慢性根尖周炎感染根管內(nèi)糞腸球菌檢測(cè)和中間普氏菌基因多態(tài)性研究

徐芳

慢性根尖周炎感染根管內(nèi)糞腸球菌檢測(cè)和中間普氏菌基因多態(tài)性研究

徐芳

目的 探討慢性根尖周炎感染根管內(nèi)糞腸球菌檢測(cè)和中間普氏菌基因多態(tài)性特點(diǎn)。方法 選取需根管再治療和未經(jīng)根管治療的慢性根尖周炎患者各20例，對(duì)根管內(nèi)細(xì)菌樣本采集，行DNA提出，檢測(cè)糞腸球菌，并分析中間普氏基因多態(tài)性。結(jié)果 需根管再治療的患者E.f檢出11例，檢出率為55%；未經(jīng)根管治療的患者E.f檢出2例，檢出率為10%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。所有慢性根尖周炎感染的40例患者中，經(jīng)AP-PCR電泳對(duì)中間普氏菌行基因多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)各樣本中均各有1種基因型。結(jié)論 在原發(fā)慢性根尖周炎病例感染根管中，糞腸球菌有較低檢出率，而在再治療病例中，檢出率明顯增高，與根管治療時(shí)再感染可能相關(guān)。同時(shí)，中間普氏菌具基因多態(tài)性，可為臨床治療提供參考依據(jù)。

慢性根尖周炎感染；根管內(nèi)糞腸球菌；中間普氏基因多態(tài)性

根尖周炎為臨床口腔科領(lǐng)域一種常見(jiàn)的慢性感染性病變，由起源自牙髓病的致病因素引發(fā)。根管治療術(shù)是現(xiàn)階段已被證實(shí)的最有效治療本病的方案，在無(wú)菌條件下，依據(jù)操作原則實(shí)施，可達(dá)85%～96%初次成功率[1]。針對(duì)少部分無(wú)效的患者，根管充填后在根尖周或根管內(nèi)殘留的微生物感染是主要引發(fā)治療失敗的原因，檢測(cè)治療失敗的患者根管內(nèi)細(xì)菌，如糞腸球菌（E.f），并行中間普氏菌基因多態(tài)性研究，可為臨床治療提供參考依據(jù)，本研究探討慢性根尖周炎感染根管內(nèi)糞腸球菌檢測(cè)和中間普氏菌基因多態(tài)性特點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取選取江西省景德鎮(zhèn)市牙病防治所口腔科2014年5月～2015年5月收治的40例慢性根尖周炎患者，其中需根管再治療和未經(jīng)根管治療各20例，需根管再治療男14例，女6例，年齡19～45歲，平均（28.5±2.5）歲，未經(jīng)根管再治療男15例，女5例，年齡19～46歲，平均（28.9±2.4）歲，2組間基線資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；颊邔?duì)本次實(shí)驗(yàn)均知情同意，將患全身系統(tǒng)疾病，根尖有竇道者排除。

1.2 方法 （1）采集樣本：患牙上橡皮障，將所有修復(fù)體、充填體去除，用75%酒精對(duì)患牙消毒，取蒸餾水沖洗。需根管再治療的患牙，應(yīng)用G鉆將冠2/3的根充材料去除，根尖1/3根充材料取出，在1 mL Ringer′液管中放置。若有液體自根管滲出，可取無(wú)菌紙捻插入，深度與根尖孔距離1 mm，在根管內(nèi)紙捻停留1 mm取出，重復(fù)3次，在1 mL Ringer′液管放入所有紙捻。（2）DNA提?。禾崛?guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株：E.f、中間普氏菌（P.i,ATCC25261）。（3）PCR分析：取1.5%瓊脂糖凝膠對(duì)樣本

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳、拍照，對(duì)E.f檢出率計(jì)算，并分析中間普氏菌基因多態(tài)性。中間普氏菌基因多態(tài)性分析方法：用中間普氏菌特異引物PCR對(duì)克隆樣本檢測(cè)，結(jié)果為陽(yáng)性者，檢測(cè)菌株基因多態(tài)性，采用隨機(jī)引物擴(kuò)增，取10μL產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，成像應(yīng)用凝膠原像分析儀分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

需根管再治療的患者E.f檢出11例，檢出率為55%；未經(jīng)根管治療的患者E.f檢出2例，檢出率為10%；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。所有慢性根尖周炎感染的40例患者中，經(jīng)AP-PCR電泳對(duì)中間普氏菌行基因多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)各樣本中均各有1種基因型。

3 討論

分析口腔科慢性根尖周炎病例采用根管治療結(jié)果失敗的原因，與患者感染根管內(nèi)微生物緊密關(guān)聯(lián)。失敗病例中，有66.7%～72.0%的根管微生物檢出率。Siqueira JF Jr等[2]研究示，在治療失敗病例患牙根管內(nèi)對(duì)微生物提取，與未經(jīng)治療壞死牙髓中提取的微生物明顯不同。未治療的根管系統(tǒng)以典型的多微生物混合感染為表現(xiàn)，以專(zhuān)性革蘭陽(yáng)性及陰性厭氧菌為優(yōu)勢(shì)菌。治療失敗的病例，為單一菌種感染樣本占約1/3，兼性厭氧菌比例有所增加，向優(yōu)勢(shì)菌群轉(zhuǎn)變，而革蘭陽(yáng)性菌因各種機(jī)械化治療措施的實(shí)施，有更強(qiáng)抵抗性，在檢出細(xì)菌中占主導(dǎo)[3-4]。根管治療失敗的患牙，常有特征性種屬細(xì)菌分離出，其中腸球菌的存在已引起臨床重視，因其較少在未用治療方案的感染根管中出現(xiàn)，而感染根管內(nèi)腸球菌E.f最常檢出，占80%～90%。

E.f為一種革蘭陽(yáng)性兼性厭氧菌，屬重要的人類(lèi)機(jī)會(huì)感染病原菌，也屬人體正常菌群。其常在人類(lèi)的口腔、陰道、腸道寄居，但口腔分布較少。在再感染根管病例中，E.f是最常被檢出的細(xì)菌，初次治療的病例中偶被檢出，根管治療失敗的病例中，檢出率有所增高。本次選取的再治療患者，有高達(dá)55%的E.f檢出率，明顯高于未經(jīng)治療者[5]。表明E.f為根管治療時(shí)被帶入根管內(nèi)。研究示，當(dāng)氫氧化鈣液pH達(dá)11.5時(shí)，可殺死99.99%的

E.f，但臨床現(xiàn)用的氫氧化鈣pH多僅可達(dá)9.5%～10.0%，E.f無(wú)法完全被消滅。

本研究所選樣本在根管填充時(shí)，未將氫氧化鈣作為根管內(nèi)用藥，仍有較高的E.f檢出率，與前次治療醫(yī)生的操作技術(shù)相關(guān)。本次選取的需根管再治療的20例慢性根尖周炎樣本，大部分前次采用根管方案治療時(shí)有缺陷存在，如根管成形與清理不足、根充欠填、充填物繼發(fā)齲壞等。未徹底清理和封閉根管系統(tǒng)，增加了E.f滲入或殘留風(fēng)險(xiǎn)。病原菌在根管中匿藏，可經(jīng)未嚴(yán)密封閉的部位在滲漏的組織液中獲取生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)，當(dāng)入侵至根尖周組織，可對(duì)根尖周病變的發(fā)生和發(fā)展促進(jìn)[6-7]。E.f所具有的其它特性與其高檢出率也有較緊密相關(guān)性。E.f對(duì)多種殺菌藥物及機(jī)械化學(xué)預(yù)防具廣泛抵抗力。有針對(duì)感染牙模型展開(kāi)的研究示，取4%NaCIO應(yīng)用，作用5 min，可達(dá)60%對(duì)E.f的清除率。分析原因，是殺菌藥物與在牙本質(zhì)小管內(nèi)存在的目標(biāo)菌無(wú)法直接接觸。有學(xué)者將E.f在離體牙根管內(nèi)植入，應(yīng)用NaCIO溶液沖洗后顯示，顯著降低了E.f數(shù)量，但7 d后再行觀察，再感染根管可達(dá)80%，提示此細(xì)菌有較快的形成再感染的速度。E.f可在治療后未檢出其他協(xié)作菌的根管內(nèi)生長(zhǎng)，在治療失敗的患者中，表現(xiàn)為單一E.f感染的病例約占30%。此外，生物膜形成是治療后E.f長(zhǎng)期在根管內(nèi)存留的主要原因，生物膜中E.f有更復(fù)雜的代謝過(guò)程，且其對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高，繁殖迅速，可對(duì)根尖區(qū)缺氧環(huán)境耐受，進(jìn)而較難達(dá)到徹底清除目標(biāo)，極易引發(fā)根管治療失敗。

中間普氏菌（P.intermedia）以蛋白水解酶、脂多糖、囊泡、凝集素等為主要致病因子，是一種產(chǎn)黑色素、革蘭陰性專(zhuān)性厭氧菌。有研究顯示[8]，其與牙周疾病的發(fā)生關(guān)聯(lián)密切，為主要可疑致病菌。在慢性根尖周炎感染根管中有較高檢出率，表明其與根尖周感染可能也相關(guān)。依據(jù)纖毛類(lèi)型差異，可將其按20種基因型劃分，在臨床收治的慢性牙周炎病例牙周袋中，有P.intermedia17、W729等4種基因型檢出，但根尖周感染中，中間普氏菌有無(wú)基因多態(tài)性存在，不同基因型作用如何，本研究選取慢性根尖周患者，在患牙感染根管中，應(yīng)用隨機(jī)引物RCR技術(shù)觀察中間普氏菌基因多態(tài)性，結(jié)果顯示，所有慢性根尖周炎感染的40例患者中，經(jīng)AP-PCR電泳對(duì)中間普氏菌行基因多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)各樣本中均各有1種基因型。慢性根尖周炎病發(fā)過(guò)程除與致病菌種類(lèi)相關(guān)外，還與致病菌毒力因子有一定相關(guān)性，而基因型不同的菌株在毒力致病性上可能存有明顯差異，即存在致病菌基因多態(tài)性。本研究不同的病例有不同基因型，體現(xiàn)了基因多態(tài)性，可為慢性根尖周炎感染中間普氏菌致病機(jī)制的研究提供依據(jù)。

綜上所述，在原發(fā)慢性根尖周炎病例感染根管中，糞腸球菌有較低的檢出率，而在再治療病例中，檢出率明顯升高，與根管治療時(shí)再感染可能相關(guān)。同時(shí)，中間普氏菌具基因多態(tài)性，可為臨床治療提供參考依據(jù)。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2016.30.029

江西 333000 江西省景德鎮(zhèn)市牙病防治所（徐芳）