhuǎn)染效果，對(duì)比發(fā)現(xiàn)在兩種狀態(tài)下細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果沒(méi)有明顯差別，且轉(zhuǎn)染效率高、熒光強(qiáng)度好，懸浮狀態(tài)轉(zhuǎn)染完全可以滿足實(shí)驗(yàn)需要．所以，在磷酸鈣轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞過(guò)程中，可以在細(xì)胞傳代鋪板的同時(shí)，直接在細(xì)胞懸浮狀態(tài)下進(jìn)行轉(zhuǎn)染，這樣能有效縮短實(shí)驗(yàn)周期，操作也更為簡(jiǎn)便，且有利于進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)．

參考文獻(xiàn)：

[1]RECILLAS-TARGA F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals[J]. Mol Biotechnol, 2006,34(3):337-354.

[2]POTTER H, HELLER R. Transfection by electroporation[M]. Neuroscience: Wiley Online Library, 2011.

[3]ROSEN J N, SWEENEY M F, MABLY J D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function[J]. J Vis Exp, 2009(25):1115.

[4]CHEN C, OKAYAMA H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA[J]. Mol Cell Biol, 1987,7(8):2745-2752.

[5]GIGER E V, CASTAQNER B, RAIKKONEN J,etal. SiRNA transfection with calcium phosphate nanoparticles stabilized with PEGylated chelators[J]. Ad Healthc Mater, 2013,2(1):134-144.

[6]JORDAN M. Transient gene expression in mammalian cells based on the calcium phosphate transfection method[J]. Cell Eng, 2000,2:56-79.

[7]JORDAN M, WURM F. Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate[J]. Methods, 2004,33(2):136-143.

[8]SONG W, LAHIRI D K. Efficient transfection of DNA by mixing cells in suspension with calcium phosphate [J]. Nucleic Acids Res, 1995,23(17):3609-3611.

[9]GIRARD P, JORDAN M, TSAO M,etal. Small-scale bioreactor system for process development and optimization[J]. Biochem Eng J, 2001,7(2):117-119.

[10]DEMAISON C, PARSLEY K, BROUNS G,etal. High-level transduction and gene expression in hematopoietic repopulating cells using a human immunodeficiency[correction of immunodeficiency] virus type1 based lentiviral vector containing an internal spleen focus forming virus promoter[J]. Hum Gene Ther, 2002,13(7):803-813.

[11]GRAHAM F L, VAN DER EB A J. Transformation of rat cells by DNA of human adenovirus 5[J].Virology, 1973,54(2):536-539.

[12]ALAM J, COOK J L. Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription[J]. Anal Biochem, 1990,188(2):245-254.

[13]CHEN C A, OKAYAMA H. Calcium phosphate-mediated gene transfer: a highly of ficient transfection system for stably transforming cells with plasmid DNA[J]. Biotechniques, 1988,6(7):632-38.

[14]FENG L, GUO M, ZHANG S,etal. Optimization of transfection mediated by calcium phosphate for plasmid rAAV-LacZ (recombinant adeno-associated virus-beta-galactosidase reporter gene)production in suspension-cultured HEK-293 (human embryonic kidney 293) cells[J]. Biotechnol Appl Biochem, 2007,46(Pt2):127-135.

[15]JORDAN M, KOHNE C, WURM F M. Calcium-phosphate mediated DNA transfer into HEK-293 cells in suspension: control of physicochemical parameters allows transfection in stirred media.Transfection and protein expression in mammalian cells[J]. Cytotechnology, 1998,26(1):39-47.

(編輯WJ)

中圖分類號(hào)Q813.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)1000-2537(2016)01-0018-06

*通訊作者,E-mail：qinghua_zhang@shbiochip.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81272325)；上海市浦江人才計(jì)劃資助項(xiàng)目(12PJ1433700)

收稿日期：2015-04-28

DOI:10.7612/j.issn.1000-2537.2016.01.004