孫偉(吉林省五星動物保健藥廠,吉林 長春 130062)
細胞培養(yǎng)技術方法及避免污染的措施
孫偉(吉林省五星動物保健藥廠,吉林長春130062)
醫(yī)學研究中最具技術含量的研究手段就是細胞培養(yǎng),同時它還是生物學研究中應用比較廣泛的一種方法。下面本文就細胞培養(yǎng)技術方法進行分析,觀察其操作中引發(fā)污染的情況,同時提出幾點避免污染的措施,內容如下。
細胞培養(yǎng)技術;污染;措施
1.1細胞原代培養(yǎng)技術
細胞的原代培養(yǎng)是指取樣完成后的第一次培養(yǎng)實驗,它能夠在細胞分化、藥物測試或病毒試驗等方面取得顯著培養(yǎng)效果。其技術的應用首先先對提取的樣品組織進行清洗,然后將其切成較小組織塊,可在1或2mm,再給予分散劑擴大組織塊,時間1小時或半小時,之后進行吹打,并在混勻后利用過濾網濾過,將細胞與細胞團離心出來,放在對應濃度的培養(yǎng)基上,調整好培養(yǎng)箱,溫度在37攝氏度,二氧化碳在5%,將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中開始培養(yǎng)實驗,此技術的試驗成功率很高。
1.2細胞傳代培養(yǎng)技術
傳代培養(yǎng)的應用是在離體細胞生長一定時間后,當其發(fā)生分裂且增殖逐漸緩慢或要終止生長死亡前,從一個培養(yǎng)瓶按一定比率轉移到另一個培養(yǎng)瓶內繼續(xù)培養(yǎng)和生殖的方法,這種方法被稱作傳代培養(yǎng)技術。此技術的應用首先將原舊培養(yǎng)液吸出,取PBS緩沖液對其進行兩次沖洗,然后取胰蛋白酶液滴入其中給予消化處理,之后利用顯微鏡進行查看,待細胞恢復飽滿樣時,將胰酶液吸出后再將新鮮血清培養(yǎng)基加入到瓶中,避免細胞粘壁進行吹打,并將其分裝于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),保證培養(yǎng)液充分并使細胞均勻浮于上面,之后加強觀察,一旦又出現(xiàn)細胞分裂到一定程度時再給予傳代培養(yǎng)。
1.3細胞凍存技術
細胞的凍存可以有效保證細胞活性和長期保存,一般在~80攝氏度的冷存環(huán)境下細胞可儲存一年的時間,若在液氮環(huán)境下,~196攝氏度中能夠長期保存,直至使用,也有相關學者表明,長期保存的牙髓成纖維細胞,其使用率及成活率在80%以上。這種凍存技術的操作中,在細胞凍存前應該先對對數(shù)細胞進行培養(yǎng)液培養(yǎng),然后將其去除,再投入消化液、離心,離心后將上清液去除,加入凍存液,待細胞密度適度調整以后,取懸液細胞并分別裝在凍存管中,封閉,明確寫明細胞名稱、代數(shù)、凍存時間等,先于4攝氏度存放半小時,再移入~20攝氏度冷箱內凍一小時,之后放在~80攝氏度凍箱內凍存24小時,最后可置于電子技術控制的冰凍箱中長久存儲。
1.4細胞的復蘇技術
細胞復蘇技術的應用主要是對凍存細胞進行復蘇,促使其恢復活性,當凍存管從液氮環(huán)境中取出后,馬上放入準備好的37攝氏度水環(huán)境中進行快速、反復晃動,晃致凍存液徹底融化為止,然后將融化后的細胞置入離心管內,取4ml培養(yǎng)液漸漸滴入其中,用每分鐘1000轉速度離心,然后在細胞沉淀以后進行密度調整,再行細胞培養(yǎng)。
2.1微生物
微生物在生活環(huán)境中是無處不在的,無論是靜止物體,還是人們皮膚表層、動物皮毛等,其表面均存在細菌。而在實驗室進行細胞培養(yǎng)時,如果工作人員對微生物學及相關技術不了解或沒有經過嚴格培訓,其操作中會忽視很多細節(jié),造成微生物污染,如細胞培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基、器皿、使用設施、從一處轉移另一處時等,這些操作若不能有效避免,嚴格無菌操作,或在切割時不遵從無菌切開等,均可產生微生物污染。
2.2工作人員
人體是在不斷活動的,在實驗室內工作人員是產生污染的最大來源,細胞培養(yǎng)各種操作都需要工作人員進行,其皮膚鱗屑、活動中帶動空氣或說話時飛沫與口腔內存在的多種微生物等,均可對細胞培養(yǎng)造成污染威脅,而且一旦工作人員攜帶病菌或感染病毒,進入實驗室就是一個高危污染源。同時實驗室的通風口、棚板口、排水口等各種通道也存在不斷產生新污染的危害,像一些水槽、潮濕培養(yǎng)箱等潮濕地方也存在滋生細菌并提供污染的危險。
2.3試劑
細胞培養(yǎng)中試劑的使用同樣存在一定潛在污染概率,購進的試劑及培養(yǎng)基具體的應用要明確,它們有無細菌,具體作用及有無必要進行滅菌等。就如生長因子或血清在培養(yǎng)試驗中,易發(fā)生病毒污染,所以說有的試劑原材料購進時未滅菌,而有的培養(yǎng)基,如豬胰蛋白酶,它含有動物病毒,試驗中會導致細胞培養(yǎng)結果的不準確,因此需要對試劑進行風險評估,確定其使用的可靠,減低試劑使用不當引起的污染。
3.1工作人員和環(huán)境
工作人員進實驗室行細胞培養(yǎng)前必須徹底對手、手臂清潔和消毒,穿戴一次性膠手套、無菌外衣、鞋,扎好袖口;細胞培養(yǎng)前將各種用具放于無菌照射下滅菌30min;各操作必須按照無菌操作流程進行;同時細胞培養(yǎng)試驗臺與培養(yǎng)儲存柜、清潔區(qū)等要保持較遠距離;定期對潮濕區(qū)域檢測,及時給予處理,防止產生污染。
3.2細胞培養(yǎng)的用品和試劑
細胞培養(yǎng)中涉及的各種如試管、過濾器等用品,使用前均進行酒精噴擦,酒精度80%;使用的一次性無菌塑料用品開封后必須單獨存放;試驗中試劑瓶打開后,將蓋口向下置于無菌臺上,關蓋前必須用酒精燈烤后在蓋嚴;試劑的選購嚴格檢驗生產日期、批次等,對一些沒有滅菌的試劑進行評估確定后再使用等。
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