硫酸鹽還原菌去除鉛的實(shí)驗(yàn)研究*

宋霄敏貢俊白紅娟李榮偉

（1．中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院　太原030051；2．山西財(cái)經(jīng)大學(xué)環(huán)境經(jīng)濟(jì)系　太原030006）

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硫酸鹽還原菌去除鉛的實(shí)驗(yàn)研究*

宋霄敏1貢俊2白紅娟1李榮偉1

（1．中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院太原030051；2．山西財(cái)經(jīng)大學(xué)環(huán)境經(jīng)濟(jì)系太原030006）

摘要考查了初始pH值、反應(yīng)溫度、接種量等對(duì)硫酸鹽還原菌菌株的生長(zhǎng)和對(duì)重金屬鉛去除效果的影響，應(yīng)用X射線衍射（XRD）、表面能量色譜分析（EDS）對(duì)沉淀物進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，該菌株生長(zhǎng)及去除鉛的最佳條件為：pH＝8．0，溫度30℃，接種量10%，該條件下的去除率高達(dá)99．79%。所得到的沉淀物為硫化鉛，立方方鉛礦結(jié)構(gòu)，結(jié)晶度良好。進(jìn)一步研究了最佳條件下不同初始濃度硝酸鉛對(duì)硫酸鹽還原菌細(xì)胞中亞硫酸鹽還原酶（SiR）和腺苷酰硫酸還原酶（APS）比活力的影響。結(jié)果表明，硝酸鉛質(zhì)量濃度低于950 mg／L時(shí)，亞硫酸鹽還原酶和APS還原酶比活力受到輕微抑制，當(dāng)硝酸鉛質(zhì)量濃度為1 100 mg／L時(shí)，其比活力受到明顯的抑制。重金屬鉛對(duì)亞硫酸鹽還原酶比活力抑制作用相對(duì)明顯。

關(guān)鍵詞硫酸鹽還原菌Pb2＋去除亞硫酸鹽還原酶腺苷酰硫酸還原酶硫化鉛

Experimental Studies on the Removal of Lead by Sulfate－reducing Bacteria

SONG Xiaomin1GONG Jun2BAI Hongjuan1LI Rongwei1
（1．College of Chemical＆Environment Engineering，North University of China Taiyuan 030051）

Abstract The influences of the initial pH value，reaction temperature，inoculum amount on the growth and the removal ef-fect on lead of Sulfate－reducing bacteria strain were investigated．Moreover，the precipitates were characterized by means of XRD and EDS．The experimental results indicated that the optimum conditions for the growth of stain and the removal rate for lead ion were：pH＝8．0，temperature at 30℃，inoculation amount of 10%，reaching 99．79%．The precipitates was lead sulfide，with a good degree of crystallinity．Under the optimal removal condition，the reason why different initial con-centrations of Pb2＋have different effects on the specific activities of sulfite reductase and APS reductase in Sulfate－reducing bacteria strain were studied．the results showed that：when concentration of lead nitrate was less than 950 mg／L，the specif-ic activity of sulfite reductase and APS reductase were slightly restrained，While the specific activity was significantly re-strained by 1 100 mg／L of lead nitrate．the inhibitory effect of lead on the specific activity of sulfite reductase was relatively obvious．

Key Words sulfate－reducing bacteria lead removal sulfite reductase APS reductase lead sulfide

0　引言

重金屬通過食物鏈的方式進(jìn)入人體，會(huì)損傷人體機(jī)能，導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。因此，對(duì)含重金屬?gòu)U水的治理應(yīng)該引起高度重視。國(guó)內(nèi)外對(duì)含重金屬?gòu)U水的處理方法主要有吸附法、化學(xué)沉淀法、離子交換法、膜分離法、電化學(xué)法和光催化法等［1］。這些方法的處理效率高、工藝相對(duì)較成熟，但由于化學(xué)藥品的大量使用，大多造成二次污染，且運(yùn)行成本相對(duì)較高。近年來，生物法因其成本低、處理效果好、不會(huì)造成二次污染等優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

硫酸鹽還原菌（SRB）是一類厭氧型微生物，在其生命代謝活動(dòng)中，利用有機(jī)物作為碳源和電子供體，通過異化作用將硫酸鹽還原成硫化物，產(chǎn)生高濃度的H2S［2］。水中的重金屬離子和H2S結(jié)合后生成金屬硫化物沉淀，從而將水中的重金屬除去，而且微生物表面所帶負(fù)電荷吸附重金屬，可以將水中較難沉淀的金屬硫化物有效去除，確保重金屬?gòu)U水達(dá)標(biāo)排放［1］。

本文深入研究了硫酸鹽還原菌菌株的最佳生長(zhǎng)條件，及其對(duì)鉛離子的最佳去除條件，考察在其中起關(guān)鍵作用的亞硫酸鹽還原酶和APS還原酶比活力，并對(duì)反應(yīng)體系中的沉淀物進(jìn)行了表征。旨在為該菌株應(yīng)用于處理含鉛廢水提供一定的理論基礎(chǔ)，也為重金屬的資源化利用提供參考。

1材料與方法

1．1試驗(yàn)材料

菌種：硫酸鹽還原菌，由山西財(cái)經(jīng)大學(xué)環(huán)境經(jīng)濟(jì)系贈(zèng)予。培養(yǎng)基：硫酸鹽還原菌培養(yǎng)基［3］。馴化培養(yǎng)基：含有一定濃度硝酸鉛的培養(yǎng)基。

1．2試驗(yàn)方法

1．2．1硫酸鹽還原菌去除鉛的測(cè)定

在硝酸鉛初始質(zhì)量濃度為950 mg／L的培養(yǎng)基中接種10%的硫酸鹽還原菌，將反應(yīng)條件分別控制為不同初始pH值、不同反應(yīng)溫度和不同接種量，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)72 h后利用虹吸原理將上層菌液吸出，取菌液離心10 min（轉(zhuǎn)速設(shè)為4 500 r／min），將上清液倒入燒杯中，加入濃HNO3，HClO4，置于電熱爐上蒸至近干，消解完后用水定容，進(jìn)行測(cè)定。用火焰原子吸收法測(cè)定Pb2＋的濃度［4］。將離心后的沉淀用等量蒸餾水懸浮，用紫外－可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)420 nm處測(cè)OD值。

1．2．2表征

上述反應(yīng)完成后，利用虹吸原理將上層菌液吸出，收集黑色沉淀物，所得沉淀物用蒸餾水反復(fù)清洗3～5次，并置于70℃烘箱中干燥，得到黑色固體粉末樣品。將樣品用TD－3500型X射線衍射儀進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定條件為Cu靶Kα，管電壓30 kV，管電流20 mA，掃描范圍20°～80°，掃描速度0．04（°）／s。同時(shí)用能量散射X射線能譜對(duì)樣品進(jìn)行元素分析。

1．2．3亞硫酸鹽還原酶和APS還原酶的測(cè)定

粗酶液的制備：將已培養(yǎng)好的菌液在4℃下以4 500 r／min冷凍離心10 min，棄沉淀，收集上清液即為粗酶液［5］。

亞硫酸鹽還原酶活力測(cè)定采用Ostrowski［6］法進(jìn)行，以每分鐘催化lμmol的NADPH氧化所需酶量為一個(gè)酶活力單位。APS還原酶活力測(cè)定采用高鐵氰化鉀（K3Fe（CN）6）還原法［7］進(jìn)行，以每分鐘催化1 μmol的Na2SO3氧化或每分鐘催化2μmol的高鐵氰化鉀還原所需酶量為一個(gè)酶活力單位。

蛋白測(cè)定采用Bradford方法［8］，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。

2結(jié)果與討論

2．1不同pH值下硫酸鹽還原菌的生長(zhǎng)及鉛離子的去除率

不同初始pH值對(duì)硫酸鹽還原菌的生長(zhǎng)及鉛離子去除的影響如圖1所示。圖1顯示，pH值為7，8，9時(shí)，鉛的去除率均達(dá)到99%以上，pH值為8時(shí)去除率高達(dá)99．79%。pH值為5和6時(shí)，鉛的去除效果差，菌株生長(zhǎng)也受到抑制。pH值會(huì)影響菌株的生理代謝功能，主要體現(xiàn)在：①pH值引起硫酸鹽還原菌細(xì)胞膜內(nèi)電荷變化，從而影響其對(duì)底物的吸收；②pH值影響硫酸鹽還原菌代謝過程中各種酶的穩(wěn)定性和活性；③改變細(xì)胞內(nèi)的pH值，影響ATP合成和許多生化反應(yīng)的進(jìn)行［9］。對(duì)比不同pH值，硫酸鹽還原菌在中性偏堿環(huán)境中生長(zhǎng)力強(qiáng)，去除鉛的效果最好，過酸、過堿環(huán)境均會(huì)抑制菌株的生長(zhǎng)，從而影響對(duì)鉛離子的去除效果。

圖1不同pH值下硫酸鹽還原菌生長(zhǎng)及鉛離子的去除率

2．2不同溫度下硫酸鹽還原菌的生長(zhǎng)及鉛離子的去除率

圖2為不同反應(yīng)溫度下硫酸鹽還原菌生長(zhǎng)及鉛離子的去除率。圖2顯示，溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)和鉛離子去除率有明顯影響。溫度為15℃時(shí)，菌體的生長(zhǎng)受到明顯抑制，鉛離子去除率僅為86．53%。其原因是：①大多數(shù)硫酸鹽還原菌是中溫菌，最適宜生長(zhǎng)溫度在30℃左右，溫度過低，抑制其生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而影響對(duì)鉛離子的去除效果。②反應(yīng)體系中的溫度會(huì)影響整個(gè)體系的能量，溫度低，分子攜帶的能量低，分子運(yùn)動(dòng)減緩，分子之間碰撞幾率小，影響反應(yīng)的發(fā)生［10］。當(dāng)溫度為30℃時(shí)，菌株的生物量和去除率最大，因此最佳溫度為30℃。

圖2不同溫度下硫酸鹽還原菌生長(zhǎng)及鉛離子的去除率

2．3不同接種量下硫酸鹽還原菌的生長(zhǎng)及鉛離子的去除率

為考察接種量對(duì)硫酸鹽還原菌的生長(zhǎng)及鉛離子去除率的影響，在Pb（NO3）2質(zhì)量濃度為950 mg／L、pH值為7、溫度為30℃、接種量分別為5%，10%，20%條件下培養(yǎng)72 h后，分別測(cè)定了鉛離子含量和OD值，結(jié)果見圖3。

圖3不同接種量下硫酸鹽還原菌生長(zhǎng)及鉛離子的去除率

由圖3可以看出，隨著硫酸鹽還原菌的接種量由5%增加至20%，鉛離子的去除率也逐漸增加，接種量為5%時(shí)，由于菌體的數(shù)量相對(duì)較少，使得鉛離子的去除較差，為85．43%；當(dāng)接種量大于10%時(shí)，鉛離子的去除率保持在90%以上。由于接種量10%和20%時(shí)的去除率相差甚微，故將10%確定為最佳接種量。

2．4沉淀物表征

圖4為沉淀物的XRD圖。從圖中可以看出，樣品在2θ值分別為26．05°，30．2°，43．15°，51°，53．7°，62．85°，69．05°，70．9°處有強(qiáng)的衍射峰，與標(biāo)準(zhǔn)PbS （PDF，05－0592）（111），（200），（220），（311），（222），（400），（331），（420）晶面符合得很好，晶格常數(shù)為5．931 5A°，屬立方方鉛礦結(jié)構(gòu)。譜圖中所有衍射峰出峰明顯，說明沉淀物硫化鉛具有很好的結(jié)晶度；譜圖中沒有出現(xiàn)其他雜質(zhì)峰，說明沉淀物硫化鉛具有較高的純度。

采用能量散射X射線能譜（EDS）對(duì)沉淀物進(jìn)行分析，結(jié)果表明制備的樣品只含有Pb和S兩種元素，其物質(zhì)的量比基本為1∶1，接近硫化鉛的理想摩爾比。

圖4沉淀物的XRD圖

2．5不同濃度鉛對(duì)APS還原酶活力的影響

APS還原酶是硫酸鹽還原途徑中的關(guān)鍵酶之一，是硫酸鹽還原菌還原代謝反應(yīng)體系中第一個(gè)還原反應(yīng)的酶，具有催化硫酸鹽還原成亞硫酸鹽的作用［7］。表1顯示了不同初始濃度Pb（NO3）2對(duì)APS還原酶活力的影響。在Pb（NO3）2的初始質(zhì)量濃度為300，500，700，950 mg／L時(shí)，其比活力相對(duì)于對(duì)照組降低了4．7%，4．8%，6．2%，7．8%。隨著硝酸鉛濃度的增加，比活力呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1 100 mg／L時(shí)，比活力下降了19．5%。可能的原因有：①鉛離子帶正電荷，酶蛋白的負(fù)離子帶負(fù)電荷，二者相結(jié)合生成沉淀，使酶變性失活；②鉛離子與酶的－SS－，－COOH，－OH等功能基團(tuán)配位形成共價(jià)鍵，改變酶活性中心的構(gòu)象以及結(jié)構(gòu)，抑制酶與底物之間的結(jié)合，使酶失去作用［11］。因此，培養(yǎng)基中鉛離子含量越高，APS還原酶所受到的破壞、抑制作用就越顯著，其比活力也會(huì)明顯下降。

表1不同濃度鉛對(duì)APS 還原酶活力的影響

2．6不同濃度鉛對(duì)亞硫酸鹽還原酶活力的影響

亞硫酸鹽還原酶（SiR）可以將APS還原酶催化還原成的亞硫酸鹽再次催化還原為硫化物，因而它是硫酸鹽還原菌代謝過程中的關(guān)鍵酶［7］。不同初始濃度Pb（NO3）2對(duì)亞硫酸鹽還原酶活力的影響如表2所示。由表2可以看出，隨著Pb（NO3）2初始濃度的增加，比活力逐漸降低。當(dāng)Pb（NO3）2初始質(zhì)量濃度低于950 mg／L時(shí)，其比活力相對(duì)對(duì)照組降低的范圍為5%～20%。而當(dāng)Pb（NO3）2初始質(zhì)量濃度為1 100 mg／L時(shí)，其比活力降低至54．293 U／mg?？梢姼邼舛鹊你U離子對(duì)亞硫酸鹽還原酶的抑制作用很明顯。

表2不同濃度鉛對(duì)亞硫酸鹽還原酶活力的影響

3　結(jié)論

（1）硫酸鹽還原菌的生長(zhǎng)和對(duì)鉛離子的最佳去除條件為：pH＝8．0，溫度30℃，接種量10%。

（2）硫酸鹽還原菌去除Pb2＋的沉淀物是純硫化鉛，沒有雜質(zhì)，且具有很好的結(jié)晶度。

（3）隨著Pb（NO3）2初始濃度增加，APS還原酶和亞硫酸鹽還原酶的比活力逐漸降低。Pb（NO3）2初始質(zhì)量濃度低于950 mg／L時(shí)，APS還原酶比活力相對(duì)對(duì)照組降低了4%～8%，亞硫酸鹽還原酶比活力相對(duì)對(duì)照組降低了5%～20%，兩種酶均受到輕微抑制，而Pb（NO3）2初始質(zhì)量濃度為1 100 mg／L時(shí)，比活力明顯下降。鉛離子對(duì)亞硫酸鹽還原酶的抑制作用相對(duì)明顯。

參考文獻(xiàn)

［1］高原．硫酸鹽還原菌及其在重金屬?gòu)U水治理中的應(yīng)用［J］．科技信息，2009（1）：437－438．

［2］胡德蓉，林欽．硫酸鹽還原茵（SRB）的生態(tài)特性及其檢測(cè)方法研究進(jìn)展［J］．南方水產(chǎn)，2007，3（3）：68－72．

［3］貢俊，張肇銘，白紅娟，等．脫硫腸狀菌合成納米硫化鉛［J］．中國(guó)科學(xué)E輯：科學(xué)技術(shù)，2008，38（3）：455－459．

［4］國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》編委會(huì)．水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法［M］．第4版．北京：中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社，2006．

［5］劉曉華，萬海清．亞硫酸鹽還原酶的分離純化和酶學(xué)性質(zhì)的研究［J］．釀酒科技，2006（6）：28－31．

［6］Jacek Ostrowski，Jer－Yuarn Wu，David C Rueger，et al．Char-acterization of the cysJIH regions of salmonella typhimurium and escherichia coli B［J］．The Journal of Biological Chemistry，1989，264（26）：15726－15737．

［7］常磊峰．硫酸鹽還原分離菌APS還原酶和亞硫酸還原酶的純化及性質(zhì)研究［D］．內(nèi)蒙古：內(nèi)蒙古師范大學(xué)，2008．

［8］陳鈞輝，陶力，李俊，等．生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］．第6版．北京：科學(xué)出版社，2006．

［9］梁慧鋒．生物吸附法處理重金屬?gòu)U水的研究［J］．科技創(chuàng)業(yè)月刊（服務(wù)科學(xué)），2010（49）：121－122．

［10］胡文鋒，劉小陽，張明，等．液乳桿菌L3生物合成納米氧化鋅的工藝研究［J］．現(xiàn)代食品科技，2013，29（9）：2192－2198．

［11］馬春花，胡寒橋．硫酸鹽還原菌處理含重金屬?gòu)U水的實(shí)驗(yàn)研究［J］．科技創(chuàng)新導(dǎo)報(bào)，2010（20）：4－6．

收稿日期：（2014－12－23）

作者簡(jiǎn)介宋霄敏，女，碩士研究生，研究方向：環(huán)境生物技術(shù)。

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（31200049），山西省自然科學(xué)基金（2012011009—1），中北大學(xué)?；?。