石油降解復(fù)合菌群構(gòu)建及降解性能研究

邢清朝　王慧　程輝彩　孫紹永

摘 要：為有效降解環(huán)境中的石油污染，在現(xiàn)有可降解石油的菌株中篩選出了高效石油降解菌：赤紅球菌、GP3A、鞘氨醇桿菌以及無(wú)色桿菌，通過(guò)細(xì)菌相互組合構(gòu)建出26個(gè)復(fù)合菌群，其中赤紅球菌、鞘氨醇桿菌以及無(wú)色桿菌三株細(xì)菌組合對(duì)石油降解率最高，達(dá)到70.32%。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)法確定了三株細(xì)菌最優(yōu)比例為，赤紅球菌∶鞘氨醇桿菌∶無(wú)色桿菌=2∶1∶2。該石油降解菌群的最佳培養(yǎng)條件是培養(yǎng)基溫度35 ℃，初始培養(yǎng)pH值7.0，石油濃度為5%，降解率達(dá)到77.12%。

關(guān)鍵詞：石油；石油降解的復(fù)合菌群；降解率

石油泄漏造成環(huán)境污染，石油組分非常復(fù)雜，主要成分是烷烴、苯、甲苯和二甲苯等復(fù)雜芳香烴[1]。單一菌株很難將油污降解完全，因此，篩選石油降解復(fù)合菌群是非常必要的。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)所用菌種蒼白桿菌（Ochrobactrum sp.）、赤紅球菌（Rhodococcus ruber）、不動(dòng)桿菌（Acinetobacter sp.）以及銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）為實(shí)驗(yàn)室篩選。

菌種假單胞菌（Pseudomonas sp.）、鞘氨醇桿菌（Sphingomonas sp.）以及無(wú)色桿菌（Achromobacter sp.）來(lái)源于華南理工大學(xué)生態(tài)修復(fù)實(shí)驗(yàn)室。

供試石油取自唐海冀東油田。

1.1 高效石油降解菌的篩選

在已知可降解石油的細(xì)菌中通過(guò)測(cè)定石油降解菌周降解率，篩選出降解率較高的細(xì)菌作為石油降解菌群構(gòu)建的菌種資源。

1.2 石油降解復(fù)合菌群的構(gòu)建

將篩選出的石油降解菌用排列組合的方法進(jìn)行組合，加入石油降解培養(yǎng)基中測(cè)定復(fù)合菌劑的周降解率。

1.3 高效石油降解復(fù)合菌群降油條件優(yōu)化

利用正交試驗(yàn)分析方法對(duì)石油降解復(fù)合菌群中各個(gè)菌株的配比進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其降解條件優(yōu)化，條件包括培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH值以及原油濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選高效石油降解菌

將活化后的細(xì)菌6（蒼白桿菌）、7（赤紅球菌）、10（不動(dòng)桿菌）、11（銅綠假單胞菌）、12（假單胞菌）、13（GY2B：鞘氨醇桿菌）以及14（GD1A：無(wú)色桿菌）加入到石油培養(yǎng)基中，用紫外分光光度法測(cè)量其周降解率，結(jié)果如圖1所示。

赤紅球菌對(duì)石油有很好的降解作用而且最早起作用。蒼白桿菌、假單胞菌、GP3A、GY2B、GD1A等菌株對(duì)石油有很高的降解性能，但是11菌株-銅綠假單胞菌為致病菌株不予以使用，確定最終蒼白桿菌、赤紅球菌、GP3A、GY2B以及GD1A。

2.2 石油降解復(fù)合菌群的構(gòu)建

將篩選得到的細(xì)菌通過(guò)排列組合的方法進(jìn)行組合編號(hào)如表1，加入石油降解培養(yǎng)基后測(cè)量周降解率。

如圖2結(jié)果表明，組合19石油降解率最高，達(dá)到70.32%，組合菌株包括：赤紅球菌、GY2B和GD1A。

2.3 石油降解復(fù)合菌群降油條件優(yōu)化

2.3.1 正交實(shí)驗(yàn)法選擇復(fù)合菌群的最佳配比 如表2，正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中降解效果最好的菌種配比為赤紅球菌∶GY2B∶CD1A=2∶1∶22.3.2 培養(yǎng)基溫度對(duì)復(fù)合菌群降解石油的影響 對(duì)培養(yǎng)基溫度的研究結(jié)果見(jiàn)圖3，20～25 ℃培養(yǎng)石油降解率在35%～55%；在25～35 ℃培養(yǎng)時(shí)石油降解效率升高，到35 ℃達(dá)到峰值7132%；40 ℃降解效果明顯下降。

培養(yǎng)溫度對(duì)微生物降解原油的影響主要是表現(xiàn)在三個(gè)方面：影響石油烴的物理狀態(tài)、化學(xué)組成和微生物本身的代謝活性[2]。25～30 ℃石油降解率較低，因?yàn)闇囟容^低時(shí)，細(xì)菌活性受到限制，細(xì)菌本身及其代謝產(chǎn)物活性不大，對(duì)石油降解性能不高。30～35 ℃紅球菌對(duì)石油降解效果顯著升高，最大達(dá)到70%以上，說(shuō)明在此溫度范圍內(nèi)，細(xì)菌活性增加，石油狀態(tài)也變得有利于細(xì)菌的分解。40 ℃時(shí)降解率下降可能因?yàn)闇囟瘸^(guò)了細(xì)菌的耐受范圍，導(dǎo)致降解率下降。

2.3.3 培養(yǎng)基初始pH對(duì)復(fù)合菌群降解石油的影響 初始pH對(duì)于微生物生長(zhǎng)代謝有著極其重要的作用，影響微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性以及培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)狀況[3]。如圖4，對(duì)培養(yǎng)基的初始pH研究表明：pH值在5.0～7.0之間菌群的降解效率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在pH為7.0時(shí)降解效果最高達(dá)到77.12%；pH值大于7.0以后降解效果明顯下降。初始pH對(duì)于微生物生長(zhǎng)代謝有著極其重要的作用，影響微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性以及培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)狀況[4]。因此微生物只有在最佳pH值下才能進(jìn)行良好的生長(zhǎng)和代謝。該株赤紅球菌降解石油的最佳pH值為7.0 。

2.3.4 石油濃度對(duì)復(fù)合菌群降解石油的影響 如圖5，石油濃度對(duì)菌株的降解效果影響不如前兩個(gè)指標(biāo)劇烈，但可以看出在隨著石油濃度增大，細(xì)菌的石油降解率呈先上升后下降的趨勢(shì)，在石油濃度為5 g/L時(shí)降解效果最好，達(dá)到70%以上。

石油濃度是微生物代謝過(guò)程的一個(gè)重要因素，對(duì)微生物降解性能有一定影響[5]。石油濃度較低時(shí)，碳源不足，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，對(duì)石油降解效果不佳。隨著石油濃度增加，碳源可以滿足細(xì)菌生長(zhǎng)，細(xì)菌的降解效果也隨著增大，當(dāng)石油濃度繼續(xù)增大，開(kāi)始抑制石油降解菌的活性，使得細(xì)菌對(duì)石油降解效果下降。

3 討論與結(jié)論

生物降解法由于見(jiàn)效快、無(wú)殘毒、低成本，逐漸成為目前國(guó)際上關(guān)于石油污染研究的重點(diǎn)。微生物降解石油烴的速率主要與微生物種類、數(shù)量及其介質(zhì)的溫度，石油組分的性質(zhì)等有關(guān)，因此高效石油烴降解菌的分離、篩選，以及石油降解菌群的構(gòu)建是生物法處理石油污染的關(guān)鍵。

此次試驗(yàn)，在7株石油降解菌中篩選出5株高效石油降解菌，通過(guò)組合菌株，得到由赤紅球菌、鞘氨醇桿菌、無(wú)色桿菌高效石油降解菌群，通過(guò)一系列試驗(yàn)測(cè)得菌群的降解最優(yōu)條件為：pH=7.0，培養(yǎng)溫度為35 ℃，石油濃度為5 g/L。細(xì)菌最佳配比為，赤紅球菌∶鞘氨醇桿菌∶無(wú)色桿菌=2∶1∶2。通過(guò)條件優(yōu)化使得該菌降解率高達(dá)77.12%，有較高的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)壳爸粚?duì)菌株XS-2I的發(fā)酵條件進(jìn)行了初步研究，對(duì)石油的降解機(jī)理以及具體效果還需要在后期的實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中進(jìn)一步驗(yàn)證。

致謝：感謝華南理工大學(xué)生態(tài)修復(fù)實(shí)驗(yàn)室提供菌種。

參考文獻(xiàn)：

[1]李貴珍， 賴其良， 閆培生，等. 海洋石油污染及其微生物修復(fù)研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)進(jìn)展， 2015（3）：164-169

[2] Fathepure B Z. Recent studies in microbial degradation of petroleum hydrocarbons in hypersaline environments[J]. Frontiers in Microbiology， 2014， 5（2）：176-185

[3] Ayotamuno M J， Kogbara R B， Ogaji S O T， et al. Bioremediation of a crude-oil polluted agricultural-soil at Port Harcourt， Nigeria[J]. Applied Energy， 2006， 83（11）：1249–1257

[4] 陳維. 探究pH值對(duì)3種生物材料中過(guò)氧化氫酶活性的影響[J].生物學(xué)通報(bào)， 2014，49（6）：53-56

[5] 申圓圓. 土壤中石油污染物行為特征及植物根際修復(fù)研究[D].長(zhǎng)安大學(xué)，2012

（收稿日期：2016-01-12；修回日期：2016-01-21）