細胞培養(yǎng)技術(shù)方法及避免污染的措施

孫偉（吉林省五星動物保健藥廠，吉林　長春　130062）

細胞培養(yǎng)技術(shù)方法及避免污染的措施

孫偉（吉林省五星動物保健藥廠，吉林長春130062）

醫(yī)學(xué)研究中最具技術(shù)含量的研究手段就是細胞培養(yǎng)，同時它還是生物學(xué)研究中應(yīng)用比較廣泛的一種方法。下面本文就細胞培養(yǎng)技術(shù)方法進行分析，觀察其操作中引發(fā)污染的情況，同時提出幾點避免污染的措施，內(nèi)容如下。

細胞培養(yǎng)技術(shù)；污染；措施

1　細胞培養(yǎng)技術(shù)方法分析

1.1細胞原代培養(yǎng)技術(shù)

細胞的原代培養(yǎng)是指取樣完成后的第一次培養(yǎng)實驗，它能夠在細胞分化、藥物測試或病毒試驗等方面取得顯著培養(yǎng)效果。其技術(shù)的應(yīng)用首先先對提取的樣品組織進行清洗，然后將其切成較小組織塊，可在1或2mm，再給予分散劑擴大組織塊，時間1小時或半小時，之后進行吹打，并在混勻后利用過濾網(wǎng)濾過，將細胞與細胞團離心出來，放在對應(yīng)濃度的培養(yǎng)基上，調(diào)整好培養(yǎng)箱，溫度在37攝氏度，二氧化碳在5%，將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中開始培養(yǎng)實驗，此技術(shù)的試驗成功率很高。

1.2細胞傳代培養(yǎng)技術(shù)

傳代培養(yǎng)的應(yīng)用是在離體細胞生長一定時間后，當(dāng)其發(fā)生分裂且增殖逐漸緩慢或要終止生長死亡前，從一個培養(yǎng)瓶按一定比率轉(zhuǎn)移到另一個培養(yǎng)瓶內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)和生殖的方法，這種方法被稱作傳代培養(yǎng)技術(shù)。此技術(shù)的應(yīng)用首先將原舊培養(yǎng)液吸出，取PBS緩沖液對其進行兩次沖洗，然后取胰蛋白酶液滴入其中給予消化處理，之后利用顯微鏡進行查看，待細胞恢復(fù)飽滿樣時，將胰酶液吸出后再將新鮮血清培養(yǎng)基加入到瓶中，避免細胞粘壁進行吹打，并將其分裝于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，保證培養(yǎng)液充分并使細胞均勻浮于上面，之后加強觀察，一旦又出現(xiàn)細胞分裂到一定程度時再給予傳代培養(yǎng)。

1.3細胞凍存技術(shù)

細胞的凍存可以有效保證細胞活性和長期保存，一般在～80攝氏度的冷存環(huán)境下細胞可儲存一年的時間，若在液氮環(huán)境下，～196攝氏度中能夠長期保存，直至使用，也有相關(guān)學(xué)者表明，長期保存的牙髓成纖維細胞，其使用率及成活率在80%以上。這種凍存技術(shù)的操作中，在細胞凍存前應(yīng)該先對對數(shù)細胞進行培養(yǎng)液培養(yǎng)，然后將其去除，再投入消化液、離心，離心后將上清液去除，加入凍存液，待細胞密度適度調(diào)整以后，取懸液細胞并分別裝在凍存管中，封閉，明確寫明細胞名稱、代數(shù)、凍存時間等，先于4攝氏度存放半小時，再移入～20攝氏度冷箱內(nèi)凍一小時，之后放在～80攝氏度凍箱內(nèi)凍存24小時，最后可置于電子技術(shù)控制的冰凍箱中長久存儲。

1.4細胞的復(fù)蘇技術(shù)

細胞復(fù)蘇技術(shù)的應(yīng)用主要是對凍存細胞進行復(fù)蘇，促使其恢復(fù)活性，當(dāng)凍存管從液氮環(huán)境中取出后，馬上放入準(zhǔn)備好的37攝氏度水環(huán)境中進行快速、反復(fù)晃動，晃致凍存液徹底融化為止，然后將融化后的細胞置入離心管內(nèi)，取4ml培養(yǎng)液漸漸滴入其中，用每分鐘1000轉(zhuǎn)速度離心，然后在細胞沉淀以后進行密度調(diào)整，再行細胞培養(yǎng)。

2　細胞培養(yǎng)中引起污染產(chǎn)生的原因

2.1微生物

微生物在生活環(huán)境中是無處不在的，無論是靜止物體，還是人們皮膚表層、動物皮毛等，其表面均存在細菌。而在實驗室進行細胞培養(yǎng)時，如果工作人員對微生物學(xué)及相關(guān)技術(shù)不了解或沒有經(jīng)過嚴格培訓(xùn)，其操作中會忽視很多細節(jié)，造成微生物污染，如細胞培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基、器皿、使用設(shè)施、從一處轉(zhuǎn)移另一處時等，這些操作若不能有效避免，嚴格無菌操作，或在切割時不遵從無菌切開等，均可產(chǎn)生微生物污染。

2.2工作人員

人體是在不斷活動的，在實驗室內(nèi)工作人員是產(chǎn)生污染的最大來源，細胞培養(yǎng)各種操作都需要工作人員進行，其皮膚鱗屑、活動中帶動空氣或說話時飛沫與口腔內(nèi)存在的多種微生物等，均可對細胞培養(yǎng)造成污染威脅，而且一旦工作人員攜帶病菌或感染病毒，進入實驗室就是一個高危污染源。同時實驗室的通風(fēng)口、棚板口、排水口等各種通道也存在不斷產(chǎn)生新污染的危害，像一些水槽、潮濕培養(yǎng)箱等潮濕地方也存在滋生細菌并提供污染的危險。

2.3試劑

細胞培養(yǎng)中試劑的使用同樣存在一定潛在污染概率，購進的試劑及培養(yǎng)基具體的應(yīng)用要明確，它們有無細菌，具體作用及有無必要進行滅菌等。就如生長因子或血清在培養(yǎng)試驗中，易發(fā)生病毒污染，所以說有的試劑原材料購進時未滅菌，而有的培養(yǎng)基，如豬胰蛋白酶，它含有動物病毒，試驗中會導(dǎo)致細胞培養(yǎng)結(jié)果的不準(zhǔn)確，因此需要對試劑進行風(fēng)險評估，確定其使用的可靠，減低試劑使用不當(dāng)引起的污染。

3　避免污染的措施

3.1工作人員和環(huán)境

工作人員進實驗室行細胞培養(yǎng)前必須徹底對手、手臂清潔和消毒，穿戴一次性膠手套、無菌外衣、鞋，扎好袖口；細胞培養(yǎng)前將各種用具放于無菌照射下滅菌30min；各操作必須按照無菌操作流程進行；同時細胞培養(yǎng)試驗臺與培養(yǎng)儲存柜、清潔區(qū)等要保持較遠距離；定期對潮濕區(qū)域檢測，及時給予處理，防止產(chǎn)生污染。

3.2細胞培養(yǎng)的用品和試劑

細胞培養(yǎng)中涉及的各種如試管、過濾器等用品，使用前均進行酒精噴擦，酒精度80%；使用的一次性無菌塑料用品開封后必須單獨存放；試驗中試劑瓶打開后，將蓋口向下置于無菌臺上，關(guān)蓋前必須用酒精燈烤后在蓋嚴；試劑的選購嚴格檢驗生產(chǎn)日期、批次等，對一些沒有滅菌的試劑進行評估確定后再使用等。

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