深刺加電針對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨的影響①

付妮妮，李學(xué)智，劉菲，席小芳，任毅，楊曉光，張愉

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深刺加電針對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨的影響①

付妮妮1，李學(xué)智1，劉菲1，席小芳1，任毅2，楊曉光1，張愉2

[摘要]目的觀察深刺加電針對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織的影響。方法新西蘭兔40只隨機(jī)分為正常組(A組)10只、造模組30只，后者以Hulth-Telhag法復(fù)制兔左膝骨關(guān)節(jié)炎模型，X線評(píng)價(jià)造模情況。造模成功后隨機(jī)分為模型組(B組, n=10)、深刺加電針組(C組, n=10)和普通電針組(D組, n=10)，造模后第6周開始對(duì)C組和D組進(jìn)行治療，共4周。治療結(jié)束后檢測(cè)關(guān)節(jié)液pH值，透射電鏡下觀察軟骨細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)和病理學(xué)改變，檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)，Western blotting檢測(cè)軟骨組織中酸離子敏感通道1(ASIC1)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)的磷酸化水平和p53蛋白表達(dá)，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)軟骨組織中ASIC1分布。結(jié)果關(guān)節(jié)液中pH值從高到低依次為A組=C組>D組>B組(P<0.01)；A組、C組、D組膝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)較B組完整，C組凋亡率低于B組和D 組(P<0.01)，與A組無顯著性差異(P>0.05)；軟骨組織中ASIC1和p53表達(dá)由低到高均為A組=C組

[關(guān)鍵詞]膝骨關(guān)節(jié)炎；電針；深刺；凋亡；酸離子敏感通道1；p38絲裂原活化蛋白激酶；p53；兔

作者單位：1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶市400016；2.漢中市中心醫(yī)院，陜西漢中市723000。作者簡(jiǎn)介：付妮妮(1990-)，女，山西長(zhǎng)治市人，碩士研究生，主要研究方向：針灸治療與中樞神經(jīng)生物基礎(chǔ)。通訊作者：李學(xué)智，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師。E-mail: lixz999@126. com。

[本文著錄格式]付妮妮，李學(xué)智，劉菲，等.深刺加電針對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐, 2016, 22(1): 38-45.

CITED AS: Fu NN, Li XZ, Liu F, et al. Effects of deep electroacupuncture on cartilage in knee osteoarthritis rabbits [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2016, 22(1): 38-45.

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種以炎癥和關(guān)節(jié)疼痛為主要癥狀的慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)疾病，多發(fā)于膝關(guān)節(jié)，以軟骨變性和丟失以及關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨質(zhì)增生為特征，在老年人群中最為常見[1]。2010年，我國有關(guān)該疾病發(fā)布的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，60周歲以上人群中，患有該病的患者多達(dá)0.78億[2]。該病的最終致殘率為53%，是導(dǎo)致殘疾的主要原因之一[3]，且在我國多數(shù)地區(qū)均有發(fā)病[4-6]。

針灸治療該病臨床療效明確、便捷、經(jīng)濟(jì)、無毒副作用[7]。軟骨細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)降解是軟骨退變的主要誘因。目前研究表明，針刺主要通過抑制凋亡因子的表達(dá)減少軟骨細(xì)胞凋亡[8]。

本研究觀察深刺加電針法對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎的療效，包括形態(tài)學(xué)、軟骨細(xì)胞凋亡情況、酸離子敏感通道1(acid-sensing ion channel 1, ASIC1)的表達(dá)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases, p38MAPK)的磷酸化水平和凋亡因子p53表達(dá)，探討深刺加電針法治療骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康3月齡新西蘭大白兔40只，雌雄不拘，體質(zhì)量(2.1±0.3) kg，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證SYXK(渝)2012-0001，質(zhì)量合格證0002541。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的“關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見”的要求。

將新西蘭兔編號(hào)1～40，在隨機(jī)數(shù)表，任意指定20 行20列，從左到右依次讀取40個(gè)兩位的隨機(jī)數(shù)字，按隨機(jī)數(shù)的大小順序排列，如果隨機(jī)數(shù)相同，按先后順序，先出現(xiàn)的為小。序號(hào)為1～10對(duì)應(yīng)正常組(A 組)，11～40對(duì)應(yīng)造模組。

1.2主要試劑及儀器設(shè)備

Anti-ASIC1、Anti-p38MAPK磷酸化、Anti-p53：北京博奧森生物科技有限公司。二抗：北京康為生物試劑公司。多聚甲醛：天津市福晨化學(xué)試劑廠。注射用青霉素鈉：西南藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H50020196。常規(guī)手術(shù)器械：上海手術(shù)器械廠。H-7500透射電鏡：HITACH。pH電子測(cè)量筆：美國優(yōu)特公司。電子天平、雙蒸水儀器、離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。電泳儀、石蠟切片機(jī)：LEICA。BX51TF光學(xué)生物顯微鏡：OLYMPUS。Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)：BIO-RAO。DR3000數(shù)字放射成像系統(tǒng)：柯達(dá)公司。

1.3模型建立

造模組采用Hulth-Telhag法[9]復(fù)制兔膝關(guān)節(jié)炎模型。3%戊巴比妥鈉1 ml/kg耳緣靜脈注射麻醉，仰臥于手術(shù)臺(tái)上固定。左側(cè)膝關(guān)節(jié)備皮，常規(guī)消毒，鋪無菌巾，取關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)長(zhǎng)2～3 cm縱切口，切斷并剔除內(nèi)側(cè)副韌帶組織0.5 cm。組織剪平行于關(guān)節(jié)間隙進(jìn)入關(guān)節(jié)腔，探查關(guān)節(jié)腔內(nèi)無原發(fā)病變后切斷前后交叉韌帶；組織剪平行進(jìn)入半月板和平臺(tái)間隙，完整切除內(nèi)側(cè)半月板，注意勿傷及關(guān)節(jié)軟骨面。行抽屜實(shí)驗(yàn)陽性后，沖洗消毒關(guān)節(jié)腔。逐層縫合，無菌敷料包扎切口處，不予固定。

術(shù)后分籠飼養(yǎng)，肌注青霉素4×104U，每天1次，共7 d。每天驅(qū)趕新西蘭兔活動(dòng)1 h，連續(xù)6周。

A組不予任何處理。

6周對(duì)造模組左右后肢行X線檢測(cè)。滿足以下標(biāo)準(zhǔn)表明造模成功：關(guān)節(jié)間隙狹窄、骨贅形成、軟骨下骨改變、膝關(guān)節(jié)對(duì)線不良。所有造模兔均造模成功(圖1)。X線檢測(cè)在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放射科進(jìn)行。檢測(cè)參數(shù)：照射電壓60 kV，照射電流250 mA，照射量32 mAs，照射時(shí)間128 ms。

1.4分組及治療

將造模成功的30只兔根據(jù)體重平均分為3組，每個(gè)區(qū)組編號(hào)1～3，再將每個(gè)區(qū)組中的實(shí)驗(yàn)兔編號(hào)1～ 10，然后從隨機(jī)數(shù)表中任意選取一開始點(diǎn)，從左到右依次讀取30個(gè)1位隨機(jī)數(shù)字，按區(qū)組順序和區(qū)組中實(shí)驗(yàn)兔順序賦給每只實(shí)驗(yàn)兔，最終分為B組、C組、D組，每組10只。

C組動(dòng)物四肢捆綁仰臥位固定行針刺。取內(nèi)外膝眼、足三里、梁丘、血海、陰陵泉。內(nèi)外膝眼用1.0寸毫針，向關(guān)節(jié)腔內(nèi)斜刺進(jìn)針0.8～1.0寸，針刺抵骨后停止進(jìn)針；足三里穴較普通電針法更靠近脛骨邊緣，貼骨進(jìn)針，提插捻轉(zhuǎn)1 min；梁丘與血海穴用1.5寸毫針斜刺進(jìn)針，直刺至股骨，針尖穿過股骨骨膜，透刺血海。

D組同法針刺，取穴相同。各穴均用0.5寸針灸針，提插捻轉(zhuǎn)，針刺深度不抵骨、不貼骨。

C組和D組均以電針儀通電留針20 min，一組電極連接內(nèi)外膝眼，另一組電極連接同側(cè)足三里和陰陵泉，疏密波，頻率1.6～2 Hz，強(qiáng)度以保持針柄輕度震顫為度(電流強(qiáng)度1～3 mA，電壓4～6 V)。

A組和B組同法抓取捆綁動(dòng)物。

各組均每周治療5 d，休息2 d，共4周。

圖1　兔膝關(guān)節(jié)X線正側(cè)位片

1.5檢測(cè)方法

1.5.1pH測(cè)定

用5 ml一次性注射器抽取關(guān)節(jié)液，20℃下用pH值電子測(cè)量筆(精確到0.1)測(cè)量關(guān)節(jié)液pH值。

1.5.2透射電鏡檢測(cè)

各組運(yùn)動(dòng)治療后，3%戊巴比妥鈉1 ml/kg麻醉，解剖左后肢膝關(guān)節(jié)，切取脛骨平臺(tái)關(guān)節(jié)面半月板和軟骨，分為2份，一份立即放入液氮保存，一份取部分組織切成3塊1×1×1 mm立方體，迅速置于2.5%戊二醛保存，其余組織置于4%多聚甲醛固定。置于2.5%戊二醛的標(biāo)本送重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院電鏡室切片，鉛鈾雙重染色，于透射電鏡下觀察。

1.5.3HE及TUNEL染色

置于4%多聚甲醛的標(biāo)本固定72 h，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，厚5 μm，行HE染色和TUNEL染色。光鏡下觀察。

TUNEL染色后，凋亡軟骨細(xì)胞呈棕黃色顆粒，正常軟骨細(xì)胞呈藍(lán)色顆粒。選取5個(gè)凋亡細(xì)胞數(shù)最多的高倍視野(400×)，計(jì)算500個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占的百分比(凋亡指數(shù))。

1.5.4Western blotting

取液氮保存的軟骨約40 mg，PBS緩沖液冰水浴勻漿，加RIPA蛋白裂解液，4℃1200 r/min離心10 min，取上清液，BCA蛋白定量法檢測(cè)蛋白濃度。取蛋白樣品50μg上樣；行SDS-PAGE凝膠電泳：5%濃縮膠恒壓100 V，約20 min；10%分離膠恒壓120 V，約90 min。轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上；5%脫脂牛奶室溫?fù)u動(dòng)封閉4 h，分別滴加ASIC1、p38MAPK、p53一抗(1∶1000)，4℃孵育過夜，37℃復(fù)溫30 min；滴加HRP標(biāo)記的二抗(1∶1000)，37℃孵育1 h。凝膠成像系統(tǒng)成像，以GAPDH為內(nèi)參，以Quantity One 4.6圖像分析軟件進(jìn)行相對(duì)灰度分析。

1.5.5免疫組化染色

取置4%多聚甲醛的標(biāo)本固定24 h后，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，厚5 μm。常規(guī)脫蠟1.5～2 h，枸櫞酸緩沖液修復(fù)抗原，加入3% H2O2，正常山羊血清封閉，滴加ASIC1一抗(1∶50)，生物素化二抗工作液，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗做陰性對(duì)照。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。檢測(cè)數(shù)據(jù)均以(±s)表示。經(jīng)方差齊性和正態(tài)性檢驗(yàn)服從正態(tài)分布，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。顯著性水平α=0.01。

2　結(jié)果

2.1pH

C組、D組pH明顯高于B組(P<0.01)；C組明顯高于D組(P<0.01)；C組與A組無顯著性差異(P= 0.11)。見表1。

2.2透射電鏡

A組細(xì)胞呈卵圓形，胞質(zhì)內(nèi)有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體、線粒體，胞漿內(nèi)微絲豐富，環(huán)繞細(xì)胞核；細(xì)胞核完整類圓形，居細(xì)胞中央；未見細(xì)胞器水腫裂解及細(xì)胞核裂解，軟骨陷窩清晰(圖2)。B組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，網(wǎng)膜溶解斷裂，線粒體腫脹，胞漿內(nèi)可見空洞；細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，核內(nèi)異染質(zhì)較多(圖2)。C組軟骨細(xì)胞略萎縮，胞漿核完整，表面有許多微小突起，線粒體散在分布，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻(圖2)。D組軟骨細(xì)胞萎縮，胞核有溶解趨勢(shì)，線粒體腫脹不

明顯，線粒體分布相對(duì)均勻(圖2)。

圖2　各組膝關(guān)節(jié)軟骨軟骨細(xì)胞觀察

2.3HE染色

A組膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞排列均勻整齊，無增生，軟骨細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核居中，胞質(zhì)均勻(圖3)；B組軟骨細(xì)胞排列紊亂，粗糙不平，胞質(zhì)中空泡明顯，細(xì)胞核被壓縮(圖3)；C組和D組軟骨細(xì)胞排列較整齊，胞質(zhì)無明顯異?？张?，胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核居中(圖3)。

2.4TUNEL染色

各組凋亡指數(shù)由低到高依次為A組=C組

2.5Western Blotting

A組、C組和D組p38MAPK、ASIC1、p53表達(dá)均明顯低于B組(P<0.01)，C組明顯低于D組(P< 0.01)；C組ASIC1(P=0.018)和p53(P=0.031)與A組無顯著性差異；C組p38MAPK明顯高于A組(P<0.01)。見表1。

2.6免疫組化染色

C組、D組ASIC1散在陽性表達(dá)，著色較淺，明顯低于B組(P<0.01)；C組明顯低于D組(P<0.01)；C組與A組無顯著性差異(P=0.746)。見圖5、表1。

圖3　各組軟骨組織HE染色(200×)

圖4　各組軟骨組織TUNEL染色(40×)

圖5　各組軟骨組織ASIC1免疫組化染色(400×)

表1　各組測(cè)量參數(shù)比較

3　討論

OA是以關(guān)節(jié)軟骨退行性改變、繼發(fā)性骨質(zhì)增生、關(guān)節(jié)間隙狹窄、滑膜炎癥增生為主要病理特征，以膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、功能障礙為主要表現(xiàn)的常見疾病，是力學(xué)和生物學(xué)因素共同作用下，軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和軟骨下骨三者降解和合成偶聯(lián)失衡的結(jié)果。胞外酸度是關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)代謝重要的調(diào)節(jié)劑，胞內(nèi)酸中毒的直接作用可能是抑制基質(zhì)合成代謝或者升高一些酶的活性[10]。

1980年，Krishtal等在神經(jīng)元中首次發(fā)現(xiàn)酸誘導(dǎo)產(chǎn)生的膜電流，即ASICs，被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物最重要的酸感受器；其中ASIC1可在軟骨細(xì)胞中表達(dá)，且對(duì)調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)降解進(jìn)，而影響細(xì)胞凋亡具有重要意義[11]。ASIC1對(duì)酸敏感度居中，表達(dá)量較高，占軟骨細(xì)胞中所有酸敏感離子通道的64%[12]。ASIC1屬于Ca2+滲透性酸離子敏感通道，胞外酸化激活A(yù)SIC1開放，可介導(dǎo)胞外Ca2+內(nèi)流[13-14]。

p38MAPK是一種分布于胞質(zhì)中，具有絲氨酸和酪氨酸雙重磷酸化能力的蛋白激酶，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是細(xì)胞外信號(hào)引起細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的通道之一，可被多種刺激因子激活，參與細(xì)胞的形成、生長(zhǎng)、分化、凋亡等多種生理過程[15]。持續(xù)升高的胞質(zhì)內(nèi)Ca2+可以通過MAPKKK-MAPKK-MAPK通路激活p38MAPK，導(dǎo)致p38MAPK磷酸化[16]；之后將信號(hào)傳至細(xì)胞核內(nèi)，介導(dǎo)相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。最近報(bào)道，p38MAPK可以誘導(dǎo)凋亡因子p53活化，軟骨細(xì)胞凋亡[17-19]。

正常情況下，關(guān)節(jié)液的pH為(8.5±0.3)[20]；關(guān)節(jié)炎狀態(tài)下，由于軟骨細(xì)胞無氧酵解以及周圍組織細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，軟骨微環(huán)境酸化，局部pH降低[21-22]，影響關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的代謝[23]。

綜上所述，軟骨組織酸化可引起軟骨細(xì)胞表達(dá)ASIC1，介導(dǎo)胞外Ca2 +內(nèi)流；持續(xù)升高的Ca2 +導(dǎo)致p38MAPK磷酸化，最終誘導(dǎo)凋亡因子p53表達(dá)，引起軟骨細(xì)胞凋亡。這可能是導(dǎo)致OA發(fā)生或加重的重要誘因。

OA屬中醫(yī)學(xué)“痹癥”“骨痹”范疇，病機(jī)為筋骨衰疲、肝腎虧虛、經(jīng)絡(luò)氣血痹阻，治療以補(bǔ)益肝腎、祛風(fēng)散寒、活血化瘀、溫經(jīng)通絡(luò)為法。

短刺法是治療OA的重要手段。短為接近之意，深刺至骨，上下摩骨，可使硬化腫脹的筋膜軟化，重新建立有效的血液循環(huán)，達(dá)到疏通經(jīng)絡(luò)、活血消腫止痛的目的，具有扶正祛邪、調(diào)和陰陽的作用。該法治療骨關(guān)節(jié)炎副作用小，臨床有效[24-26]。本研究根據(jù)近部選穴原則選取內(nèi)外膝眼，針體可以直接進(jìn)入關(guān)節(jié)腔，作用于軟骨表面。足三里為足陽明胃經(jīng)合穴，主治虛勞諸證、下肢痿痹；梁丘為胃經(jīng)郄穴，主治怯寒癥、膝痛、浮腫等。血海、陰陵泉為脾太陰經(jīng)穴，陰陵泉為該經(jīng)合穴，主治肌痹、膝痛；血海具有活血化瘀，養(yǎng)血和血的功效，可治療膝關(guān)節(jié)疼痛。

本研究采用Hulth-Telhag法復(fù)制新西蘭兔KOA模型，運(yùn)用深刺加電針法，緩慢進(jìn)針，搖動(dòng)針身使針深刺至骨，在骨旁或骨縫間作提插捻轉(zhuǎn)、搖動(dòng)等“摩骨”手法。相比常規(guī)電針，能明顯升高關(guān)節(jié)液pH，減少ASIC1和p53表達(dá)，p38MAPK磷酸化水平降低，達(dá)到降低軟骨細(xì)胞凋亡，修復(fù)損傷軟骨組織的作用。與湯劍斌等觀察電針治療OA軟骨大體形態(tài)學(xué)變化一致[27]。這可能是深刺加電針法治療OA的機(jī)制之一。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Zamli Z, Robson Brown K, Tarlton JF, et al. Subchondral bone plate thickening precedes chondrocyte apoptosis and cartilage degradation in spontaneous animal models of osteoarthritis [J]. Biomed Res Int, 2014, 2014: 606870.

[2]劉源,王偉,李沛.針灸治療膝骨性關(guān)節(jié)炎概況[J].中醫(yī)學(xué)報(bào), 2011, 26(2): 236-238.

[3]李寧華.中老年人群骨關(guān)節(jié)炎的流行病學(xué)特征[J].中國臨床康復(fù), 2005, 9(38): 402-405.

[4]向珍蛹,茅建春,徐先國,等.膝骨關(guān)節(jié)炎中醫(yī)證型分布的流行病學(xué)研究[J].上海中醫(yī)藥雜志, 2012, 46(12): 5-8.

[5]張思恒,董曉梅,葉云鳳,等.廣州地區(qū)15歲及以上人群骨關(guān)節(jié)炎流行病學(xué)特征及危險(xiǎn)因素分析[J].中華疾病控制雜志, 2015, 19(1): 9-12.

[6]李玉飛.湖南省中老年膝骨關(guān)節(jié)炎的流行病學(xué)調(diào)查研究[D].長(zhǎng)沙:中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院, 2014.

[7]何天峰.火針配合毫針對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎患者生活質(zhì)量的影響[J].上海針灸雜志, 2014, 33(12): 1156-1159.

[8]陳后煌.電針調(diào)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞功能的機(jī)制探討[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎, 2015, 4(6): 37-41.

[9] Hulth A, Lindberg L, Telhag H. Experimental osteoarthritis in rabbits. Preliminary report [J]. Acta Orthop Scand, 1970, 41 (5): 522-530.

[10] Pignatarog, Simon RP, Xiong ZG. Prolonged activation of ASIC1a and the time window for neuroprotection incerrbral ischaemia [J].Brain,2007,130(Pt1): 151-158.

[11]張晨晨.酸敏感離子通道1a在酸誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬中的作用及其機(jī)制研究[D].合肥:安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 2013.

[12]郭英俊,毛海婷,聶林,等. ASICs的胞內(nèi)分布及其功能調(diào)節(jié)機(jī)制的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2014, 16(47): 3177-3180.

[13] Herrera Y, Katnik C, Rodriquez JD, et al. Sigma-1 receptor modulation of acid- sensing ion channel 1a (ASIC1a) and ASIC1a-induced Ca2+influx in rat cortical neurons [J]. J Pharmacol Exp Ther, 2008, 327(2): 491-502.

[14] Rohner E, Detert J, Kolar P, et al. Induced apoptosis of chondrocytes by Porphyromonasgingivalis as a possible pathway for cartilage loss in rheumatoid arthritis [J]. Calcif Tissue Int, 2010, 87(4): 333-340.

[15]王紅林,王治倫,吳勁,等. p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與NO誘導(dǎo)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡[J].中國地方病防治雜志, 2006, 21 (6): 332-335.

[16]張禮菊,胡偉,唐杰,等. ASIC1a對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝及MAPK信號(hào)通路表達(dá)的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào), 2014, 30(8): 1165-1170.

[17]王紅麗,胡永亮,胡美茹,等. IKKα通過激活p38K介導(dǎo)紫外線誘導(dǎo)的p53活化反應(yīng)[J].軍事醫(yī)學(xué), 2015, 39(5): 321-324.

[18]張志宇,許珂,王靜,等. p53在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中的表達(dá)及與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬的關(guān)系研究[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新, 2014, 11 (15): 1-3.

[19]榮超.酸敏感離子通道在酸誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡中的作用及其線粒體途徑機(jī)制研究[D].合肥:安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 2012.

[20]肖穎,張思容,唐志宏,等.膝關(guān)節(jié)液pH值與痛風(fēng)結(jié)晶的形成[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2011, 15(26): 4857-4859.

[21] Wu MH, Urban JP, Cui ZF, et al. Effect of extracellular phonmatrix synthesis by chondrocytes in 3D agarosegel [J]. Biotechnol Prog, 2007, 23(2): 430-434.

[22] Verma RP, Hansch C. Matrix metalloproteinases (MMPs): chemical- biological functions and (Q)SARs [J]. Bioorg Med Chem, 2007, 15(6): 2223-2268.

[23] Razaq S, Wilkins RJ, Urban JP. The effect of extracellular pH on matrix turnover by cells of the bovine nucleus pulposus [J]. Eur Spine J, 2003, 12(4): 341-349.

[24]伏秀霞.短刺溫針灸配合刺絡(luò)拔罐治療膝骨關(guān)節(jié)炎療效觀察[J].上海針灸雜志, 2011, 30(8): 564-565.

[25]熊國平.短刺配合溫針灸治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎30例[J].中國針灸, 2011, 31(6): 551-552.

[26]史中亞,胡奮強(qiáng),陳勇.短刺配合功能訓(xùn)練治療膝骨關(guān)節(jié)炎療效觀察[J].上海針灸雜志, 2012, 31(11): 826-828.

[27]湯劍斌,圣小平,樊天佑.電針治療對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的影響[J].中醫(yī)正骨, 2012, 24(4): 12-15.

Effects of Deep Electroacupuncture on Cartilage in Knee Osteoarthritis Rabbits

FU Ni-ni1, LI Xue-zhi1, LIU Fei1, XI Xiao-fang1, REN Yi2, YANG Xiao-guang1, ZHANG Yu2
1. College of Traditionl Chinese Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China; 2. Central Hospital of Hanzhong, Hanzhong, Shaanxi 723000, China
Correspondence to LI Xue-zhi. E-mail: lixz999@126.com

Abstract:Objective To observe the effects of deep electroacupuncture on carlilage tissue in knee osteoarthritis (KOA) rabbits. Methods 40 New Zealand rabbits were randomly divided into normalgroup (A, n=10) and modelgroup (n=30). The modelgroup was modeled KOA with Hulth-Telhag way, and identified with X-ray. Then they were divided into no-treatedgroup (B, n=10), deep electroacupuncturegroup (C, n=10) and routine electroacupuncturegroup (D, n=10) randomly. Thegroups C and D accepted electroacupuncture since 6 weeks after modeling, for 4 weeks. They were measured with pH of joint fluid, observed structure and pathology of cartilage under transmission electron microscope, detected apoptosis index, and determined the expression of acid-sensing ion channel 1 (ASIC1), p38 mitogen-activated protein kinases (p38MAPK) and p53 with Western blotting, and distribution of ASIC1 with immunohistochemistry in cartilage tissue. Results The pHs of joint fluid from high to low were ranged as thegroups A=C>D>B (P<0.01). The cartilage structure was more complete in thegroups A, C and D than in thegroup B. The apoptosis rates from less to more were ranged as thegroups A=C

Key words:knee osteoarthritis; electroacupuncture; deep acupuncture; apoptosis; acid-sensing ion channel 1; p38 mitogen-activated protein kinases; p53; rabbits

(收稿日期：2015-09-17修回日期：2015-11-09)

[中圖分類號(hào)]R684.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1006-9771(2016)01-0038-08

基金項(xiàng)目：重慶市衛(wèi)生和計(jì)生委中醫(yī)藥科技項(xiàng)目(No.ZY201402117)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2016.01.008