大腸脫落細(xì)胞及其標(biāo)記物篩查大腸癌的研究現(xiàn)狀

李 陽(yáng)，余小舫

暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,深圳市人民醫(yī)院肝膽胰外科，廣東 深圳 518020

大腸脫落細(xì)胞及其標(biāo)記物篩查大腸癌的研究現(xiàn)狀

李 陽(yáng)，余小舫

暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,深圳市人民醫(yī)院肝膽胰外科，廣東 深圳 518020

大腸癌(colorectal cancer，CRC)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，目前手術(shù)仍是最有效的治療手段，早期診斷和篩查可提高其手術(shù)切除率，目前的篩查手段主要有糞便隱血試驗(yàn)(fecal occult blood test，F(xiàn)OBT)、結(jié)腸鏡、鋇灌腸、CT等，然而這些篩查手段都存在一定的不足。近年來(lái)隨著對(duì)結(jié)直腸息肉和腺瘤癌變過(guò)程中基因和表觀遺傳學(xué)改變認(rèn)識(shí)的加深，人們開(kāi)始對(duì)大腸脫落細(xì)胞及其成分進(jìn)行檢測(cè)，尋找便宜、安全、低格低廉、準(zhǔn)確和依從性高的篩查方法。本文就大腸脫落細(xì)胞提取方法、脫落細(xì)胞及其成分檢測(cè)的研究進(jìn)展作一詳細(xì)概述。

大腸癌；脫落細(xì)胞；標(biāo)志物；篩查方法

全球范圍內(nèi)，大腸癌(colorectal cancer，CRC)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居惡性腫瘤第3位[1],每年有超過(guò)600 000人死于結(jié)直腸癌[2]。在中國(guó)，相關(guān)資料[3]估計(jì)2015年結(jié)直腸癌新增病例約37.63萬(wàn)，其相關(guān)死亡病例約19.10萬(wàn)，且隨著人口的增加、人口老齡化、環(huán)境污染加重及高熱量、高蛋白、低纖維飲食等逐漸西化的飲食習(xí)慣，其發(fā)病人數(shù)呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。腫瘤的防止提倡“早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療”的三早原則，結(jié)直腸癌Ⅰ期和Ⅱ期的手術(shù)治愈率分別在90%和75%左右[4]，但大多數(shù)患者就診時(shí)已屬中晚期，喪失了手術(shù)切除的最佳時(shí)機(jī)且預(yù)后較差[5]。目前CRC的篩查方法主要有糞便隱血試驗(yàn)(fecal occult blood test，F(xiàn)OBT)、鋇灌腸、乙狀結(jié)腸鏡、纖維結(jié)腸鏡檢查等。雖然這些篩查明顯降低了結(jié)直腸相關(guān)的死亡率[6]，但仍存在一定的缺陷。FOBT由于無(wú)創(chuàng)、便宜、簡(jiǎn)單的特點(diǎn)被廣泛運(yùn)用到結(jié)直腸癌的篩查中，但存在敏感性低、假陽(yáng)性和假陰性高的不足[7]。目前結(jié)腸鏡被認(rèn)為是結(jié)直腸癌診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其不適感、有創(chuàng)、花費(fèi)高、穿孔風(fēng)險(xiǎn)、對(duì)設(shè)備和內(nèi)鏡醫(yī)師技術(shù)要求高等特點(diǎn)限制其廣泛應(yīng)用[8]。近年來(lái)隨著對(duì)結(jié)直腸息肉和腺瘤癌變過(guò)程中基因和表觀遺傳學(xué)改變認(rèn)識(shí)的逐步加深，人們嘗試?yán)么竽c脫落細(xì)胞及癌變過(guò)程中改變的基因和表觀遺傳學(xué)分子作為生物標(biāo)記物對(duì)結(jié)直腸癌及其癌前病變進(jìn)行診斷，來(lái)尋找可用于結(jié)直腸早期診斷簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、無(wú)創(chuàng)的篩查方法。

1 脫落細(xì)胞篩查CRC的可行性

早在19世紀(jì)人們就觀察到可以從結(jié)腸的刷洗液中找到脫落的腫瘤細(xì)胞用于結(jié)腸癌的篩查，后來(lái)組織學(xué)發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌組織及息肉鄰近的黏膜面有豐富的脫落細(xì)胞及其碎片，而正?；颊呓Y(jié)直腸黏膜組織中脫落細(xì)胞的量則較少[9]。其機(jī)制為：正常的黏膜上皮細(xì)胞常在原位凋亡，然后被上皮下的巨噬細(xì)胞所吞噬；而結(jié)直腸癌細(xì)胞由于極強(qiáng)的增生能力及對(duì)失巢凋亡的抵抗，所以其黏膜層有大量的腫瘤脫落細(xì)胞存在[10]。研究[11]表明即使體積只有1 cm3的腺瘤，由于其展開(kāi)面積是其體積的200倍左右，也可以從其排泄物中得到足夠數(shù)量的脫落細(xì)胞或其細(xì)胞成分用于結(jié)直腸癌的篩查。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)分析證實(shí)從糞便中分離得到的腫瘤脫落細(xì)胞幾乎全部來(lái)源于結(jié)直腸[12]。以上事實(shí)表明：運(yùn)用結(jié)直腸脫落細(xì)胞或其成分作為腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行結(jié)直腸癌和腺瘤的篩查是可行的。

2 結(jié)直腸脫落細(xì)胞提取方法

2.1 從自然排出的糞便中提取脫落細(xì)胞1989年Albaugh等[13]創(chuàng)立離心淘洗法，并應(yīng)用該方法從新鮮大便中提取到完整的結(jié)直腸脫落細(xì)胞，奠定了從自然排出的糞便中提取結(jié)直腸脫落細(xì)胞的試驗(yàn)基礎(chǔ)。但該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力且需要昂貴的離心淘洗儀。1998年Loktionov等[14]應(yīng)用免疫磁珠法(mgnetic activated cell sorting，MACS)從全大便的表面清洗液中獲得了完整的結(jié)直腸癌脫落細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行DNA定量分析，后續(xù)的研究表明該方法雖可以得到完整的結(jié)直腸脫落細(xì)胞，但細(xì)胞收集率較低。國(guó)內(nèi)學(xué)者武子濤等[15]將液基薄層制片技術(shù)應(yīng)用到糞便及清腸液脫落細(xì)胞的提取中，通過(guò)使用30、100、200目篩網(wǎng)集一體的細(xì)胞收集器和液基薄層自動(dòng)制片技術(shù)從糞便中提取到脫落的結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞并獲得更加滿(mǎn)意的制片效果。

從自然排出的糞便中提取脫落細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)在于大便標(biāo)本較易獲取、操作無(wú)創(chuàng)、患者的依從性較好。但很多文獻(xiàn)結(jié)果顯示即使有豐富的結(jié)腸脫落細(xì)胞進(jìn)入腸腔，由于厭氧的大便環(huán)境中含有膽汁酸和其他細(xì)胞毒性物質(zhì)，所以從糞便中獲得一定數(shù)量可用于結(jié)腸癌篩查的完整脫落細(xì)胞的可能性較小，尤其是從右半結(jié)腸脫落的腫瘤細(xì)胞。故目前關(guān)于糞便中脫落細(xì)胞的研究重要集中在檢測(cè)糞便中脫落細(xì)胞裂解后的成分(如DNA、RNA、蛋白等)。

2.2 導(dǎo)瀉清腸法采集大腸脫落細(xì)胞早在20世紀(jì)50年代就有報(bào)道[16]利用從大腸灌洗液中收集的脫落腫瘤細(xì)胞進(jìn)行結(jié)直腸癌的篩查，但后來(lái)由于纖維結(jié)腸鏡的出現(xiàn)而被人們忽略。因脫落細(xì)胞具有無(wú)創(chuàng)性、患者依從性好的優(yōu)勢(shì)，進(jìn)入80年代后又開(kāi)始被人們重新重視。Rosman等[17]采用清腸法顯示脫落細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌診斷的敏感性為93%，特異性為100%。武子濤等[18]通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)口服平衡鹽液后第3次和第4次收集的清腸液經(jīng)處理后可獲得滿(mǎn)意的細(xì)胞學(xué)收集結(jié)果。

2.3 結(jié)腸鏡沖洗液采集大腸脫落細(xì)胞在結(jié)腸鏡直視下在取活檢前對(duì)可疑病變部位進(jìn)行沖洗，結(jié)腸鏡檢查結(jié)束后沖洗活檢鉗及結(jié)腸鏡末端，同時(shí)收集整個(gè)結(jié)腸鏡檢查過(guò)程中的沖洗液，收集的液體經(jīng)離心、固定等處理后，制成涂片或細(xì)胞塊進(jìn)行細(xì)胞學(xué)及其相關(guān)成分的檢測(cè)[19]。

2.4 內(nèi)鏡直視下刷片在結(jié)腸鏡直視下通過(guò)結(jié)腸鏡細(xì)胞刷對(duì)可疑病變部位及其周?chē)鷧^(qū)域進(jìn)行刷檢，將刷子在玻片上快速滾動(dòng)2～3次，然后用95%的酒精固定，制片后的刷子可在固定劑中攪動(dòng)獲取剩余的細(xì)胞以制成細(xì)胞塊[19]。相對(duì)于內(nèi)鏡下活檢，刷檢細(xì)胞學(xué)的優(yōu)勢(shì)在于可在內(nèi)鏡直視下對(duì)可疑病變部位較大面積黏膜細(xì)胞進(jìn)行診斷，可作為活檢的重要補(bǔ)充手段，尤其對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎懷疑癌變患者。對(duì)于一些特殊患者，如長(zhǎng)期口服抗凝劑活檢時(shí)出血風(fēng)險(xiǎn)較高時(shí)，內(nèi)鏡下刷檢細(xì)胞學(xué)檢查也許是活檢的一個(gè)很好代替。Brouwer等[20]對(duì)918例可疑結(jié)直腸患者進(jìn)行內(nèi)鏡下細(xì)胞刷檢，以手術(shù)或內(nèi)鏡下切除標(biāo)本的病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞學(xué)對(duì)結(jié)直腸癌診斷的敏感性為88.2%，特異性為94.1%，而內(nèi)鏡下活檢診斷的敏感性為86.9%，特異性為99.5%，兩者對(duì)結(jié)直腸癌診斷的敏感性差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 直接從直腸黏膜收集脫落細(xì)胞Loktionov等[21]通過(guò)對(duì)結(jié)直腸癌患者手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本黏膜面進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在癌癥病灶的遠(yuǎn)側(cè)黏膜面也存在脫落的腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而提出了脫落的腫瘤細(xì)胞沿黏膜面向遠(yuǎn)端遷移的假說(shuō)并以這一理論為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了一種收集細(xì)胞的可充氣裝置，直接從467例可疑結(jié)直腸癌患者直腸的黏膜面收集脫落細(xì)胞并進(jìn)行DNA含量的檢測(cè)，結(jié)果顯示對(duì)結(jié)直腸癌診斷的敏感性為91.3%，特異性為60%[22]。但研究顯示該方法具有糞便污染率高的缺點(diǎn)，且這種收集方法還處于探索階段，需要更多的相關(guān)研究證實(shí)。

3 結(jié)直腸脫落細(xì)胞及其相關(guān)生物標(biāo)記物檢測(cè)在CRC篩查中的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用

3.1 結(jié)直腸癌的分子發(fā)病機(jī)制過(guò)去我們認(rèn)為只有管狀或管狀絨毛狀腺瘤性息肉才會(huì)癌變，即遵循腺瘤-結(jié)直腸癌的進(jìn)展序列，目前的研究發(fā)現(xiàn)無(wú)蒂鋸齒狀息肉和傳統(tǒng)的鋸齒狀息肉也會(huì)癌變，也就是說(shuō)結(jié)直腸的癌變過(guò)程還有另外一個(gè)序貫(鋸齒狀息肉-結(jié)直腸癌)，且兩者癌變過(guò)程中的分子機(jī)制是不同的[23]。腺瘤的癌變通常被APC基因的突變啟動(dòng)，絕大多數(shù)表現(xiàn)為染色體或倍體不穩(wěn)定性(chromosome instability，CIN)。右半結(jié)腸鋸齒狀息肉的癌變表現(xiàn)為過(guò)度CpG島甲基化的表觀遺傳學(xué)的不穩(wěn)定性即CIMP；左半結(jié)腸鋸齒狀息肉的典型表現(xiàn)為微衛(wèi)星的穩(wěn)定性(MSS)和頻繁的K-RAS基因突變，而CpG島甲基化的程度則相對(duì)較輕[23]。根據(jù)分子改變的不同，目前結(jié)直腸癌可分為四個(gè)亞型：(1)染色體不穩(wěn)定型；(2)微衛(wèi)星不穩(wěn)定型；(3)CpG島甲基化型；(4)DNA總體低甲基化[24]?，F(xiàn)階段我們認(rèn)為結(jié)直腸上皮的癌變由這些基因和表觀遺傳學(xué)的改變所啟動(dòng)，并進(jìn)一步受到相鄰組織腫瘤促進(jìn)因素(如腸道菌群、炎癥)所促進(jìn)的過(guò)程[25]。隨著對(duì)以上結(jié)直腸癌變過(guò)程中基因和表觀遺傳學(xué)改變的認(rèn)識(shí)，人們嘗試用DNA倍體、基因或表觀遺傳學(xué)改變的分子作為腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行結(jié)直腸癌的早期診斷和預(yù)后分析。

3.2 大腸脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)

3.2.1 結(jié)直腸脫落腫瘤細(xì)胞標(biāo)記物：從糞便中回收的脫落細(xì)胞數(shù)目較少，很難用細(xì)胞形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)區(qū)分其良惡性，故人們嘗試尋找可識(shí)別糞便樣本中完整的結(jié)直腸脫落腫瘤細(xì)胞的分子標(biāo)記物，如微小染色體維持蛋白(MCM)家族[26]。MCM是真核細(xì)胞在細(xì)胞周期中啟動(dòng)DNA復(fù)制的關(guān)鍵蛋白，它可以調(diào)控細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，并限制DNA在每個(gè)細(xì)胞周期中只復(fù)制一次[27]。MCM只存在于處于細(xì)胞周期中的細(xì)胞(如結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞)，但在靜止或分化好的細(xì)胞中則低表達(dá)或不表達(dá)，故其可作為上皮細(xì)胞進(jìn)展為腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志。Davies等[28]利用免疫組化法對(duì)40例結(jié)直腸癌和25名正常對(duì)照者糞便中的MCM進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示37例結(jié)直腸癌中有MCM陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的存在，而所有正常對(duì)照者糞便中均未檢測(cè)到MCM陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞。

3.2.2 大腸脫落細(xì)胞DNA倍體分析：CIN是結(jié)直腸癌變過(guò)程中最常見(jiàn)的基因組不穩(wěn)定性，約出現(xiàn)在85%的結(jié)直腸癌患者中[24]。通常我們通過(guò)流式細(xì)胞儀或圖像分析儀兩種方法檢測(cè)出異倍體或多倍體來(lái)推斷染色體的不穩(wěn)定性[29]。Gerrits等[30]對(duì)大腸炎癥性疾病合并結(jié)直腸癌患者DNA倍體的研究顯示：DNA倍體異常(DI： 1.06～1.34，HR=4.7， 95%CI：2.7～7.9；DI>1.34，HR=5.0，95%CI：2.5～10.0)是大腸炎癥性疾病患者癌變的重要危險(xiǎn)因素，可用于結(jié)直腸癌的早期篩查。Dewhurst等[31]發(fā)現(xiàn)染色體分離錯(cuò)誤和四倍體耐受可導(dǎo)致CIN的發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)癌變的進(jìn)展，四倍體狀態(tài)和CIN可作為結(jié)直腸癌預(yù)后差的指標(biāo)。而倍體異常與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系方面仍存在一定的爭(zhēng)議，Walther等[32]通過(guò)對(duì)63項(xiàng)研究中的10 126例結(jié)直腸癌患者的倍體與預(yù)后情況做Meta分析，結(jié)果顯示倍體異常的結(jié)直腸癌患者預(yù)后相對(duì)較差，應(yīng)該和MSI狀態(tài)一起用于所有的結(jié)直腸癌患者中。而其他研究結(jié)果則顯示倍體異常與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后無(wú)明顯關(guān)系，目前不推薦DNA倍體應(yīng)用于臨床結(jié)直腸癌患者的預(yù)后分析中。

3.3 糞便中腫瘤脫落細(xì)胞成分檢測(cè)大便標(biāo)本由于操作無(wú)創(chuàng)、易獲得和患者依從性較好的優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是結(jié)直腸腫瘤篩查的理想標(biāo)本，但由于其富含膽汁酸、細(xì)胞毒性物質(zhì)等復(fù)雜成分，使得直接從大便標(biāo)本獲得完整的結(jié)直腸脫落細(xì)胞較為困難，在過(guò)去的十多年中，人們嘗試?yán)妹撀浼?xì)胞裂解后的成分(如DNA、mRNA、microRNA、蛋白等)進(jìn)行結(jié)直腸腫瘤的早期篩查，但到目前為止，只有糞便DNA檢測(cè)方面的研究較為完整，并顯示出較高的診斷敏感性和特異性。

3.3.1 基因分子標(biāo)記物：與結(jié)直腸癌變相關(guān)的基因有很多，如APC、CTNNB1、KRAS、BRAF、SMAD4、TGFBR2、TP53、PIK3CA、ARID1A、SOX9、FAM123B、ERBB2等，它們主要通過(guò)干擾信號(hào)通路(如WNT)的功能或影響負(fù)責(zé)DNA修復(fù)或增殖基因的功能引起結(jié)直腸上皮細(xì)胞的癌變[33]。K-RAS基因：K-RAS是RAS基因家族的一員，其位于12號(hào)染色體短臂，負(fù)責(zé)編碼調(diào)節(jié)增生和分化的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白[34]。正常情況下K-RAS蛋白會(huì)水解GTP，從而抑制RAS蛋白，但突變的K-RAS蛋白可能會(huì)成為活躍的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，使細(xì)胞增殖失控[35]。K-RAS是首次報(bào)道的糞便樣本中可用于結(jié)直腸腫瘤診斷的突變基因[36]，然而后續(xù)的研究[37]顯示K-RAS突變對(duì)結(jié)直腸腫瘤診斷的敏感性和特異性不高，其僅出現(xiàn)在約35%的結(jié)直腸癌中，也并非結(jié)直腸疾病所特有的，如胰腺增生性疾病等也可以出現(xiàn)K-RAS基因突變，甚至正常的結(jié)腸黏膜組織也可以檢測(cè)到其存在[38]。然而由于K-RAS基因突變的位置相對(duì)固定，常位于基因的第12或13個(gè)密碼子，相對(duì)于其他突變基因更易檢測(cè)，故目前其仍常用于結(jié)直腸癌的分子篩查組合中。

TP53：P53蛋白能夠識(shí)別DNA損傷、協(xié)助DNA修復(fù)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而突變的TP53基因可影響細(xì)胞凋亡導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，進(jìn)而導(dǎo)致癌變的發(fā)生。研究[39]顯示突變的TP53基因可導(dǎo)致機(jī)體對(duì)染色體不穩(wěn)的耐受性,進(jìn)而加速異倍體細(xì)胞的癌變。故理論上檢測(cè)到突變的TP53基因?qū)盒阅[瘤的發(fā)生具有重要的提示作用，但后續(xù)的研究提示其并非結(jié)直腸腫瘤理想的標(biāo)志物。Eguchi等[40]對(duì)25例結(jié)直腸癌患者糞便和配對(duì)組織標(biāo)本中突變的TP53基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示突變TP53在兩者中的陽(yáng)性率僅28%和44%。其低敏感性可能與結(jié)直腸腫瘤患者TP53點(diǎn)突變的位點(diǎn)不恒定有關(guān)。

APC：APC基因位于染色體5q21-22，長(zhǎng)約108 kb，其編碼的APC蛋白在負(fù)性調(diào)控wnt/β-連環(huán)蛋白通路上起著關(guān)鍵作用。突變的APC蛋白不能下調(diào)和抑制WNT信號(hào)通路中的β連環(huán)蛋白，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄因子TCF4和下游的癌基因(如MYC)被不恰當(dāng)?shù)丶せ?，?dǎo)致結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生[41]。在腺瘤-結(jié)直腸癌的序貫中，APC基因突變出現(xiàn)較早，可在大約60%的結(jié)直腸癌和腺瘤中檢測(cè)到[42]。但突變可發(fā)生于該基因的前1 600個(gè)密碼子的任何位置，且突變的類(lèi)型也各不相同，這使得其作為標(biāo)志物使用受限[43]。Traverso等[44]利用數(shù)字蛋白截?cái)喾▽?duì)46例結(jié)直腸腺瘤患者和28名正常對(duì)照者進(jìn)行APC突變基因檢測(cè)，結(jié)果顯示APC突變基因?qū)Y(jié)直腸腺瘤診斷的敏感性為57%。

但由于結(jié)直腸癌的DNA點(diǎn)突變具有異質(zhì)型，即個(gè)體間突變的基因及位點(diǎn)不同，故單獨(dú)應(yīng)用基因突變組合來(lái)進(jìn)行結(jié)直腸及息肉的篩查可能存在花費(fèi)高、敏感性低的問(wèn)題，目前基因突變常與表觀遺傳學(xué)分子標(biāo)記物一起用于結(jié)直腸腫瘤的篩查試驗(yàn)中。

3.3.2 表觀遺傳學(xué)分子標(biāo)記物：結(jié)直腸腫瘤表觀遺傳學(xué)相關(guān)的分子標(biāo)記物主要分為MSI、L-DNA和甲基化三類(lèi)。MSI：微衛(wèi)星的不穩(wěn)定性在遺傳性的結(jié)直腸癌和腺瘤中更為明顯，分別有90%和80%。位于錯(cuò)配修復(fù)基因MSH2內(nèi)含子區(qū)域的BAT-26是MSI最常使用糞便標(biāo)志物，研究[45]顯示其對(duì)近端結(jié)直腸癌的單獨(dú)診斷敏感性可達(dá)40%。

L-DNA：正常的結(jié)直腸上皮細(xì)胞凋亡時(shí)，其DNA會(huì)被核酸內(nèi)切酶切割成大小約180～200個(gè)堿基對(duì)的小片段，而腫瘤細(xì)胞由于對(duì)失巢凋亡的抵制，其脫落的腫瘤細(xì)胞中DNA不被降解，長(zhǎng)約1 800～2 400個(gè)堿基對(duì)，稱(chēng)為L(zhǎng)-DNA[46]。故L-DNA可作為腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記用于結(jié)直腸癌的檢測(cè)，研究[47]顯示當(dāng)以細(xì)胞內(nèi)L-DNA含量25 ng為分界時(shí)，其對(duì)結(jié)直腸癌診斷的敏感性為79%，特異性為89%。

甲基化：如上所述甲基化在結(jié)直腸的癌變過(guò)程中起重要作用，其常發(fā)生負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞增生、凋亡和DNA修復(fù)的基因的啟動(dòng)子或者第一個(gè)非編碼外顯子區(qū)域[48]，相對(duì)于基因突變而言，由于其位置比較固定，故更適合作為結(jié)直腸癌篩查的分子標(biāo)記物。Zou等[49]利用QUARTS技術(shù)，對(duì)37例結(jié)直腸癌、25例結(jié)直腸腺瘤患者和29名健康對(duì)照者組織中的4個(gè)甲基化基因(BMP3、NDRG4、VIM、TFPI2)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示這4個(gè)甲基化基因聯(lián)合對(duì)結(jié)直腸癌及腺瘤診斷的特異性為100%，敏感性分別為100%和96%。

3.3.3 分子診斷組合：由于單基因?qū)嶒?yàn)很難達(dá)到人們期望的診斷敏感性與特異性，所以在過(guò)去的20多年中，人們嘗試了不同的基因與表觀遺傳學(xué)生物標(biāo)記物組合用于結(jié)直腸癌及癌前病變的篩查，然而只有個(gè)別組合顯示出較高的診斷敏感性與特異性。其中一個(gè)叫做MT-sDNA的組合表現(xiàn)出極好的診斷敏感性及特異性，是目前唯一通過(guò)美國(guó)FDA認(rèn)證的結(jié)直腸癌及癌前病變分子篩選組合。一項(xiàng)對(duì)自動(dòng)化的MT-sDNA實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)的多中心研究[50]顯示：2個(gè)甲基化基因(NDRG4、BMP3)、K-RAS突變和大便潛血分子組合對(duì)結(jié)直腸癌、>1 cm的進(jìn)展期腺瘤和息肉診斷的敏感性分別為98%和57%，對(duì)腺瘤合并高級(jí)別非典型增生診斷的敏感性為83%，特異性為90%。另外一項(xiàng)涉及10 000例患者的大型橫斷面研究[51]顯示：MT-sDNA對(duì)結(jié)直腸癌、進(jìn)展期腺瘤和>1 cm的息肉診斷的敏感性分別為92%、42%和42%，特異性為87%。MT-sDNA的優(yōu)點(diǎn)在于其有比FOBT實(shí)驗(yàn)更高的診斷敏感性，且已實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，可滿(mǎn)足現(xiàn)代化實(shí)驗(yàn)室高通量的需要。

4 結(jié)直腸脫落細(xì)胞及其標(biāo)記物檢測(cè)存在的問(wèn)題及前景

CRC是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，早期診斷可降低其發(fā)病率及死亡率，近年來(lái)利用結(jié)直腸癌變過(guò)程中基因和表觀遺傳學(xué)改變的分子作為腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行結(jié)直腸腫瘤的診斷，表現(xiàn)出了較好的診斷敏感性及特異性，然而該方法還存在一定的不足。目前存在的問(wèn)題：(1)盡管有豐富的大腸脫落細(xì)胞進(jìn)入腸腔，但由于在富含膽汁酸和細(xì)胞毒性物質(zhì)的復(fù)雜糞便環(huán)境中停留時(shí)間較長(zhǎng)，很多脫落細(xì)胞被裂解，加之目前從糞便標(biāo)本中收集細(xì)胞的方法，細(xì)胞收集率不高，故很難從糞便中回收到足夠數(shù)量的可用于結(jié)直腸腫瘤篩查的完整脫落細(xì)胞，針對(duì)這一問(wèn)題，嘗試從清腸液、結(jié)腸鏡沖洗液及結(jié)腸鏡直視下刷檢獲取脫落細(xì)胞，由于細(xì)胞在腸道停留時(shí)間較短且所含糞便成分較少，得到完整脫落細(xì)胞幾率可能會(huì)更大；(2)DNA倍體異常用于結(jié)直腸腫瘤的診斷、預(yù)后及耐藥性的研究已經(jīng)有二十年之久，但DNA倍體異常對(duì)于結(jié)直腸的診斷仍缺乏一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，DNA異常倍體狀態(tài)的形成及其在結(jié)直腸上皮細(xì)胞癌變過(guò)程中的具體機(jī)制仍不清楚，DNA倍體異常與結(jié)直腸腫瘤患者預(yù)后及耐藥性的關(guān)系方面仍然存在一定的爭(zhēng)議，需要更多的研究來(lái)深究；(3)由于大便中含有細(xì)菌DNA酶及PCR抑制劑，可能影響糞便基因檢測(cè)的結(jié)果，故在提高糞便DNA提取及檢測(cè)方法靈敏度的同時(shí)，要改進(jìn)糞便標(biāo)本的收集及處理方法，如收集后立即加入含乙二胺四乙酸(EDTA)的緩沖液來(lái)抑制細(xì)菌DNA酶活性[52]；(4)現(xiàn)階段較多的結(jié)直腸腫瘤分子標(biāo)記物被人們提出，但大多實(shí)驗(yàn)診斷的效果還不理想，選擇單基因還是聯(lián)合分子診斷及聯(lián)合診斷分子的種類(lèi)、數(shù)目等問(wèn)題亟待解決，需要我們通過(guò)大樣本對(duì)其診斷敏感性及特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)合費(fèi)用及診斷效率，選擇更加適用于結(jié)直腸癌及癌前病變篩查的生物標(biāo)記物組合；(5)與FOBT相比，現(xiàn)階段基因檢測(cè)的費(fèi)用較高，對(duì)經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)人群來(lái)說(shuō)仍是一筆不小的負(fù)擔(dān)，也許隨著相關(guān)分子標(biāo)記物檢測(cè)的產(chǎn)業(yè)化及檢測(cè)技術(shù)的自動(dòng)化，分子診斷的費(fèi)用相應(yīng)降低而被大多數(shù)人所接受；(6)大多分子診斷較為費(fèi)時(shí)，且對(duì)檢驗(yàn)人員有一定的要求，不過(guò)第二代商業(yè)化的分子診斷實(shí)驗(yàn)MT-sDNA已問(wèn)世，基本可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，可滿(mǎn)足現(xiàn)代化實(shí)驗(yàn)室高通量的需求，便于其臨床應(yīng)用的推廣；(7)對(duì)結(jié)直腸癌前病變?cè)\斷的敏感性相對(duì)較低；(8)選擇分子診斷實(shí)驗(yàn)合適的篩查人群及復(fù)查間隔，F(xiàn)DA推薦50歲以上的無(wú)癥狀人群每3年應(yīng)接受一次MT-sDNA結(jié)直腸腫瘤篩查實(shí)驗(yàn)，而合并有大腸炎癥性疾病和有癥狀的人群則推薦接受結(jié)腸鏡檢查，分子診斷實(shí)驗(yàn)可能是其有益補(bǔ)充；(9)患者的依從性，研究[53]顯示提高依從性本身比提高治療對(duì)死亡率的影響更大，故需不斷改進(jìn)標(biāo)本的收集方法、處理技術(shù)及檢測(cè)方法，增加患者的依從性，如患者對(duì)無(wú)創(chuàng)、便于運(yùn)輸?shù)募S便標(biāo)本的依從性較好。

雖然目前仍存在以上這些問(wèn)題，然而相對(duì)于FOBT及結(jié)腸鏡檢查而言，由于糞便分子學(xué)診斷具有操作無(wú)創(chuàng)、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)直腸脫落細(xì)胞及其成分標(biāo)志物檢測(cè)仍具有十分廣闊的應(yīng)用前景。很多有可能用于結(jié)直腸癌及癌前病變篩查的分子標(biāo)記物已逐漸被人們發(fā)現(xiàn)，亟需從中篩選出最佳的標(biāo)記物組合，尤其是對(duì)結(jié)直腸癌前病變(進(jìn)展期腺瘤和息肉)更加敏感的標(biāo)記物組合。進(jìn)一步優(yōu)化大便處理、保存、運(yùn)輸及基因檢測(cè)的方法。進(jìn)一步探討和完善該方法對(duì)非典型增生、大腸炎癥性疾病甚至其他消化道疾病(如胰腺增生性疾病)診斷的可能性。由于結(jié)直腸脫落細(xì)胞及其成分可反映出整個(gè)結(jié)直腸的信息，故結(jié)直腸脫落細(xì)胞及其生物標(biāo)記物組合不但可用于無(wú)癥狀人群結(jié)直腸癌及其癌前病變的篩查，也可作為對(duì)高危患者進(jìn)行結(jié)腸鏡等檢查的有益補(bǔ)充，并可在一定程度上降低結(jié)直腸鏡隨診的頻率?？傊?，大腸脫落細(xì)胞及其相關(guān)分子診斷實(shí)驗(yàn)可能成為大腸癌更為理想的篩查方法，但在實(shí)際臨床應(yīng)用中需對(duì)其不斷優(yōu)化，同時(shí)期望找到對(duì)結(jié)直腸腫瘤更加理想的篩查手段。

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(責(zé)任編輯：李 健)

Study of exfoliated cells and its markers in the screening of colorectal cancer

LI Yang, YU Xiaofang

Department of Hepatobiliary and Pancreas Surgery, Shenzhen People’s Hospital, the Second Clinical Medical College of Ji’nan University, Shenzhen 518020, China

Colorectal cancer (CRC) is one of the most common malignancies. Surgical treatment of malignancy is effective， and the resection rate will be improved if lesions could be detected by early diagnosis and screening. The predominant screening methods up to date included fecal occult blood test (FOBT), colonoscopy, Barium enema, CT; however, they are not the ideal screening methods for CRC. In recent years, as the deepening of understanding of the genetic and epigenetic landscape across colorectal neoplasms, detection of exfoliated cells and related molecular markers are carried out to find possible new screening tests for early cancers and pre-malignant adenomas to get low price, safety, accuracy and high patient compliance methods. This article reviewed the advantages and limitations of different exfoliated colonocyte collection techniques and andvances in the molecular marker screening assays.

Colorectal cancer; Exfoliated cells; Marker; Screening method

李陽(yáng)，在讀研究生，研究方向：普外科臨床與基礎(chǔ)研究。E-mail:1028168734@qq.com

余小舫，教授，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，研究方向：普外科臨床與基礎(chǔ)研究。E-mail:yuxfshui@126.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.09.003

R735.3+4

A 文章編號(hào)：1006-5709(2016)09-0968-06

2016-05-23