五種五指山野生靈芝培養(yǎng)基篩選及活性成分分析*

范平杰，袁學(xué)軍，王亦我，王 丹

（海南熱帶海洋學(xué)院，熱帶生物與農(nóng)學(xué)院，海南 三亞 572000）

五種五指山野生靈芝培養(yǎng)基篩選及活性成分分析*

范平杰，袁學(xué)軍**，王亦我，王 丹

（海南熱帶海洋學(xué)院，熱帶生物與農(nóng)學(xué)院，海南 三亞 572000）

以五指山野生靈芝1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)和對(duì)照7號(hào)靈芝為材料，研究4種母種培養(yǎng)基配方和4種原種培養(yǎng)基配方對(duì)野生靈芝菌種菌絲生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)勢(shì)的影響，并比較分析不同靈芝品種中靈芝蛋白、多糖、三萜的含量。結(jié)果顯示，在4種母種培養(yǎng)基上，菌絲生長(zhǎng)速度的差異極顯著，生長(zhǎng)速度最快和生長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)的是培養(yǎng)基配方B（PDA＋木屑），最差的是配方D（PSA）；在4種原種培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)弱的先后順序?yàn)榕浞?＞配方4＞配方2＞配方1；在5種野生靈芝中，靈芝多糖、蛋白質(zhì)、三萜含量最高的分別是5號(hào)（0.732 mg·g－1）、2號(hào)（0.088 mg·g－1）、5號(hào)（1.193 mg·g－1），3種成分綜合含量最高的是5號(hào)。該試驗(yàn)為五指山野生靈芝的開發(fā)利用提供了參考依據(jù)。

野生靈芝；培養(yǎng)基篩選；活性成分

中國(guó)已知野生靈芝分4屬3亞屬103種。其中，海南靈芝分布的種類有72種，約占全國(guó)靈芝總種數(shù)的70%[1]。由于靈芝含有靈芝多糖、靈芝蛋白、靈芝三萜等多種藥理活性物質(zhì)，具有營(yíng)養(yǎng)、保健、治療疾病的作用[2]，因此，近年來(lái)靈芝的綜合開發(fā)利用越來(lái)越受到重視，對(duì)以下野生靈芝培養(yǎng)基的篩選有過陸續(xù)的報(bào)道：海南尖峰嶺的黃邊靈芝（Ganoderma luteomarhinatum）和咖啡網(wǎng)孢芝（Humphreya coffea－tum）[3]、泰山赤靈 （G.lucidum）[4]、西藏野生靈芝（G.leucocontextus）[5]、野生靈芝（G.applanatum）[6]等；也有學(xué)者曾對(duì)3種[7]和6種[8]不同靈芝品種的活性成分進(jìn)行了比較。不同學(xué)者對(duì)栽培與野生品種的活性成分進(jìn)行分析比較，其結(jié)果顯示差異顯著，如桂西北野生靈芝和人工栽培靈芝[9]、海南栽培靈芝與野生靈芝等[10]。靈芝營(yíng)養(yǎng)成分豐富且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，既可藥用，也可用來(lái)加工成保健品，是比較理想的保健營(yíng)養(yǎng)源。隨著消費(fèi)量的增長(zhǎng)，種植面積不斷擴(kuò)大，但靈芝品種和培養(yǎng)基配方是影響靈芝產(chǎn)量和質(zhì)量的主要因素[11-12]。據(jù)調(diào)查，五指山野生靈芝有20多個(gè)品種。本試驗(yàn)使用的材料為具有代表性的5種五指山野生靈芝，設(shè)計(jì)多個(gè)母種和原種配方，并對(duì)活性成分進(jìn)行比較分析，篩選出最佳品種和最佳培養(yǎng)基配方，為有效地開發(fā)利用五指山野生靈芝資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織分離材料

本文所用五指山野生靈芝1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)，其形態(tài)特征見圖1。

圖1 本文使用的五指山野生靈芝Fig.1 Wild Ganoderma lucidum in Wuzhi Mountain in this paper

1.1.2 培養(yǎng)基材料

木屑、棉籽殼、麥麩、馬鈴薯、葡萄糖、蔗糖、瓊脂、石膏。

1.1.3 藥品材料

葡萄糖、熊果酸、和香草醛、牛白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G250均為化學(xué)純；高氯酸、硫酸、蒽酮、無(wú)水乙醇、鹽酸、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、三氯甲烷、磷酸、冰乙酸、氯化鈉、硫酸銨均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 野生靈芝組織分離

選取健壯的幼靈芝（6分成熟），在接種箱內(nèi)先將種菇表面用75%的酒精擦拭，然后縱切，在菌蓋與菌柄交界處切成長(zhǎng)0.5 cm×0.5 cm的小塊，接種到PDA培養(yǎng)基斜面的中央，塞好棉塞，在25℃培養(yǎng)條件下于第11天挑選邊緣健壯菌絲進(jìn)行轉(zhuǎn)接擴(kuò)繁。

1.2.2 培養(yǎng)基配方

（1）母種培養(yǎng)基配方

配方A（PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，水1 000 mL；配方B：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、木屑40 g（水煮15 min取過濾液），水1 000 mL；配方C：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、MgSO41.5 g、KH2PO43 g，水1 000 mL；配方D（PSA）：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g，水1 000 mL。

（2）原種培養(yǎng)基配方

配方1（木屑培養(yǎng)基）：木屑990 g、石膏10 g，水1 300 mL；配方2（木屑麥麩培養(yǎng)基）：木屑790 g、麥麩200 g、石膏10 g，水1 200 mL；配方3（棉籽殼培養(yǎng)基）：棉籽殼990 g、石膏10 g，水1 200 mL；配方4（棉籽殼麥麩培養(yǎng)基）：棉籽殼790 g、麥麩200 g、石膏10 g，水1 300 mL。

1.2.3 培養(yǎng)基的制作與培養(yǎng)

母種按PDA平板培養(yǎng)基的方法制作，培養(yǎng)基滅菌之前pH調(diào)整為6.5，在121℃的條件下滅菌20 min～30 min，每個(gè)處理10個(gè)重復(fù)，總共4個(gè)處理。

原種按常規(guī)方法制作，培養(yǎng)基的pH調(diào)整為6.5，瓶裝，121℃滅菌2 h，每個(gè)處理10個(gè)重復(fù)，總共4個(gè)處理。培養(yǎng)的條件為：黑暗，室溫（25±1）℃左右，濕度60%～65%。

1.2.4 測(cè)量和觀察指標(biāo)

分別第7天和第14天時(shí)測(cè)量母種和原種菌絲的生長(zhǎng)速度和觀察生長(zhǎng)勢(shì)，菌絲的生長(zhǎng)勢(shì)分為強(qiáng)、中、弱。原種第12天時(shí)測(cè)量菌絲的生長(zhǎng)速度，并觀察菌絲生長(zhǎng)勢(shì)（強(qiáng)、中、弱）。

1.2.5 活性成分含量測(cè)定

靈芝多糖測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.7622x+0.0122, R2=0.998，參照考蒽酮-硫酸法[13]；靈芝蛋白測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.6643x+0.0009，R2=0.999，參照考馬斯亮藍(lán)G-250法[13]；靈芝三萜測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.4144x-0.01，R2=0.9934，參照光度測(cè)定法[13]。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

用Stst軟件（王韶華教授發(fā)明）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基配方對(duì)母種生長(zhǎng)的影響

不同培養(yǎng)基配方對(duì)母種菌絲生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)勢(shì)的影響，見表1和表2。

表1 不同配方對(duì)母種菌絲生長(zhǎng)速度的影響Tab.1 Effects of different formulas on the growth rate of mother mycelium

表2 不同培養(yǎng)基配方對(duì)母種菌絲生長(zhǎng)勢(shì)的影響Tab.2 Effects of different formulas on the growth potential of mother mycelium

結(jié)果顯示，4種培養(yǎng)基間菌絲的生長(zhǎng)速度差異顯著，在培養(yǎng)基配方B上，5種靈芝菌絲生長(zhǎng)速度均最快，最快速度達(dá)到1.24 cm·d-1；其次是配方A和配方C；最差的培養(yǎng)基配方為D。生長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)的培養(yǎng)基配方為B；其次是配方A和配方C；最差的是配方D。可能是由于葡萄糖可以被菌絲直接吸收，而蔗糖降解為葡萄糖才能被吸收；靈芝屬于木腐型真菌，木屑水煮液中增加了木屑中的營(yíng)養(yǎng)成分，因此，在含有木屑水煮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度均最快，生長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)。

2.2 不同培養(yǎng)基配方對(duì)原種生長(zhǎng)的影響

不同培養(yǎng)基配方對(duì)原種菌絲生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)勢(shì)的影響見表3和表4。

所有靈芝品種的菌絲在培養(yǎng)基配方3上生長(zhǎng)速度均最快，最快速度達(dá)0.875 cm·d-1；其次是配方4、配方2；配方1效果最差。菌絲生長(zhǎng)的最適C:N為（30～40）∶1。比值過大，營(yíng)養(yǎng)缺乏，菌絲生長(zhǎng)不良，且速度慢；比值過小，營(yíng)養(yǎng)過于豐富，反而不適于菌絲生長(zhǎng)。因此，棉籽殼培養(yǎng)基配方3最適宜原種菌絲生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)。

表3 不同配方對(duì)原種菌絲生長(zhǎng)速度的影響Tab.3 Effects of different formulas on the growth rate of different protospecies mycelium

表4 不同靈芝品種對(duì)原種菌絲生長(zhǎng)勢(shì)的影響Tab.4 Effect of different formulas on the growth potential of different protospecies mycelium

2.3 不同品種靈芝活性成分比較

不同品種靈芝活性成分比較情況見表5。

多糖含量除靈芝1號(hào)和5號(hào)間無(wú)差異外，其他品種之間均存在極顯著差異：對(duì)照最高（0.826 mg· mL-1），其次是靈芝1號(hào)和5號(hào)，最差是靈芝2號(hào)（0.336 mg·mL-1）。靈芝蛋白質(zhì)含量方面：2號(hào)最高（0.088 mg·mL-1），依次是7號(hào)、5號(hào)、3號(hào)、4號(hào)，最差的是1號(hào)（0.012 mg·mL-1）；靈芝三萜含量方面：5號(hào)最高（1.193 mg·mL-1），1號(hào)最低（0.352 mg·mL-1），由高到低的順序是5號(hào)、4號(hào)、7號(hào)、3號(hào)、2號(hào)、1號(hào)。根據(jù)3種活性成分的含量綜合評(píng)價(jià)，靈芝5號(hào)和7號(hào)最佳。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)中，靈芝菌絲在PDA+木屑培養(yǎng)基配方（配方B）上生長(zhǎng)最佳，可能是由于靈芝屬為木腐型真菌，在PDA培養(yǎng)基中加入木屑過濾液，可提供木質(zhì)中的營(yíng)養(yǎng)。原種最佳培養(yǎng)基均為棉籽殼配方（配方3），可能由于棉籽殼中的C∶N為 (15～20)∶1，更適合菌絲生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)不足或過剩使菌絲生長(zhǎng)均不良。

靈芝1號(hào)和5號(hào)多糖含量最高，靈芝2號(hào)蛋白質(zhì)含量最高，靈芝5號(hào)三萜含量最高。根據(jù)3種活性成分的含量綜合評(píng)價(jià)，靈芝5號(hào)最佳。

表5 不同靈芝活性成分含量比較Tab.5 Comparison of the active components of different kinds of Ganoderma lucidum

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Culture Medium Screening and Active Component Analysis of Five Wild Ganoderma lucidum in Wuzhi Mountain

FAN Ping-jie,YUAN Xue-jun,WANG Yi-wo,WANG Dan
(College of Tropical Biology and Agriculture,Hainan Tropical Ocean College,Sanya 572000,China)

In this experiment,taking wild Ganoderma lucidum No.1,No.2,No.3,No.4,No.5 and control No.7 from Wuzhi Mountain as materials,the four kinds of mother culture medium and four kinds of protospecies culture medium were designed based on mycelium growth rate and growth vigor of wild strains,and a comparative analysis on the content of protein,polysaccharide,triterpene were studied.The results showed that in four kinds of mother culture medium,mycelium growth rate were significantly difference,the fastest growth rate and the strongest growth vigor was in formula B,and the worst was in formula D.The order of growth rate and growth potential on four kinds of protospecies culture medium were formula three＞formula four＞formula two＞formula one.The highest levels of the proteins,polysaccharides and triterpenes were in No.5（0.732 mg·g－1）,No.2（0.088 mg·g－1）,No.5（1.193 mg·g－1）respectively,and three comprehensive content of No.5 was the highest.This experiment provided reference for the development and utilization of wild G.lucidum in Wuzhi Mountain.

wild Ganoderma lucidum;culture medium screening;active ingredient

S646.9

A

1003-8310（2016）05-0024-04

10.13629/j.cnki.53－1054.2016.05.007

海南省高校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（Hnky2015ZD－15）；三亞重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（L1210）；大學(xué)生創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（2015111000006、20150114）。

范平杰（1987－），男，本科，助教，主要從事植物學(xué)、菌物學(xué)及植物保護(hù)研究。E－mail:33286042＠qq.com

**通信作者：袁學(xué)軍（1967－），男，博士，教授，主要從事菌物學(xué)、組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化研究。E－mail:yuanxuej＠163.com

2016－06－01