微波技術(shù)應(yīng)用于非水相酶學(xué)催化的研究進(jìn)展

姜麗艷， 董洪舉， 杜映達(dá)， 張愛軍， 張　艷， 高　貴， 閆國棟

(吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春　130012)

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·綜合評述·

通信聯(lián)系人：閆國棟，高級工程師，E-mail:shmily@jlu.edu.cn

微波技術(shù)應(yīng)用于非水相酶學(xué)催化的研究進(jìn)展

姜麗艷， 董洪舉， 杜映達(dá)， 張愛軍， 張艷， 高貴， 閆國棟*

(吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春130012)

摘要：綜述了近年來微波輻射在非水相酶學(xué)催化方面的應(yīng)用，重點介紹了微波輻射對非水相酶催化反應(yīng)動力學(xué)、反應(yīng)產(chǎn)率、選擇性及酶學(xué)性質(zhì)的影響。參考文獻(xiàn)43篇。

關(guān)鍵詞：微波輻射； 非水相反應(yīng)； 酶催化； 應(yīng)用； 綜述

微波輻射技術(shù)是一種新型綠色的化學(xué)方法，最早被農(nóng)業(yè)食品部門引入生物等領(lǐng)域[1]。隨后，在1986年Gedye等[2]首次在有機化學(xué)反應(yīng)領(lǐng)域使用了微波技術(shù)，開啟了微波與化學(xué)合成作用的研究，并且發(fā)現(xiàn)微波可以有效提高化學(xué)反應(yīng)速度。2002年，Bradoo[3]利用微波輔助技術(shù)建立了快速篩選脂肪酶選擇性特征的方法，有效地將反應(yīng)速度提高了7~12倍。隨著研究的深入，F(xiàn)avretto等[4]將微波輻射技術(shù)和非水相酶學(xué)催化方法相結(jié)合，偶然發(fā)現(xiàn)微波技術(shù)不僅可以提高非水相反應(yīng)的反應(yīng)速率，而且增強了酶的穩(wěn)定性和選擇性。繼此令人興奮的科學(xué)發(fā)現(xiàn)后，微波輻射技術(shù)和酶催化方法作為生物合成領(lǐng)域中的兩大催化手段已獲得廣泛關(guān)注。

微波是介于紅外輻射光波和無線電波間的一種電磁波譜，頻率為300 MHz~300 GHz，波長1 m~1 mm，具有吸收、反射和穿透三個基本性質(zhì)[5]。酶是一種高效催化劑，具有催化速率快、位置選擇性高和反應(yīng)條件溫和等特點。酶在非水介質(zhì)中能催化在水中不能進(jìn)行的反應(yīng)，增加了水不溶性底物酶促催化轉(zhuǎn)化的范圍。報道顯示將微波輻射和非水相酶催化偶聯(lián)使用能改善酶活性中心和底物的誘導(dǎo)和契合作用，提高反應(yīng)體系的反應(yīng)速度、增強酶催化的專一性[6]。目前，研究人員們致力于該方面的研究，并越來越多地關(guān)注微波對非水相酶催化反應(yīng)動力學(xué)和酶特性的影響。

本文綜述了近年來關(guān)于微波技術(shù)偶聯(lián)非水相酶催化方面的研究進(jìn)展，探討了微波技術(shù)在非水相酶催化領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價值。重點介紹了微波輻射對非水相酶催化反應(yīng)動力學(xué)、反應(yīng)產(chǎn)率、選擇性及酶學(xué)性質(zhì)的影響。

1微波效應(yīng)

目前用于微波反應(yīng)研究的主要是頻率為2.45 GHz，波長為12.2 cm的民用微波[7]。微波對化學(xué)反應(yīng)的影響主要有“致熱效應(yīng)”與“非熱效應(yīng)”[8]。

致熱效應(yīng)主要是利用微波的輻射特性對物質(zhì)和反應(yīng)進(jìn)行加熱，是微波對酶催化反應(yīng)加熱的理論基礎(chǔ)。其原理是當(dāng)生物樣品如水、蛋白質(zhì)及脂肪等極性物質(zhì)在微波高頻電磁場的作用下，反復(fù)快速的改變?nèi)∠驈亩l(fā)生快速的轉(zhuǎn)動，通過分子間摩擦和碰撞將動能和微波能轉(zhuǎn)化為熱能，快速提高反應(yīng)體系溫度[9]。與常規(guī)加熱相比，微波加熱具有傳導(dǎo)和極化兩種機制，致使微波加熱具有其獨特的性質(zhì)。微波加熱屬于內(nèi)源性加熱，不需要傳導(dǎo)和對流，介質(zhì)內(nèi)、外部同時被加熱，所以微波加熱可以將能量直接傳至反應(yīng)物的官能團(tuán)部位，具有快速加熱，且全面、均勻的特點[10]。另外，微波可以選擇性加熱物質(zhì)，物質(zhì)的介電常數(shù)愈大，對微波的吸收作用越強。如水等極性介質(zhì)，對微波有很強的吸收能力，也能被快速均勻的加熱；對于各種氣體等非極性介質(zhì)，微波對其沒有加熱作用[11]。

非熱效應(yīng)主要是由微波的化學(xué)效應(yīng)和電磁效應(yīng)引發(fā)的致熱效應(yīng)以外的效應(yīng)，即指當(dāng)微波輻射具有提高反應(yīng)速度、改變立體選擇性、減少副反應(yīng)等無法單純用致熱效應(yīng)解釋的其它效應(yīng)[12]。目前，非熱效應(yīng)的機理尚未研究清楚，但推測反應(yīng)機理主要是微波電場對分子的極化作用，使分子自身原有的電子排列狀態(tài)發(fā)生微小變化；另外，微波可能引起分子的震動導(dǎo)致化學(xué)鍵的斷裂，或因微波的選擇性加熱使物質(zhì)的活性增加[13]。

2微波加熱對非水相酶促反應(yīng)的影響

2.1　微波加熱對非水相酶促反應(yīng)初速度的影響

經(jīng)過近十年的研究，微波技術(shù)在非水相酶催化反應(yīng)中的作用已經(jīng)被認(rèn)同，且得到了廣泛的應(yīng)用。微波輻射能夠改善酶的“微環(huán)境”，增強酶的活性中心和底物的誘導(dǎo)作用，有效提高非水介質(zhì)中酶促反應(yīng)初速度。2005年，Lin等[14]在有機相中使用固定化脂肪酶435催化合成脂肪酸酯，發(fā)現(xiàn)在微波加熱條件下，反應(yīng)初速度比傳統(tǒng)加熱模式提高了2.63倍。Bradoo等[3]利用不同的脂肪酶進(jìn)行甘油酯的催化水解反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)微波輻射比常規(guī)加熱條件下反應(yīng)初速度提高了7~12倍。2012年，Yadav等[15]利用微波輻射和Novozym 435轉(zhuǎn)酯4,8-二甲基-7-烯-1醇時，反應(yīng)初速度提高了2.3倍。隨著研究的深入，有人提出在微波輔助非水相酶催化反應(yīng)的過程中，反應(yīng)初速度受諸多因素的影響，首先是反應(yīng)體系的水活度。適量的水能使酶活性中心的極性和柔性提高，進(jìn)而加快反應(yīng)速率，但過量的水則會改變酶活性中心的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶活力降低。1996年，Parker等[16]研究了非水相溶劑中丁醇與乙酸乙酯的轉(zhuǎn)酯催化反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水活度(aw)為0.58和0.69時，微波輻射可以使酶的初始反應(yīng)速度提高2~3倍，而當(dāng)aw增加至0.97時，反應(yīng)初速度反而明顯下降，且低于傳統(tǒng)加熱模式。Huang等[17]使用固定化酶催化有機相酯化反應(yīng)，也發(fā)現(xiàn)僅體系的水含量為0.5%~8%(V/V)時，微波照射能夠使酶的初始反應(yīng)速度提高1.5倍。同時，Lin等[14]發(fā)現(xiàn)在使用微波加熱時，反應(yīng)體系的水含量為0.05%~0.5%(V/V)，酶促反應(yīng)的初始速度提高了2.1~4.7倍。另外，在微波加熱時，非水相介質(zhì)的極性也影響著酶促反應(yīng)的初速度。2002年，Goswami等[18]在枯草桿菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的催化反應(yīng)中，分別使用了六種不同的非水相反應(yīng)溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在使用不同的有機溶劑時，微波加熱可以使反應(yīng)初速度提高2.1~4.7倍不等，而且反應(yīng)初速度隨溶劑的LogP值增加而增大(苯為溶劑時除外)。Yadav和Lahi[19]研究了脂肪酶在甲苯中的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，也發(fā)現(xiàn)隨著介質(zhì)疏水性增加，反應(yīng)初速度隨之增加。2007年，江南大學(xué)劉詩雨[20]研究了脂肪酶催化辛酸和丁醇、辛酸和甘油的酯化反應(yīng)體系，發(fā)現(xiàn)正辛烷為溶劑時，微波加熱時的反應(yīng)初速度值比常規(guī)加熱下初速度值高。當(dāng)以直鏈烷烴同系物和芳烴同系物作溶劑時，反應(yīng)初速度與溶劑的碳鏈長度有關(guān)。同時，在微波加熱條件下，微波處理方式也直接影響著非水相酶催化的反應(yīng)初速度。Zhu等[21-22]發(fā)現(xiàn)當(dāng)用微波預(yù)輻射同時結(jié)合堿處理時，反應(yīng)初速度較微波預(yù)輻射和先堿處理再微波預(yù)輻射的處理方式效果明顯。影響非水相酶催化反應(yīng)的因素還包括反應(yīng)溫度、pH值、載體和酶及緩沖液的濃度等。非水相酶催化的反應(yīng)環(huán)境復(fù)雜，每一個影響因素都會對反應(yīng)速度產(chǎn)生直接的影響。分析其原因發(fā)現(xiàn)，酶促反應(yīng)初速度的提高是源于微波輻射使底物的形態(tài)發(fā)生改變使其更易于與酶活性中心結(jié)合[23-24]。

2.2　微波加熱對非水相酶促反應(yīng)產(chǎn)率的影響

微波輻射對非水相酶促反應(yīng)產(chǎn)率的影響主要基于微波功率、微波時間、反應(yīng)體系和酶種類及酶所處的微環(huán)境變化，且反應(yīng)產(chǎn)率的增加和反應(yīng)速度的提高是并存的。適宜的微波輻射功率和時間，能使酶分子活性中心的結(jié)構(gòu)更加“裸露”，更好地與底物結(jié)合。早在1996年，Pujie等[25]在研究微波輔助酶催化反應(yīng)時，發(fā)現(xiàn)在最佳的微波輻射條件下反應(yīng)產(chǎn)率明顯高于常規(guī)加熱模式。隨后，Vacek等[26]利用微波輻射輔助酶選擇性酯化合成脂肪酸酯，產(chǎn)率較常規(guī)加熱增加了1.1～1.9倍。蔡漢成[27]于2004年研究了戊醇的同分異構(gòu)體和辛酸為底物的非水相酶催化酯化反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)微波輻射可以明顯提高反應(yīng)產(chǎn)率。隨著研究的深入，Matos等[28]采用統(tǒng)計學(xué)分析方法研究了微波溫度，微波功率和微波時間對PCL特性的影響，發(fā)現(xiàn)微波溫度是影響PCL特征的關(guān)鍵因素，且使用微波輻射時，產(chǎn)率要明顯高于傳統(tǒng)加熱方式。Yu等[29]在酶促產(chǎn)乳糖的研究中，發(fā)現(xiàn)微波輔助加熱16 h，果糖產(chǎn)率為45%，而當(dāng)用傳統(tǒng)加熱24 h時，果糖產(chǎn)率僅為43%。最近，江蘇科技大學(xué)孫國霞[30]考察了微波輻射效應(yīng)對酶催化蘆丁選擇性水解產(chǎn)異槲皮苷的酶促效率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在最佳的微波輻射和反應(yīng)體系下蘆丁的轉(zhuǎn)化率為89.18%、異槲皮苷產(chǎn)率為84.74%，和傳統(tǒng)加熱模式相比，反應(yīng)效率分別提高了大約120倍。2014年，Shinde等[31]也發(fā)現(xiàn)，在微波輻射下，MCPA的酯化反應(yīng)初速度提高了2倍，產(chǎn)率達(dá)到了83%。大量研究表明，適宜條件的微波輻射作用可以一定程度的增強酶的催化活性，提高有機相中酶促反應(yīng)產(chǎn)率。

2.3　微波加熱對非水相酶促反應(yīng)選擇性的影響

微波輻射作用于蛋白質(zhì)等極性分子，迫使反應(yīng)向生成某一構(gòu)型產(chǎn)物方向進(jìn)行。同時，酶結(jié)構(gòu)中具有催化活性的基團(tuán)分子與底物分子發(fā)生瞬間的作用，經(jīng)過誘導(dǎo)契合作用激活反應(yīng)底物。Carrillo-Munoz等[32]研究了脂肪酶催化1-苯基乙醇的手性拆分，發(fā)現(xiàn)脂肪酶在微波加熱條件下，顯著提高了底物的親和性和選擇性，產(chǎn)物的ee值分別提高了2.6倍和4.9倍。隨后，Lin等[33]利用脂肪酶(PPL)催化1,2,3,4-四氫化-1-萘酚和1-茚滿醇的?；磻?yīng)，發(fā)現(xiàn)在微波輻射下，脂肪酶對應(yīng)選擇性分別提高了3~9倍和7~14倍。Zarevúcka等[34]利用葡萄糖基轉(zhuǎn)移作用酶促合成吡喃葡萄糖苷和半乳葡萄糖苷時，與傳統(tǒng)加熱模式相比，明顯提高了酶催化的區(qū)域選擇性。蔡漢成[27]在微波輻射酶耦合催化效應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)，微波輻射能夠使酶的選擇性提高58.85%，同時指出經(jīng)微波輻射后，酶活性中心的立體結(jié)構(gòu)和相關(guān)底物基團(tuán)的誘導(dǎo)和定向作用增強，使底物分子參與反應(yīng)的基團(tuán)與酶活性中心更加接近，從而提高酶催化的選擇性專一性。另外，也有學(xué)者提出，通過微波輻射，能夠降低反應(yīng)的活化能，進(jìn)而提高酶的專一性和選擇性[3,16,27,35]。

2.4　微波加熱對酶的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和活性的影響

酶幾乎不溶于有機溶劑，在有機溶劑中呈懸浮狀態(tài)，致使酶催化反應(yīng)形成了一個非均相反應(yīng)體系。利用超聲波處理可以減小酶顆粒，提高酶的分散度，有利于形成均相反應(yīng)體系，從而增加酶反應(yīng)速度。微波輻射對酶結(jié)構(gòu)和活性的影響與微波輻射的條件及酶所處的微環(huán)境密切相關(guān)。Procelli等[36]通過研究微波輻射對S-腺苷高半胱氨酸水解酶結(jié)構(gòu)的影響，指出微波輻射的非熱效應(yīng)引起了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重排。隨后，夏詠梅等[37]對比了相同溫度下經(jīng)微波輻射預(yù)處理過的酶液和經(jīng)常規(guī)熱處理的酶液熒光強度變化，發(fā)現(xiàn)酶的蛋白部分經(jīng)微波輻射后更加“裸露”，進(jìn)而引起了酶活的增加。Chen等[38]利用微波輻射處理植物種子子葉中的淀粉酶、轉(zhuǎn)氨酶和蛋白酶，發(fā)現(xiàn)在適宜的微波輻射下，酶的穩(wěn)定性比常規(guī)加熱條件下的酶穩(wěn)定性更高，且當(dāng)?shù)孜锏臉O性較強時，微波輻射則更具優(yōu)勢。但Procelli等[36]卻發(fā)現(xiàn)微波輻射下酶的失活速率較常規(guī)加熱下大；而且Cara等[39]指出微波輻射β-半乳糖苷酶時，酶活僅是常規(guī)加熱下的20%。 Soysal等[40]發(fā)現(xiàn)脂肪酶Novozym 435在有機介質(zhì)中的穩(wěn)定性也會受到微波輻射的影響。所以當(dāng)采用不同的微波輻射溫度、時間和功率時，微波輻射發(fā)揮著正負(fù)不同的催化效應(yīng)。分析原因可能是微波的高頻電場會引起酶蛋白的β-折疊增加，α-螺旋紊亂，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得無序化。適度裸露的酶蛋白分子便于與底物的定向結(jié)合，從而加快反應(yīng)速度，提高反應(yīng)產(chǎn)率和增強酶的選擇性；但酶蛋白的過度裸露會引起酶結(jié)構(gòu)過于松散，破壞酶的立體構(gòu)象，致使酶活性下降，增大競爭性副反應(yīng)的發(fā)生[41-43]。

3結(jié)論

微波輻射作為一種新型、綠色和安全的加熱能源已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于非水相酶催化領(lǐng)域，且在醫(yī)藥、生物化學(xué)和食品工業(yè)等生產(chǎn)、科研領(lǐng)域發(fā)揮了巨大的作用。微波輔助非水相酶催化不僅可以加快化學(xué)反應(yīng)速率，提高化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)率，而且還能改變酶催化反應(yīng)的選擇性和專一性。但是有機溶劑對酶活及酶穩(wěn)定性仍然存在一定的負(fù)面影響，且微波溫度、微波功率和微波時間及反應(yīng)體系等復(fù)雜的條件均會對非水相酶催化引起不同的正負(fù)效應(yīng)。所以微波技術(shù)應(yīng)用于非水相酶催化的研究是一項系統(tǒng)艱巨的工程，還需要引入更先進(jìn)、更精細(xì)的研究手段和方法，積累更多的實驗數(shù)據(jù)和實驗現(xiàn)象，進(jìn)一步建立相應(yīng)的微波輻射影響非水相酶結(jié)構(gòu)及反應(yīng)動力學(xué)模型，從而明確微波輻射影響非水相酶催化的相關(guān)機理和作用機制，為加快工業(yè)化進(jìn)程奠定堅實基礎(chǔ)。

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Research Progress on Application of Microwave Irradiation

in Non-aqueous Enzymatic Catalysis

JIANG Li-yan,DONG Hong-ju,DU Ying-da,

ZHANG Ai-jun,ZHANG Yan,GAO Gui,YAN Guo-dong*

(College of Life Science, Jilin University, Changchun 130012, China)

Abstract：Research progress on application of microwave irradiation in non-aqueous enzymatic catalysis were reviewed with 43 references. The influence of microwave irradiation on enzyme catalytic reaction kinetics, reaction yields, selectivity and enzymology properties in organic solvent were discussed in detail.

Keywords：microwave irradiation; non-aqueous reaction; enzymatic catalysis; application; review

中圖分類號：Q814; O643.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.01.15341

作者簡介：姜麗艷(1983-)，女，漢族，吉林松原人，博士研究生，主要從事酶催化研究。E-mail:jiangliyan@jlu.edu.cn

基金項目：“985工程”學(xué)科及平臺/基地建設(shè)項目

收稿日期：2015-10-08