金黃色葡萄球菌Sortase A原核表達純化方法的研究進展

胡義芳，楊朝博，秦松，柳長柏，鄒黎黎，王君

(1.三峽大學人民醫(yī)院細胞治療研究所，湖北 宜昌 443003；2.三峽大學腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002；3.三峽大學人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化神經(jīng)科學&神經(jīng)再生修復實驗室，湖北 宜昌 443002)

·綜 述·

金黃色葡萄球菌Sortase A原核表達純化方法的研究進展

胡義芳1，2，楊朝博1，2，秦松1，2，柳長柏1，2，鄒黎黎1，2，王君1，3

(1.三峽大學人民醫(yī)院細胞治療研究所，湖北 宜昌 443003；2.三峽大學腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002；3.三峽大學人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化神經(jīng)科學&神經(jīng)再生修復實驗室，湖北 宜昌 443002)

眾所周知，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)轉(zhuǎn)肽酶A(Sortase A)在致病中起著不可或缺的作用，已成為重要研究的靶酶。雖然已有多種實驗方法用于Sortase A的原核表達純化，但由于缺乏通用的技術來得到理想的目的蛋白，因此應當結(jié)合使用多種方法以降低誤差。對不同的技術在金黃色葡萄球菌Sortase A原核表達過程的優(yōu)缺點進行比較分析，并針對性地提出比較理想的解決方案，可為Sortase A作為靶酶的研究提供一些參考。

金黃色葡萄球菌；轉(zhuǎn)肽酶A；原核表達；純化

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是一種革蘭氏染色陽性、凝固酶陰性的葡萄球菌[1]。其作為一種主要的人畜共患病病原體，易引起皮膚軟組織感染、敗血癥、心內(nèi)膜炎、肺炎、腸炎、腦膜炎、骨髓炎及中毒性休克綜合征等細菌感染性疾病[2-3]。近年來的流行病學調(diào)查研究顯示，以SA為代表的凝固酶陰性葡萄球菌(Coagulase-negative staphylococci，CoNS)已成為醫(yī)院獲得性感染的一種具有重要臨床意義的主要病原菌[4]。這主要是由于SA對環(huán)境的適應性很強且其基因組具有高度多態(tài)性和可變性，極易產(chǎn)生對抗生素的耐藥性導致的[5]。鑒于近年SA耐藥菌株的產(chǎn)生日益增多，甚至出現(xiàn)了多重耐藥，使得臨床工作中可供選擇的藥物越來越少，急切需要從基因水平去分析這種耐藥現(xiàn)象并找尋新的抗菌靶點，以針對性的治療SA引起的嚴重感染。轉(zhuǎn)肽酶A(Sortase A)最初由Mazmanian等[6]于1999年在金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)，是一種廣泛存在于革蘭氏陽性菌中的保守的管家基因(Housekeeping gene)[7]。它是一種膜結(jié)合轉(zhuǎn)肽酶，將特定的表面蛋白毒性因子錨定到細胞壁肽聚糖上，幫助病原菌逃逸宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視[8-9]?？梢奡ortase A在SA等革蘭氏陽性菌致病過程中發(fā)揮著關鍵性作用。目前，已有大量研究表明，Sortase A是一種重要的毒力因子，在其感染過程中發(fā)揮重要作用，如，Gianfaldoni等[10]研究發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌重組Sortase A蛋白免疫小鼠后能抗肺炎鏈球菌感染；Sortase A缺失，病原菌的致病性將會顯著減弱等[11]。祝令偉等[12]研究發(fā)現(xiàn)，豬鏈球菌2型分選酶srtC5基因敲除突變株的細胞粘附能力和對家兔的致病性都顯著降低；王亞男等[13]通過研究探討發(fā)現(xiàn)蘆丁可能成為Sortase A的潛在抑制劑。因此，Sortase A有望成為新的抗菌靶酶，為日益嚴重的病原菌耐藥性問題提供思路。本文對不同的技術在金黃色葡萄球菌Sortase A原核表達過程的優(yōu)缺點進行比較分析，并針對性地提出比較理想的Sortase A的原核表達純化方法，為轉(zhuǎn)肽酶抑制劑篩選相關的酶學性質(zhì)的研究提供幫助，同時為相關疫苗的發(fā)現(xiàn)提供一些參考。

1 轉(zhuǎn)肽酶的生物學特性

1.1 轉(zhuǎn)肽酶的分類 在GeneBank中查詢可知，轉(zhuǎn)肽酶A幾乎存在于所有的革蘭氏陽性菌中，如肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌、無乳鏈球菌、豬鏈球菌等，且在不同病原菌中其基因數(shù)量不同，功能也有差異。Comfort等[14]對72種轉(zhuǎn)肽酶相關基因組序列進行比對，將其分為5個亞科：SrtA、SrtB、3、4、5，發(fā)現(xiàn)前兩種與SA轉(zhuǎn)肽酶高度同源。后來又有學者Dramsi對61個轉(zhuǎn)肽酶進行分析，建議分為4類，即SrtA、SrtB、SrtC、SrtD，且發(fā)現(xiàn)Sortase A為保守的管家基因[15]。目前轉(zhuǎn)肽酶的分類法是Dramsi分類法。

1.2 Sortase A的結(jié)構(gòu)及功能 Sortase A包含一個N末端信號肽和一個C末端信號肽。C末端又稱為細胞壁分選信號(Cell wall sorting signal，CWSS)[16]，由保守氨基酸序列(LPXTG結(jié)構(gòu)域)、一個疏水區(qū)域和尾部帶電荷的氨基酸殘基組成。Sortase A為Ⅱ型跨膜拓撲結(jié)構(gòu)，N末端在細胞內(nèi)，C末端在細胞外[17]。Sortase A的主要作用是將病原菌的表面蛋白錨定到細胞壁上，使病原菌逃逸宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，為SA的感染提供條件。首先Sortase A幫助表面蛋白前體在信號肽存在條件下進入分泌系統(tǒng)，使疏水區(qū)和帶電殘基固定膜，然后Sortase A通過反應切斷LPXTG序列中的蘇氨酸與甘氨酸間的肽鍵，最后將蘇氨酸殘基連到細胞壁上[18]。鑒于SortaseA在革蘭氏陽性菌中功能的保守性及重要性，將其作為革蘭氏陽性菌抗感染的靶酶，為抗生素耐藥問題提供突破口。

2 金葡菌Sortase A基因的幾種原核表達純化體系研究進展

眾所周知，蛋白的原核表達形式大致有3種：(1)胞外分泌表達，容易純化且不容易被分解，但一般只有少量的蛋白質(zhì)分泌到胞外；(2)周質(zhì)空間表達，有利于蛋白的正確折疊和二硫鍵的形成；(3)胞內(nèi)表達，即包涵體表達，需要變性復性等復雜過程。為了進一步了解Sortase A的免疫原性、功能及作用特點，得到純度高且活性好的Sortase A蛋白，找到適合目的基因表達的原核表達載體至關重要。下面就幾種原核表達載體表達的Sortase A相關蛋白的難易程度及純度活性作分析比較，找出各表達體系的優(yōu)勢所在，得到理想的SASortaseA原核表達純化方法。

2.1 Sortase A在pET22b(+)和pTRX原核表達載體中的表達純化 了解到原核表達載體pET22b(+)攜帶的pelB信號肽可將蛋白輸送到細胞質(zhì)空間，周質(zhì)空間的氧化環(huán)境有利于蛋白的正確折疊及二硫鍵的形成[19]；而原核表達載體pTRX攜帶的分子伴侶硫氧還蛋白(Thioredoxin，TRX)Trx是高度可溶的多肽融合型標簽，可增強目的基因在大腸桿菌中的正確折疊，加強目的蛋白的溶解性表達功能[20]。利用這兩種載體的優(yōu)勢，羅立新等[21]用金黃色葡萄球菌Sortase A基因組全長序列分別與原核表達載體pET22b(+)及pTRX構(gòu)建pET22b-srtA和pTRX-srtA原核表達序列，得到了以包涵體形式表達的pET22b-srtA目的蛋白分子量大小為45 kD，表觀分子量與預期存在差異，可能與其N-末端跨膜區(qū)域有關；得到的可溶性表達的pTRX-srtA目的蛋白分子量大小為39 kD。包涵體形式表達的蛋白，表達量一般比可溶性形式的高，但包涵體蛋白需要經(jīng)過變性和復性等純化過程，不僅耗時耗力，還會導致蛋白生物活性的降低。即使pTRX-srtA是可溶性表達，但純度和活性仍有待提高。此外，pET22b(+)和pTRX載體上沒有利于目的蛋白純化和檢測的相關標簽，進一步增加了純化和檢測的難度。值得注意的是，鑒于pET22b(+)和pTRX載體的局限性，不能避免目的基因Sortase A的N末端膜錨定序列對表達的影響。

2.2 Sortase A在pET32a(+)原核表達載體中的表達純化 鑒于pET22b(+)和pTRX原核表達載體中沒有利于目的蛋白純化和檢測的標簽，而原核表達載體pET32a(+)包含多種融合蛋白標簽，如六聚組氨酸接頭His-tag、S-tag和硫氧還原蛋白接頭Trx-tag，Trx-tag可增強目的蛋白的可溶性，且大多數(shù)情況下不會影響被修飾目的蛋白的免疫原性、結(jié)構(gòu)和功能，6*Hi-tag有利于表達蛋白的純化和檢測。有研究表明Sortase A基因中N端Srt殘基26～59不具有氨基酸保守性，表達出的StrAΔn29和StrAΔn59兩種酶具有相似的生物活性[22]，所以N端切除不保守基因序列不會影響轉(zhuǎn)肽酶的活性。考慮到SortaseA蛋白包涵體表達及表達量不高可能與其N-末端跨膜區(qū)域有關，所以以含有pET22b-SrtA的質(zhì)粒為模板，設計合成引物，PCR擴增缺失N-末端24個和59個氨基酸的轉(zhuǎn)肽酶基因StrAΔn24和StrAΔn59，避免N末端膜錨定序列對表達的影響。朱芳等[23]將構(gòu)建好的pET32a-StrAΔn24和pET32a-StrAΔn59轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，分別在最適溫度30℃和28℃及在異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IsopropyI-β-D-thiogalactoside，IPTG)濃度為0.3 mmol/L條件下誘導5 h，得目的蛋白表達量分別為64.9%和64.2%；用裂解緩沖液(pH 8.0，50 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，0.5%TritonX-100)重懸，超聲破碎，得到絕大部分以可溶性形式存在的目的蛋白；將其超聲破碎離心后的上清液上柱(His Trap HP組氨酸標記的親和層析柱)，在結(jié)合緩沖液A(pH 8.0，20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/LNaCl，20 mmol/L咪唑)；11%、20%和100%及洗滌緩沖液B(pH 8.0，50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑)的作用下洗脫得到分別為42 kD和37 kD的目的蛋白。經(jīng)SDS-PAGE及Western免疫印跡(Western blotting)鑒別分析，得到蛋白純度達95%。在前人的基礎上不斷改進和對目的基因更全面的了解和分析基礎上，可知在避開目的基因N末端的膜錨定序列的同時，用原核表達載體pET32a(+)得到均以可溶性形式表達的且生物活性相似的pET32a-StrAΔn24和pET32a-StrAΔn59目的蛋白。載體pET32a(+)中His-tag使目的蛋白的純化和檢測過程更易進行，更易得到純度更高的目的蛋白。載體pET32a(+)的表達率較高，表達量幾乎達全菌蛋白的三分之二，可得到表達量高且純度高的目的蛋白。雖然pET32a(+)載體上有相應的利于檢測目的蛋白的標簽，但是pET32a-StrAΔn24和pET32a-StrAΔ n59目的蛋白的純化條件不利于蛋白生物活性的保持，對目的蛋白的活性影響比較大。因此，是否有一種原核表達體系，使其純化出來的目的蛋白生物活性更接近于天然蛋白，這樣更有利于進行SA Sortase A抑制劑的篩選。

2.3 Sortase A在pGEX-4T-1原核表達載體中的表達純化 由于pET32a(+)載體上沒有利于目的蛋白保持天然生物活性的相關標簽，而pGEX-4T-1載體上含有谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)標簽，融合表達系統(tǒng)帶有Tac啟動子，可在IPTG誘導作用下實現(xiàn)高效表達；外源基因位于GST下游，不會對啟動子有影響；含有GST標簽可用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠親和層析純化，純化條件比較溫和，使融合蛋白免受胞外蛋白酶的降解，提高了穩(wěn)定性；得到的目的蛋白更接近于天然蛋白，為后續(xù)的酶學實驗提供了良好的基礎。Sortase A的60～206氨基酸殘基是其催化活性區(qū)域[22]?？紤]到GST標簽的優(yōu)勢，可構(gòu)建GST-SrtAΔn59融合蛋白表達載體pGEX-SrtAΔn59，經(jīng)IPTG誘導表達，以期得到純度好活性高的融合蛋白。鄧思等[24]以重組質(zhì)粒pMD20-SrtA為模板，構(gòu)建GST-SrtAΔn59融合蛋白，得到可溶性表達的相對分子量大小為42 kD的目的蛋白，表達量約占菌體總蛋白的40%，經(jīng)親和層析后得到其純度為98%。對pGEX-SrtAΔn59和pET32a-StrA Δn59兩種融合蛋白表達載體誘導的純化重組蛋白活性進行粗略比較，得知pGEX-SrtAΔn59表達純化的重組蛋白活性較高。GST標簽表達的目的蛋白表達率不高，要想得到更多的目的蛋白需要增加工作量。pGEX-4T-1有GST標簽，對相關的目的蛋白的純化和檢測提供方便，更容易得到純度高的目的蛋白。純化的條件比較溫和，對目的蛋白的生物活性影響較小，可以得到更接近于天然蛋白的目的蛋白，活性更高。

綜上可知，pET22b-srtA、pTRX-srtA、pET32a-StrA Δn24、pET32a-StrAΔn59以及pGEX-SrtAΔn59五種表達體系中，僅pET22b-srtA表達的目的蛋白是包涵體形式，需要經(jīng)過變性、復性等復雜過程，極可能影響最終得到的目的蛋白的活性；其余四種均是以可溶性形式表達的，純化過程相對簡單，對蛋白的影響也小些；但pET22b-srtA和pTRX-srtA沒有有效地避開Sortase A的N末端膜錨定序列對表達的影響，目的蛋白的表達率不高；而pET32a-StrAΔn24、pET32a-StrAΔn59和pGEX-SrtAΔn59三種體系均沒有N末端膜錨定序列的影響，表達率明顯得到了提高，且這三個表達體系中都有利于目的蛋白的純化和檢測的相關標簽，進一步降低了純化和檢測的難度。pET32a(+)含有6*Hi-tag標簽，而pGEX-4T-1載體含有的是GST標簽，使pGEX-SrtAΔn59的純化條件更加溫和，得到的目的蛋白更接近于天然蛋白，活性更高。比較理想的金黃色葡萄球菌Sortase A原核表達純化體系是pGEX-SrtAΔn59，得到了表達量高、活性好的目的蛋白GST-SrtAΔn59，給尋找SA感染的治療新方法和新藥研發(fā)奠定基礎，如pGEX-SrtAΔn59已用于探索盆腔炎患者感染大腸埃希菌的新靶點及構(gòu)建篩選模型中[25]。生物活性高的蛋白有利于中藥抑制劑的篩選，更有利于對篩選出的潛在抑制劑進行菌體內(nèi)抑制活性的評價。同時可為SrtA抑制劑的發(fā)現(xiàn)和它們之間構(gòu)效關系的分析奠定基礎。由于單一蛋白的保護效果并不理想，新一代的蛋白疫苗是預防SA感染的未來發(fā)展方向，而我們找出SA較理想的pGEX-SrtAΔn59原核表達體系可為我們提供表達量高、活性好的蛋白，可作為多種SA毒力蛋白聯(lián)合免疫，以擴大其對機體的保護效應，為蛋白抗原聯(lián)合疫苗提供了多種毒力作用的潛在靶標奠定基礎。

3 展望

細菌耐藥問題日益嚴重，給臨床治療帶來眾多不便。研究顯示革蘭氏陽性菌的Sortase A在病原菌致病過程中起著重要作用，是重要研究的靶酶。本文我們對SA SortaseA原核表達純化方法進行了全面的分析，并針對性地提出比較理想的金黃色葡萄球菌Sortase A原核表達純化方法，為Sortase A酶學研究提供一些參考。Sortase A的重組蛋白最初是以包涵體形式表達、表達量低、純度不高且需經(jīng)過變性等過程才能得到；后來經(jīng)過以上對轉(zhuǎn)肽酶的生物學特性以及Sortase A的幾種表達載體表達的融合蛋白的各方面的分析，可知有關Sortase A目的蛋白的原核表達在表達形式、表達率、純化難易度及生物活性等各有突破點。在以后的研究中可以根據(jù)實驗情況選擇相應的融合蛋白表達載體。可為今后研究轉(zhuǎn)肽酶的抑制劑篩選打下良好基礎；可通過抑制Sortase A相關表面蛋白的錨定機理，使病原菌更易被宿主免疫系統(tǒng)識別消滅，為目前的耐藥性問題提供思路；也為今后制備相關疫苗奠定基礎；Sortase A相關蛋白可溶性高效表達可為設計成一種促進可溶性表達標簽提供思路和依據(jù)。

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Progress on the methods for prokaryotic expression and purification of Staphylococcus aureus Sortase A.

HU Yi-fang1,2,YANG Zhao-bo1,2,QIN Song1,2,LIU Chang-bai1,2,ZOU Li-li1,2,WANG Jun1,3.1.Cell Therapy Research Institute,the People's Hospital of China Three Gorges University,Yichang 443003,Hubei,CHINA;2.Hubei Key Laboratory of Tumor Microenvironment and Immunotherapy,China Three Gorges University,Yichang 4430025,Hubei,CHINA;3.Nerve Regeneration&Transformation Laboratory,the People's Hospital of China Three Gorges University,Yichang 443002,Hubei, CHINA

As is well known that Staphylococcus aureus Sortase A plays an essential role in pathogenesis and has become an important target enzyme for research.Although a large number of experimental methods have been applied for the prokaryotic expression and purification of Sortase A,there is no universal method for obtaining the ideal target protein.A variety of methods should be used in conjunction to reduce the errors.This review compares and analyzes the advantages and disadvantages of different methods for prokaryotic expression and purification of Staphylococcus aureus sortase A,and puts forward the ideal solution in order to provide some reference for the research of sortase A as the target enzyme.

Staphylococcus aureus;SortaseA;Prokaryotic expression;Purification

R378.1+1

A

1003—6350（2016）10—1640—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.10.031

2015-09-11)

國家自然科學基金(編號：81201766)；湖北省教育廳基金(編號：Q20151204)；三峽大學醫(yī)學院2015-2016年度大學生科技創(chuàng)新項目(編號：2015YCX041)

王君。E-mail：wangjfox@gmail.com；鄒黎黎。E-mail：zoulili@ctgu.edu.cn