青花菜及其近緣種親緣關(guān)系SRAP標(biāo)記分析

荊贊革裴徐梨唐征張小玲羅天寬劉慶朱世楊

（1.溫州科技職業(yè)學(xué)院 浙南作物育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，溫州 325006；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095）

青花菜及其近緣種親緣關(guān)系SRAP標(biāo)記分析

荊贊革1裴徐梨2唐征1張小玲1羅天寬1劉慶1朱世楊1

（1.溫州科技職業(yè)學(xué)院 浙南作物育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，溫州 325006；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095）

利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)青花菜與其近緣種進(jìn)行遺傳多樣性分析。28對(duì)SRAP引物共產(chǎn)生302條譜帶，其中多態(tài)性譜帶203條，多態(tài)率為67.22%，表明種質(zhì)間存在較高的多態(tài)性。相似系數(shù)分析表明，其變異范圍為0.461 5-0.900 6，平均遺傳相似系數(shù)為0.693 6?！G地’和‘矮抗青’之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳相似系數(shù)為0.461 5；‘Wzvcst-09-224’和‘Wzvcst-09-225’親緣關(guān)系最近，遺傳相似系數(shù)為0.900 6。聚類分析可將16個(gè)材料分為兩大類，第Ⅰ類包括蕓薹屬甘藍(lán)種蔬菜，第Ⅱ類為蕓薹屬白菜種。揭示了青花菜及其近緣變種間具有部分相似的遺傳基礎(chǔ)，親緣關(guān)系較近。結(jié)果表明，同一地域或來(lái)源的材料間具有較為相近的遺傳背景，親緣關(guān)系相對(duì)較近。研究結(jié)果有助于青花菜與其近緣種間種質(zhì)資源分類和優(yōu)異基因利用，加速青花菜新品種選育進(jìn)程。

青花菜 SRAP 遺傳多樣性 親緣關(guān)系分析

青花菜（Brassica oleraceaL. var.italica）別名西蘭花、綠菜花，原產(chǎn)于地中海東部沿岸地區(qū)，是十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種中以綠或紫色花球?yàn)楫a(chǎn)品的一個(gè)變種。目前，青花菜已逐漸成為我國(guó)重要的出口創(chuàng)匯蔬菜之一，但其育種基礎(chǔ)相對(duì)落后，多數(shù)青花菜種子仍依靠進(jìn)口。隨著青花菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和生產(chǎn)需求，對(duì)青花菜新品種進(jìn)行自主研發(fā)迫在眉睫。

優(yōu)質(zhì)種子種苗是蔬菜生產(chǎn)中極其重要的生產(chǎn)資料，近年來(lái)許多種子單位對(duì)青花菜開(kāi)展了育種工作，大量?jī)?yōu)質(zhì)新品種不斷涌入市場(chǎng)。然而由于青花菜品

種間遺傳背景狹窄，產(chǎn)品更新速度較慢。青花菜是由甘藍(lán)演化而來(lái)，是野生甘藍(lán)演化為木立花椰菜過(guò)程中出現(xiàn)的一個(gè)亞變種［1］，同其它甘藍(lán)變種間具有良好的雜交親和性，因此研究青花菜及其近緣種之間的遺傳多樣性，促進(jìn)優(yōu)異基因轉(zhuǎn)移，是進(jìn)行青花菜新品種選育的重要方式之一。

常規(guī)的田間植株形態(tài)鑒定和同工酶鑒定都存在易受環(huán)境條件、所取材料部位等影響的缺點(diǎn)，而近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）、ISSR、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）、AFLP、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）等，以其快速、準(zhǔn)確、不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成功應(yīng)用于辣椒［2］、莼菜［3］、苦瓜［4］、黃瓜［5］、茄子［6］、蘿卜［7］、大白菜［8］、西瓜［9］等多種作物，在種質(zhì)資源鑒定［10，11］、遺傳材料創(chuàng)建［12］、遺傳多樣性［13，14］、品種鑒定［15，16］等方面都得到了較好的應(yīng)用。目前對(duì)青花菜品種及其近緣種親緣關(guān)系分析方面的研究報(bào)道較少。本研究運(yùn)用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)青花菜及其近緣種進(jìn)行品種鑒定與親緣關(guān)系分析，旨在為青花菜與其近緣種間的利用與種質(zhì)資源分類提供技術(shù)基礎(chǔ)和理論依據(jù)，從而有助于優(yōu)異近緣種基因轉(zhuǎn)移，加速青花菜新品種選育進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料從浙江各地搜集，共15份甘藍(lán)變種類蔬菜，包括10份青花菜品種和2份花椰菜地方品種，甘藍(lán)、苤藍(lán)、芥藍(lán)各1份，以不結(jié)球白菜作為對(duì)照（表1）。試驗(yàn)材料種植于溫州科技職業(yè)學(xué)院試驗(yàn)田中，常規(guī)田間管理。

表1 材料名稱和編號(hào)

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 取適量幼嫩葉片，液氮研磨粉碎后，采用參照植物基因組DNA提取試劑盒操作方法提取基因組總DNA。提取試劑盒（離心柱型）由TIANGEN生物技術(shù)有限公司（北京）生產(chǎn)。1.2.2 SRAP-PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測(cè) 試驗(yàn)選用了4個(gè)正向引物和12個(gè)反向引物（表2），由上海生工生物工程有限公司合成。以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，總反應(yīng)體系為16 μL［17］：其中包括15 ng基因組DNA，2.0 mmol/L Mg2+，0.2 mmol/L dNTPs，1 UTaqDNA 聚合酶（TaKaRa），0.25 μmol/L引物。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，35℃復(fù)性1 min，72℃延伸1.5 min，5個(gè)循環(huán)；94℃變性1 min，50℃復(fù)性1 min，72℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，低溫保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物加4 μL上樣緩沖液。采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠，1×TBE 緩沖液，60 V預(yù)電泳30 min后，120 V恒壓電泳1-2 h，至指示劑遷移至凝膠下

部時(shí)，結(jié)束電泳。采用AgNO3染色法檢測(cè)電泳結(jié)果。

表2 用于遺傳多樣性分析的SRAP引物序列

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析 對(duì)SRAP-PCR電泳圖譜進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)清晰的SRAP位點(diǎn)，同一位置上出現(xiàn)譜帶的記為“1”，未出現(xiàn)譜帶的記為“0”。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件NTSYS pc version2.10e計(jì)算相似性系數(shù)，按UPGMA進(jìn)行聚類分析，繪制聚類分析樹狀圖。

2 結(jié)果

2.1 SRAP引物擴(kuò)增多態(tài)性分析

從48對(duì)SRAP引物中篩選出了28對(duì)引物組合對(duì)16份材料基因組DNA進(jìn)行了擴(kuò)增，共產(chǎn)生了302個(gè)位點(diǎn)，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出10.79個(gè)位點(diǎn)。多態(tài)性位點(diǎn)共203條，平均多態(tài)性位點(diǎn)7.25個(gè)，多態(tài)率為67.22%，表明甘藍(lán)變種間多態(tài)性高，遺傳多樣性較豐富，遺傳背景也相對(duì)復(fù)雜。

2.2 遺傳相似性分析

根據(jù)28對(duì)SRAP引物擴(kuò)增結(jié)果，通過(guò)NTSYS pc version2.10e軟件計(jì)算出品種間遺傳相似系數(shù)（GSC）的變異范圍為0.461 5-0.900 6，平均遺傳相似系數(shù)為0.693 6。‘綠地’（3）和‘矮抗青’（16）之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳相似系數(shù)為0.461 5；‘Wzvcst-09-224’（11）和‘Wzvcst-09-225’（12）親緣關(guān)系最近，遺傳相似系數(shù)為0.900 6（表3）。

2.3 聚類分析

采用 UPGMA 方法進(jìn)行聚類分析，得到16份材料的遺傳聚類圖（圖1）。在遺傳相似系數(shù)0.54處，可將供試材料分為2類：Ⅰ類包括10份青花菜（1-10）、2份花椰菜（11、12），甘藍(lán)（13）、苤藍(lán)（14）、羽衣甘藍(lán)（15）各1份，共15份材料；Ⅱ類僅包括1個(gè)材料，即不結(jié)球白菜‘矮抗青’（16）。第Ⅰ類15份材料均屬于蕓薹屬甘藍(lán)種蔬菜，第Ⅱ類為蕓薹屬白菜種，與植物學(xué)分類結(jié)果一致。二者雖同屬十字花科蕓薹屬，卻為不同的種，親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。從形態(tài)上看，甘藍(lán)變種植株相對(duì)高大，主根發(fā)達(dá)，葉片寬大，被有蠟粉，葉表面常呈灰綠色或藍(lán)綠色；不結(jié)球白菜植株相對(duì)矮小，淺根系，須根發(fā)達(dá)。葉

片較小，葉色淡綠至墨綠，葉柄肥厚，白色或綠色。二者間植物學(xué)性狀差異較大，不結(jié)球白菜與甘藍(lán)變種間差異較大，分別形成獨(dú)特的類群。在遺傳相似系數(shù)為 0.67處，第Ⅰ類又可以分成2個(gè)亞組，第一亞組包括10份青花菜品種，第二亞組包括花椰菜、甘藍(lán)、苤藍(lán)和羽衣甘藍(lán)。第一亞組中青花菜No.1-7大多來(lái)源于日本，聚為一個(gè)小組，表明同一地域來(lái)源的材料間具有較為相近的遺傳背景。綠珍F1（9）和美好F1（10）來(lái)源于臺(tái)灣長(zhǎng)勝種苗股份有限公司，聚類在同一小組，推測(cè)可能采用了同一親本或親本來(lái)源相同；本研究結(jié)果表明同一來(lái)源或同一地理區(qū)域的品種間具有相對(duì)較近的遺傳基礎(chǔ)。第二亞組中Wzvcst-09-224（11）和Wzvcst-09-225（12）搜集于溫州市洞頭縣，為松散型花椰菜地方品種，二者植物學(xué)性狀相近，相似系數(shù)高，聚類在同一小組。表明二者間基因組信息相近，具有較低的遺傳多樣性。

表3 16個(gè)種質(zhì)間的相似系數(shù)

圖1 基于SRAP標(biāo)記的16份種質(zhì)聚類圖

3 討論

本試驗(yàn)中28對(duì)多態(tài)性引物組合可檢測(cè)到302個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)203個(gè)，多態(tài)率為68.26%?？婓w云等［18］采用SRAP標(biāo)記技術(shù)對(duì)甘藍(lán)種質(zhì)的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，26個(gè)SRAP 引物組合可擴(kuò)增出穩(wěn)定清晰條帶439條，其中多態(tài)性條帶227條，多態(tài)性位點(diǎn)比率為51.7%。二者平均每個(gè)引物組合擴(kuò)增條帶數(shù)和多態(tài)性比例相差較大，推測(cè)由不同的引物組合和試驗(yàn)材料所引起。

甘藍(lán)類蔬菜原產(chǎn)地中海沿岸和西北歐的海濱，先經(jīng)甘藍(lán)野生種（Brassico oleraceavar.oleracea）栽培馴化成羽衣甘藍(lán)，而后分化出分枝細(xì)莖、髓狀莖和高莖3個(gè)類型。結(jié)球甘藍(lán)由不分枝類型的羽衣甘藍(lán)分化而來(lái)，球莖甘藍(lán)起源于髓狀莖類型。分枝細(xì)莖類型進(jìn)化成木立花椰菜，青花菜和花椰菜均為木立花椰菜的亞變種［1］。Song等［19］采用RFLP分子標(biāo)記分析了蕓薹屬植物野生種和栽培種的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)野生甘藍(lán)獨(dú)立于甘藍(lán)栽培種聚為一類，推測(cè)甘藍(lán)類作物可能是起源于某一種野生甘藍(lán)。田源等［20］利用RAPD標(biāo)記對(duì)甘藍(lán)類蔬菜材料進(jìn)行親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析。UPGMA分析結(jié)果可以將結(jié)球甘藍(lán)、抱子甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、青花菜、花椰菜、皺葉甘藍(lán)清楚區(qū)分為6組，從分子生物學(xué)的角度分析驗(yàn)證了它們之間的親緣進(jìn)化關(guān)系。抱子甘藍(lán)植物學(xué)形態(tài)特征特性與普通甘藍(lán)相比差異明顯，遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)與結(jié)球甘藍(lán)材料親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，獨(dú)立聚類［8］。周禹等［21］對(duì)芥藍(lán)、青花菜、結(jié)球甘藍(lán)和球莖甘藍(lán)及它們之間的24個(gè)雜交組合的主要植物學(xué)性狀進(jìn)行聚類分析，顯示芥藍(lán)與結(jié)球甘藍(lán)的親緣關(guān)系較近，推測(cè)芥藍(lán)是甘藍(lán)種的一個(gè)變種。

甘藍(lán)變種中青花菜和花椰菜間的親緣關(guān)系較近［22］。通過(guò)SSR標(biāo)記可將結(jié)球甘藍(lán)與青花菜區(qū)分開(kāi)來(lái)，而青花菜與花椰菜卻無(wú)十分嚴(yán)格的界線，表明花椰菜遺傳多樣性水平較低［23］。孫德嶺等［24］利用AFLP標(biāo)記對(duì)花椰菜、青花菜、紫花菜和黃花菜自交系的親緣關(guān)系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)黃花菜、紫花菜和青花菜間的親緣關(guān)系較近。本研究中聚類分析可將供試材料分為甘藍(lán)種和白菜種兩大類，表明甘藍(lán)變種間具有部分相似的遺傳基礎(chǔ)，親緣關(guān)系較近。10份青花菜與所選松散型花椰菜品種聚為不同的亞組，表明其之間具有較高的遺傳多樣性。

蕓薹屬植物的進(jìn)化研究表明，其三大基本類群，白菜組最原始、芥菜組進(jìn)化程度稍高、甘藍(lán)組進(jìn)化程度最高［25］，本試驗(yàn)中通過(guò)NTSYS軟件計(jì)算得出的品種間遺傳相似系數(shù)中，‘綠地’（甘藍(lán)組）和‘矮抗青’（白菜組）的遺傳相似系數(shù)最小，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。甘藍(lán)組中的5種類型間遺傳相似系數(shù)相對(duì)較大，表明它們存在特殊的進(jìn)化關(guān)系。

遺傳變異是蔬菜品種改良和選育的重要基礎(chǔ)。蔬菜育種中，變種內(nèi)變異往往不能充分滿足新品種

對(duì)抗病性和抗逆性的需求，而通過(guò)雜交引入變種間或種間變異是非常重要的技術(shù)手段。大量研究表明，青花菜近緣種質(zhì)資源中具有多種抗性、品質(zhì)等優(yōu)良基因，因此通過(guò)各種技術(shù)手段將這些優(yōu)異因?qū)肭嗷ú耍捎行Т龠M(jìn)現(xiàn)有品種改良和新品種選育。

4 結(jié)論

利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)青花菜與其近緣種進(jìn)行了遺傳多樣性分析。28對(duì)SRAP引物共產(chǎn)生多態(tài)性譜帶203條，多態(tài)率為67.22%，表明品種間存在較高的多態(tài)性。SRAP標(biāo)記聚類分析表明，16份材料的相似系數(shù)變異范圍為0.461 5-0.900 6，平均遺傳相似系數(shù)為0.693 6。聚類分析可將試驗(yàn)材料分為二大類，第Ⅰ類包括蕓薹屬甘藍(lán)種蔬菜，第Ⅱ類為蕓薹屬白菜種。表明青花菜及其近緣變種間具有部分相似的遺傳基礎(chǔ)，親緣關(guān)系較近。聚類結(jié)果還表明同一地域或來(lái)源的材料間具有較為相近的遺傳背景，親緣關(guān)系相對(duì)較近。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Genetic Diversity and Relationship Analysis of Broccoli with Its Related Species by SRAP Markers

Jing Zange1Pei Xuli2Tang Zheng1Zhang Xiaoling1Luo Tiankuan1Liu Qing1Zhu Shiyang1
（1. Zhenan Key Laboratory of Crop Breeding，Wenzhou Vocational College of Science and Technology，Wenzhou 325006；2. State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement，Nanjing Agricultral University，Nanjing 210095）

In this study, we analyzed genetic diversity and relationship between broccoli and its related species by SRAP molecular markers. Using 28 SRAP primer combinations, a total of 302 amplified fragments were detected and 203 were polymorphic, with polymorphism rate 67.22%, indicating high polymorphism among these germplasm. Similarity coefficient analysis showed that the variation ranged from 0.461 5 to 0.900 6, and the average genetic similarity coefficient was 0.693 6. ‘Lü di’ and ‘Ai kang qing’ had the farthest genetic relationship with genetic similarity coefficient 0.461 5. By contrast, the relationship was closest between ‘Wzvcst-09-224’ and ‘Wzvcst-09-225’, with genetic similarity coefficient 0.900 6. Cluster analysis divided 16 germplasm into two major clusters. Class I contained Brassica oleracea, and class II only had one member Chinese no heading cabbage. The result of cluster indicated that the genetic basis had more similarity between broccoli and its related species, with a closer relationship, comparing with Brassica campestris ssp. chinensis Makino. The results also showed that the same geographic or origin could make the germplasm had relatively similar genetic background and closer genetic relationship. The research could be helpful to germplasm classification and excellent genes utilization for broccoli and its relative species, to speed up the breeding process.

Broccoli SRAP Genetic diversity Genetic relationship

2013-10-23

浙江省自然基金項(xiàng)目（LY12C15009），浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項(xiàng)（2012C12903-3-3），浙江省重大科技項(xiàng)目（2010C12004），溫州科技局項(xiàng)目（N20090016）

荊贊革，男，博士研究生，助理研究員，研究方向：蔬菜遺傳育種與生物技術(shù)；E-mail：jingzange@aliyun.com

唐征，男，副教授，研究方向：蔬菜遺傳育種與生物技術(shù)；E-mail：tzeng05@163.com