益氣化瘀方對子宮復(fù)舊不全大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

付水冰，曾晶，談?wù)滂?湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 4008；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 40007

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益氣化瘀方對子宮復(fù)舊不全大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

付水冰1，曾晶2，談?wù)滂?
1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

摘要：目的觀察益氣化瘀方對子宮復(fù)舊不全大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制。方法40只分娩后SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、新生化組和益氣低、高劑量組。除空白組外，分娩后，將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌進(jìn)行子宮內(nèi)接種制備大鼠炎癥產(chǎn)后子宮復(fù)舊不全模型，并于造模后第1－7日分別給予相應(yīng)藥物灌胃。HE染色觀察各組大鼠子宮切片病理變化；免疫組化檢測子宮內(nèi)膜組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果模型組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯低于空白組（P＜0.01），Bax蛋白表達(dá)明顯高于空白組（P＜0.01）；益氣低、高劑量組和新生化組Bcl-2蛋白表達(dá)較模型組均明顯升高（P＜0.01），Bax蛋白表達(dá)均明顯降低（P＜0.01）；益氣低劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)較新生化組明顯降低（P＜0.01），Bax蛋白表達(dá)較新生化組明顯升高（P＜0.01）。結(jié)論益氣化瘀方可能通過上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，降低子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的發(fā)生，促進(jìn)子宮內(nèi)膜增生修復(fù)，從而促進(jìn)產(chǎn)后子宮復(fù)舊。

關(guān)鍵詞：益氣化瘀方；子宮內(nèi)膜復(fù)舊不全；細(xì)胞凋亡；Bcl-2蛋白；Bax蛋白；大鼠

近年來，由于人工流產(chǎn)、剖宮產(chǎn)、引產(chǎn)率的上升，隨之發(fā)生的慢性子宮內(nèi)膜炎升高，子宮復(fù)舊不全的發(fā)生率上升，導(dǎo)致產(chǎn)后大出血或者晚期產(chǎn)后出血時有發(fā)生，給產(chǎn)婦造成巨大身體和心理創(chuàng)傷。細(xì)胞凋亡是機(jī)體一種清除受損、老化異常細(xì)胞的生理過程，存在于生命生長發(fā)育的各個時期，包括子宮內(nèi)膜的周期性變化。子宮內(nèi)膜能否維持周期性變化和功能穩(wěn)定的關(guān)鍵原因在于細(xì)胞凋亡的調(diào)控。子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡使子宮內(nèi)膜發(fā)生周期性的脫落，從而維持子宮內(nèi)膜的生理作用。益氣化瘀方是湖南中醫(yī)藥大學(xué)尤昭玲教授治療產(chǎn)后復(fù)舊不良的經(jīng)驗方。前期實驗表明，益氣化瘀方能降低產(chǎn)后血清中一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）水平，抑制子宮螺旋動脈異常舒張，促進(jìn)子宮內(nèi)膜的重建與修復(fù)[1]。本實驗通過觀察益氣化瘀方對產(chǎn)后子宮復(fù)舊不全大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Bax表達(dá)的影響，探討其是否通過干預(yù)細(xì)胞調(diào)亡促進(jìn)產(chǎn)后子宮復(fù)舊。

1　實驗材料

1.1動物

SPF級3月齡SD大鼠70只，其中雌鼠50只、雄鼠20只，體質(zhì)量180～220 g，湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（湘）2011-0003，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物實驗室。

1.2藥物

益氣化瘀方由黨參15 g、黃芪15 g、蒲黃10 g、鹿銜草10 g、馬鞭草10 g、茜草10g、烏藥10 g、狗脊10 g、續(xù)斷10 g、甘草6 g等組成，飲片均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，浸膏濃度為4.43 g原藥材/g，批號20120328，滅菌后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。新生化顆粒，云南白藥集團(tuán)股份有限公司，批號ZLB1304，臨床用量36 g/d。

1.3主要試劑與儀器

大腸桿菌ATCC25922（湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心），HE染色液、飽和苦味酸（南京建成生物試劑有限公司），Bax、Bcl-2免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)公司），4%多聚甲醛（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司），10%水合氯醛（天津市科密歐化統(tǒng)一制劑）。YJ-450型超凈工作臺（蘇州進(jìn)化設(shè)備有限公司），MDF-U5411型超低溫冰箱（三洋公司），LEICADMLB2型雙目顯微鏡（德國LEICA公司）。

2　實驗方法

2.1造模、分組與給藥

分娩后SD大鼠40只，按體質(zhì)量由高到低進(jìn)行分層，選取隨機(jī)數(shù)字表中任意一行數(shù)字進(jìn)行分組，隨機(jī)分為空白組、模型組、新生化組和益氣低、高劑量組，每組8只。參考文獻(xiàn)[2]方法，造模大鼠進(jìn)行子宮內(nèi)接種大腸桿菌（稀釋成1.0×107個/mL），子宮接種量為0.2 mL。造模后第2日隨機(jī)處死1只雌鼠，行子宮切片提示子宮復(fù)舊不良，子宮黏膜充血、出血，雌激素水平低，并有大量炎性細(xì)胞浸潤，表明造模成功。益氣低、高劑量組分別于造模后第1日開始，每日灌胃相應(yīng)劑量益氣化瘀方水煎液，相當(dāng)于成人等效劑量的1、2倍，灌胃體積為8 mL/（kg?d）；新生化組給予5.4 g/kg新生化顆粒灌胃；模型組和空白組給予等量蒸餾水灌胃。每日1次，連續(xù)7 d。

2.2病理學(xué)觀察

HE染色鏡下觀察其病理變化。主要步驟：取材，固定后石蠟包埋，4 μm切片，脫蠟（二甲苯2×5 min）；乙醇水化至水洗；蘇木素浸染5 min，蒸餾水洗片刻；分化液（鹽酸乙醇）5～30 s，蒸餾水沖洗1 min；伊紅染色30 s，蒸餾水沖洗30 s；乙醇脫水；二甲苯透明2×2 min；中性樹脂封片，避免產(chǎn)生氣泡。

2.3免疫組化檢測子宮內(nèi)膜組織Bcl-2、Bax表達(dá)

末次灌胃2 h采血后脫頸處死大鼠。將取出的子宮組織切片，經(jīng)二甲苯2×10 min，依次經(jīng)梯度乙醇后入水；pH 7.4 PBS沖洗3次；新配制甲醇和H202阻斷內(nèi)源性過氧化酶，室溫孵育10 min，PBS洗滌3次；0.01 mol/L枸櫞酸修復(fù)液煮沸，停止加熱，再用蒸餾水沖洗缸子，加速冷卻至室溫約15 min，PBS洗滌3次；加入適合比例的一抗（兔抗鼠Bax、Bcl-2），置于4 ℃冰箱過夜；滴加生物素化二抗，恒溫箱內(nèi)孵育約30 min，PBS沖洗3次；使用前配制DAB溶液，30 min內(nèi)使用；滴加DAB顯色液，鏡下控制反應(yīng)至背景顯色5 min；蒸餾水充分沖洗；蘇木精淺染后，蒸餾水沖洗干凈；各級梯度乙醇分別脫水5 min；二甲苯中透明中性樹脂封片，防止氣泡發(fā)生。光鏡觀察并拍照。以已知的Bcl-2陽性圖片作陽性對照。細(xì)胞核棕黃色為陽性反應(yīng)細(xì)胞。免疫組化染色隨機(jī)觀察5個不重疊視野，應(yīng)用醫(yī)學(xué)數(shù)碼圖像儀分析計算Bcl-2、Bax灰度值，取平均值作為大鼠的檢測值。

3　統(tǒng)計學(xué)方法

4　結(jié)果

4.1子宮內(nèi)膜組織HE染色結(jié)果

空白組大鼠子宮內(nèi)膜偶有連續(xù)性部分間斷，上皮細(xì)胞輕度脫落，腺體數(shù)目少；模型組與空白組比較，子宮內(nèi)膜連續(xù)性部分中斷，且子宮內(nèi)膜部分小血管擴(kuò)張、充血，上皮細(xì)胞壞死脫落，大量炎性細(xì)胞浸潤，間質(zhì)疏松水腫；新生化組和益氣高劑量組子宮內(nèi)膜連續(xù)性好，未見中斷，無明顯上皮損傷，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤，腺體數(shù)目多，未見血管擴(kuò)張、充血，間質(zhì)致密，宮腔中無明顯滲血、滲液；益氣低劑量組子宮內(nèi)膜可見少量連續(xù)性中斷，內(nèi)膜上皮損傷較輕，間質(zhì)較致密，炎細(xì)胞少。結(jié)果見圖1。

4.2益氣化瘀方對大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下降、Bax蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，益氣低、高劑量組及新生化組Bcl-2蛋白表達(dá)升高、Bax蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）；與新生化組比較，益氣低劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)降低、Bax蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），益氣高劑量組Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見圖2、圖3、表1。

圖1　各組大鼠子宮內(nèi)膜組織病理圖（HE染色，×400）

圖2　各組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖3　各組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)（免疫組化染色，×400）

表1　各組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較（±s，灰度值）

表1　各組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較（±s，灰度值）

注：與空白組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，★★P＜0.01；與新生化組比較，##P＜0.01

組別　　只數(shù)　　　Bcl-2　　　Bax空白組　8　123.04±1.24　151.86±0.89模型組　7　162.36±1.52▲▲　103.25±1.58▲▲新生化組　8　122.33±2.33★★　153.04±1.55★★益氣低劑量組　8　133.76±1.55★★##　142.20±1.35★★##益氣高劑量組　8　123.01±1.78★★　151.99±1.33★★

5　討論

程序化細(xì)胞死亡也被稱為細(xì)胞凋亡，指細(xì)胞通過凋亡信號刺激時，啟動細(xì)胞內(nèi)死亡機(jī)制，通過一系列信號傳播，最后演變?yōu)楦叨扔行虻募?xì)胞死亡。在正常生理過程，細(xì)胞凋亡維持著動態(tài)平衡。若細(xì)胞凋亡動態(tài)平衡失去控制，導(dǎo)致細(xì)胞過度增生或凋亡，可引起子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢癌等[3]。Bcl-2和Bax蛋白分別是Bcl-2基因家族中最有代表性的凋亡抑制因子和凋亡促進(jìn)因子，且Bax還參與調(diào)控Bcl-2的活性。近年來研究表明，子宮內(nèi)膜存在細(xì)胞凋亡并受凋亡調(diào)節(jié)因子的調(diào)控[4]。子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡和增生保持動態(tài)平衡，使子宮內(nèi)膜保持周期性變化，從而維持子宮內(nèi)膜的生理作用。子宮內(nèi)膜的周期性生長和重建與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Bax蛋白主要誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制內(nèi)膜過度增生；Bcl-2蛋白則抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，內(nèi)膜修復(fù)增生[5-6]。

根據(jù)其臨床表現(xiàn)，產(chǎn)后子宮復(fù)舊不全可其歸于中醫(yī)“產(chǎn)后惡露不絕”范疇，又稱“惡露不止”。唐代孫思邈《備急千金要方》曰：“婦人產(chǎn)后，五臟皆羸弱?！彼未愖悦鳌秼D人大全良方》云：“產(chǎn)后臟腑勞傷，氣血虛損……致惡露不下?！鼻宕惣儹t《胎產(chǎn)心法》有言：“產(chǎn)時耗傷氣血經(jīng)絡(luò)，氣虛不能收斂，或者瘀血不去，新血難歸經(jīng)，相并而下，日久難以止住?！碑a(chǎn)后惡露淋漓不絕與氣虛無力攝血或瘀血內(nèi)阻等有關(guān)，產(chǎn)后氣虛攝血無力可致惡露不絕，瘀血內(nèi)阻、血不歸經(jīng)也可使惡露不絕。其病機(jī)為瘀血阻滯胞宮、沖任，不能歸經(jīng)，離經(jīng)之血致惡露不絕。對于產(chǎn)后疾病的原因，歷代醫(yī)家大多著眼于產(chǎn)后氣血虧虛、瘀血內(nèi)阻這一內(nèi)因。

益氣化瘀方以益氣化瘀、扶正祛邪為法，功專益氣攝血、化瘀止痛，虛實標(biāo)本兼治，且化瘀不耗氣、止血不留瘀，是治療產(chǎn)后惡露不盡、陰道不規(guī)則流血、小腹疼痛的良方。黨參和蒲黃為方中君藥。黨參味甘，補(bǔ)益脾肺、生津；蒲黃味甘微辛、味平，活血化瘀、止血；黃芪、馬鞭草、茜草共為臣藥。黃芪味甘、性微溫，補(bǔ)氣升陽、益衛(wèi)固表；馬鞭草味苦、性涼，活血化瘀；茜草味苦、性寒，涼血止血、祛瘀通經(jīng)。鹿銜草、烏藥、狗脊、續(xù)斷同為佐藥。鹿銜草味甘、苦，性溫，祛風(fēng)除濕、補(bǔ)腎強(qiáng)骨、止血；烏藥味辛、性溫，順氣止痛、溫腎散寒；狗脊味甘、苦，性溫，補(bǔ)肝腎、強(qiáng)腰膝、止血；續(xù)斷味苦、甘、辛，性微溫、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、止血。甘草為使藥，味甘、性平，補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、解痙止痛，調(diào)和方中諸藥。諸藥合用，扶正祛邪、益氣化瘀，使補(bǔ)益不礙邪，化瘀不傷正，從而促進(jìn)惡露盡快排出，并且補(bǔ)益氣血，促進(jìn)產(chǎn)后恢復(fù)。

本實驗免疫組化結(jié)果顯示，益氣化瘀方可降低產(chǎn)后子宮復(fù)舊不良大鼠子宮內(nèi)膜損傷程度，修復(fù)子宮內(nèi)膜，促進(jìn)產(chǎn)后子宮復(fù)舊。此作用可能通過上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，降低子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的發(fā)生而實現(xiàn)的。

參考文獻(xiàn)：

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（修回日期：2015-06-07；編輯：華強(qiáng)）

Effects of Yiqi Huayu Decoction on Endometrial Cell Apoptosis Gap-associated Protein inRat Models of Incomplete Puerperal Involution of Uterus

FU Shui-bing1, ZENG Jing2, TAN Zhen-yu2(1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China; 2. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China)

Abstract:Objective To investigate the effects of Yiqi Huayu Decoction on cell apoptosis and Bcl-2, Bax expressions of incomplete puerperal involution of uterus; To discuss its mechanism of action. Methods Forty SD rats were randomly divided into normal group, model group, Xinshenghua group, high- and lower-dose Yiqi groups. The first day after delivery, except for the normal group, rats received intrauterine inoculation with overnight cultured diluted E. coli to establish rat models with incomplete puerperal involution of uterus. They were given corresponding medicine for gavage during day 1-7 after the modeling. Pathological changes in rat uterus slice were observed by HE staining in each group; immunohistochemical detection was used to detect protein expressions of Bcl-2 and Bax in endometrial tissue. Results The protein expression of Bcl-2 in the model group was lower than that in the normal group (P<0.01), and protein expression of Bax in the model group was higher than that in the normal group (P<0.01). The protein expression of Bcl-2 in the high- and lower-dose Yiqi groups and Xinshenghua group was higher than that in the model group (P<0.01), and protein expression of Bax in the high- and lower-dose Yiqi groups and Xinshenghua group was lower than that in the model group (P<0.01). The protein expression of Bcl-2 in the lower-dose Yiqi group was lower than that in Xinshenghua group (P<0.01), and protein expression of Bax in the lower-dose Yiqi group was higher than that in Xinshenghua group (P<0.01). Conclusion Yiqi Huayu Decoction can promote the repair of endometrial hyperplasia and postpartum uterine involution through up-regulating Bcl-2 protein expression and down-regulating Bax protein expression, and reducing the incidence of endometrial cell apoptosis.

Key words:Yiqi Huayu Decoction; incomplete puerperal involution of uterus; apoptosis; Bcl-2; Bax; rats

收稿日期：（2015-05-13）

通訊作者：曾晶，E-mail：841825639@qq.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年基金(81202848)；湖南省自然科學(xué)基金（14JJ3121）

中圖分類號：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1005-5304(2016)02-0059-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.017