孫偉(吉林省五星動(dòng)物保健藥廠,吉林 長(zhǎng)春 130062)
細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)方法及避免污染的措施
孫偉(吉林省五星動(dòng)物保健藥廠,吉林長(zhǎng)春130062)
醫(yī)學(xué)研究中最具技術(shù)含量的研究手段就是細(xì)胞培養(yǎng),同時(shí)它還是生物學(xué)研究中應(yīng)用比較廣泛的一種方法。下面本文就細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)方法進(jìn)行分析,觀察其操作中引發(fā)污染的情況,同時(shí)提出幾點(diǎn)避免污染的措施,內(nèi)容如下。
細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù);污染;措施
1.1細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)
細(xì)胞的原代培養(yǎng)是指取樣完成后的第一次培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),它能夠在細(xì)胞分化、藥物測(cè)試或病毒試驗(yàn)等方面取得顯著培養(yǎng)效果。其技術(shù)的應(yīng)用首先先對(duì)提取的樣品組織進(jìn)行清洗,然后將其切成較小組織塊,可在1或2mm,再給予分散劑擴(kuò)大組織塊,時(shí)間1小時(shí)或半小時(shí),之后進(jìn)行吹打,并在混勻后利用過(guò)濾網(wǎng)濾過(guò),將細(xì)胞與細(xì)胞團(tuán)離心出來(lái),放在對(duì)應(yīng)濃度的培養(yǎng)基上,調(diào)整好培養(yǎng)箱,溫度在37攝氏度,二氧化碳在5%,將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中開(kāi)始培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),此技術(shù)的試驗(yàn)成功率很高。
1.2細(xì)胞傳代培養(yǎng)技術(shù)
傳代培養(yǎng)的應(yīng)用是在離體細(xì)胞生長(zhǎng)一定時(shí)間后,當(dāng)其發(fā)生分裂且增殖逐漸緩慢或要終止生長(zhǎng)死亡前,從一個(gè)培養(yǎng)瓶按一定比率轉(zhuǎn)移到另一個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)繼續(xù)培養(yǎng)和生殖的方法,這種方法被稱(chēng)作傳代培養(yǎng)技術(shù)。此技術(shù)的應(yīng)用首先將原舊培養(yǎng)液吸出,取PBS緩沖液對(duì)其進(jìn)行兩次沖洗,然后取胰蛋白酶液滴入其中給予消化處理,之后利用顯微鏡進(jìn)行查看,待細(xì)胞恢復(fù)飽滿樣時(shí),將胰酶液吸出后再將新鮮血清培養(yǎng)基加入到瓶中,避免細(xì)胞粘壁進(jìn)行吹打,并將其分裝于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),保證培養(yǎng)液充分并使細(xì)胞均勻浮于上面,之后加強(qiáng)觀察,一旦又出現(xiàn)細(xì)胞分裂到一定程度時(shí)再給予傳代培養(yǎng)。
1.3細(xì)胞凍存技術(shù)
細(xì)胞的凍存可以有效保證細(xì)胞活性和長(zhǎng)期保存,一般在~80攝氏度的冷存環(huán)境下細(xì)胞可儲(chǔ)存一年的時(shí)間,若在液氮環(huán)境下,~196攝氏度中能夠長(zhǎng)期保存,直至使用,也有相關(guān)學(xué)者表明,長(zhǎng)期保存的牙髓成纖維細(xì)胞,其使用率及成活率在80%以上。這種凍存技術(shù)的操作中,在細(xì)胞凍存前應(yīng)該先對(duì)對(duì)數(shù)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)液培養(yǎng),然后將其去除,再投入消化液、離心,離心后將上清液去除,加入凍存液,待細(xì)胞密度適度調(diào)整以后,取懸液細(xì)胞并分別裝在凍存管中,封閉,明確寫(xiě)明細(xì)胞名稱(chēng)、代數(shù)、凍存時(shí)間等,先于4攝氏度存放半小時(shí),再移入~20攝氏度冷箱內(nèi)凍一小時(shí),之后放在~80攝氏度凍箱內(nèi)凍存24小時(shí),最后可置于電子技術(shù)控制的冰凍箱中長(zhǎng)久存儲(chǔ)。
1.4細(xì)胞的復(fù)蘇技術(shù)
細(xì)胞復(fù)蘇技術(shù)的應(yīng)用主要是對(duì)凍存細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇,促使其恢復(fù)活性,當(dāng)凍存管從液氮環(huán)境中取出后,馬上放入準(zhǔn)備好的37攝氏度水環(huán)境中進(jìn)行快速、反復(fù)晃動(dòng),晃致凍存液徹底融化為止,然后將融化后的細(xì)胞置入離心管內(nèi),取4ml培養(yǎng)液漸漸滴入其中,用每分鐘1000轉(zhuǎn)速度離心,然后在細(xì)胞沉淀以后進(jìn)行密度調(diào)整,再行細(xì)胞培養(yǎng)。
2.1微生物
微生物在生活環(huán)境中是無(wú)處不在的,無(wú)論是靜止物體,還是人們皮膚表層、動(dòng)物皮毛等,其表面均存在細(xì)菌。而在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),如果工作人員對(duì)微生物學(xué)及相關(guān)技術(shù)不了解或沒(méi)有經(jīng)過(guò)嚴(yán)格培訓(xùn),其操作中會(huì)忽視很多細(xì)節(jié),造成微生物污染,如細(xì)胞培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基、器皿、使用設(shè)施、從一處轉(zhuǎn)移另一處時(shí)等,這些操作若不能有效避免,嚴(yán)格無(wú)菌操作,或在切割時(shí)不遵從無(wú)菌切開(kāi)等,均可產(chǎn)生微生物污染。
2.2工作人員
人體是在不斷活動(dòng)的,在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)工作人員是產(chǎn)生污染的最大來(lái)源,細(xì)胞培養(yǎng)各種操作都需要工作人員進(jìn)行,其皮膚鱗屑、活動(dòng)中帶動(dòng)空氣或說(shuō)話時(shí)飛沫與口腔內(nèi)存在的多種微生物等,均可對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)造成污染威脅,而且一旦工作人員攜帶病菌或感染病毒,進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室就是一個(gè)高危污染源。同時(shí)實(shí)驗(yàn)室的通風(fēng)口、棚板口、排水口等各種通道也存在不斷產(chǎn)生新污染的危害,像一些水槽、潮濕培養(yǎng)箱等潮濕地方也存在滋生細(xì)菌并提供污染的危險(xiǎn)。
2.3試劑
細(xì)胞培養(yǎng)中試劑的使用同樣存在一定潛在污染概率,購(gòu)進(jìn)的試劑及培養(yǎng)基具體的應(yīng)用要明確,它們有無(wú)細(xì)菌,具體作用及有無(wú)必要進(jìn)行滅菌等。就如生長(zhǎng)因子或血清在培養(yǎng)試驗(yàn)中,易發(fā)生病毒污染,所以說(shuō)有的試劑原材料購(gòu)進(jìn)時(shí)未滅菌,而有的培養(yǎng)基,如豬胰蛋白酶,它含有動(dòng)物病毒,試驗(yàn)中會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果的不準(zhǔn)確,因此需要對(duì)試劑進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,確定其使用的可靠,減低試劑使用不當(dāng)引起的污染。
3.1工作人員和環(huán)境
工作人員進(jìn)實(shí)驗(yàn)室行細(xì)胞培養(yǎng)前必須徹底對(duì)手、手臂清潔和消毒,穿戴一次性膠手套、無(wú)菌外衣、鞋,扎好袖口;細(xì)胞培養(yǎng)前將各種用具放于無(wú)菌照射下滅菌30min;各操作必須按照無(wú)菌操作流程進(jìn)行;同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)臺(tái)與培養(yǎng)儲(chǔ)存柜、清潔區(qū)等要保持較遠(yuǎn)距離;定期對(duì)潮濕區(qū)域檢測(cè),及時(shí)給予處理,防止產(chǎn)生污染。
3.2細(xì)胞培養(yǎng)的用品和試劑
細(xì)胞培養(yǎng)中涉及的各種如試管、過(guò)濾器等用品,使用前均進(jìn)行酒精噴擦,酒精度80%;使用的一次性無(wú)菌塑料用品開(kāi)封后必須單獨(dú)存放;試驗(yàn)中試劑瓶打開(kāi)后,將蓋口向下置于無(wú)菌臺(tái)上,關(guān)蓋前必須用酒精燈烤后在蓋嚴(yán);試劑的選購(gòu)嚴(yán)格檢驗(yàn)生產(chǎn)日期、批次等,對(duì)一些沒(méi)有滅菌的試劑進(jìn)行評(píng)估確定后再使用等。
[1]周麗薇.細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與防止細(xì)胞污染的方法[J].醫(yī)學(xué)信息(上旬刊).2010(11).
[2]姜彬.細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)簡(jiǎn)介及避免污染的策略[J].生物學(xué)通報(bào).2008(03).
[3]史嘉林;楊棟.細(xì)胞培養(yǎng)及避免細(xì)胞污染的方法[J].養(yǎng)殖技術(shù)顧問(wèn).2010(07).
[4]馬艷南;閻雪瑩;殷悅;蔡麗杰.細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及避免污染的方法[J].黑龍江科技信息.2014(29).