消化系統(tǒng)腫瘤外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究進(jìn)展

施少軍　薛　峰

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院肝臟外科(200127)

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消化系統(tǒng)腫瘤外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究進(jìn)展

施少軍薛峰*

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院肝臟外科(200127)

摘要近年來(lái)，外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)檢測(cè)已作為一項(xiàng)“液相活檢”技術(shù)應(yīng)用于臨床實(shí)踐。CTCs的腫瘤自我播種機(jī)制為探索惡性腫瘤的生長(zhǎng)機(jī)制以及開發(fā)相應(yīng)的腫瘤靶向治療提供了新思路。10年前美國(guó)食品與藥品管理局(FDA)即已批準(zhǔn)將計(jì)數(shù)分析CTCs的CellSearch系統(tǒng)應(yīng)用于臨床監(jiān)控乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌根治術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)。盡管近年來(lái)CTCs分離和檢測(cè)技術(shù)得到了顯著提升，然而在消化系統(tǒng)腫瘤領(lǐng)域，檢測(cè)CTCs的臨床意義尚在研究中。本文就消化系統(tǒng)腫瘤外周血CTCs的研究進(jìn)展作一綜述。

關(guān)鍵詞腫瘤細(xì)胞，循環(huán)；消化系統(tǒng)腫瘤；腫瘤轉(zhuǎn)移；預(yù)后

Research Progress of Peripheral Blood Circulating Tumor Cells in Digestive System Tumors

SHIShaojun,XUEFeng.DepartmentofHepaticSurgery,RenJiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai(200127)

Correspondence to: XUE Feng, Email: fengxue6879@163.com

AbstractRecently, the detection of circulating tumor cells (CTCs) in peripheral blood is used in clinical practice as a form of ‘liquid biopsy’. The self-seeding mechanism of CTCs provides a novel approach to explore the growing mechanism of malignant tumor and developing corresponding targeting therapies. A decade ago, the CellSearch system, which can capture and enumerate CTCs, has been validated by Food and Drug Administration (FDA) as an aid for monitoring the relapse of tumor after radical operation in patients with breast, prostate and colorectal cancer. In recent years, although the separation and detection technique of CTCs has been promoted significantly, the clinical significance of CTCs in tumors of digestive system is still under investigation. This article reviewed the research progress of peripheral blood CTCs in digestive system tumors.

Key wordsNeoplastic Cells, Circulating;Digestive System Neoplasms;Neoplasm Metastasis;Prognosis

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是指自發(fā)或因診療操作從腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進(jìn)入外周血液的腫瘤細(xì)胞。10年前美國(guó)食品與藥品管理局(FDA)即已批準(zhǔn)將計(jì)數(shù)分析CTCs的CellSearch系統(tǒng)應(yīng)用于臨床監(jiān)控乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌根治術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)[1]。CTCs與腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)性的研究在近年亦取得較大進(jìn)展。同時(shí)，CTCs檢測(cè)具有無(wú)創(chuàng)、方便、可重復(fù)等特點(diǎn)，可作為一種“液相活檢”技術(shù)應(yīng)用于臨床實(shí)踐。然而在消化系統(tǒng)腫瘤領(lǐng)域，檢測(cè)CTCs的臨床意義尚在研究中。本文就消化系統(tǒng)腫瘤外周血CTCs的研究進(jìn)展作一綜述。

研究表明，外周血CTCs在腫瘤發(fā)生階段發(fā)揮重要作用。Kim等[2]的研究顯示，CTCs不僅可脫離原發(fā)腫瘤灶轉(zhuǎn)移至其他器官，同時(shí)亦能重新返回并逆向滲透進(jìn)原發(fā)瘤灶，促進(jìn)腫瘤增殖和生長(zhǎng)，增強(qiáng)原發(fā)瘤灶的侵襲性，此過程稱為腫瘤自我播種(tumor self-seeding)。該過程為探索惡性腫瘤的生長(zhǎng)機(jī)制以及開發(fā)相應(yīng)的腫瘤靶向治療提供了新思路。

繼發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移主要包括CTCs脫落入血以及CTCs對(duì)遠(yuǎn)隔器官環(huán)境再適應(yīng)兩個(gè)過程。不同來(lái)源的CTCs轉(zhuǎn)移潛能有所不同。外周血CTCs既可能是直接從病灶脫落入血的上皮特征CTCs，亦可能是經(jīng)歷上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)脫落并存活于血液中的CTCs[3]。研究表明，發(fā)生EMT的乳腺癌細(xì)胞不僅獲得了自我更新能力，同時(shí)亦具備一定的抗凋亡能力[4]，此可能是腫瘤患者對(duì)化學(xué)療法產(chǎn)生耐藥性的原因之一[5]。

CTCs分離和檢測(cè)技術(shù)在近年得到了顯著提升。CTCs在外周血中非常稀少，因此檢測(cè)前需先進(jìn)行CTCs 富集。富集方法基于CTCs的物理性質(zhì)或免疫磁性，目前磁激活細(xì)胞分選(MACS)是最常用的技術(shù)手段[6]。而對(duì)于富集后的CTCs檢測(cè)，目前RT-PCR及其改進(jìn)技術(shù)的應(yīng)用最為廣泛，諸多研究者已成功將其應(yīng)用于惡性黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、胃癌以及結(jié)直腸癌(CRC)等腫瘤的檢測(cè)[7]。

一、食管癌

食管癌是發(fā)生在食管上皮組織的惡性腫瘤，90%以上為食管鱗狀細(xì)胞癌。目前活組織病理學(xué)檢查以及影像學(xué)檢查是食管癌最重要的診斷和分期手段。但采集組織學(xué)標(biāo)本創(chuàng)傷大，患者依從性差；影像學(xué)檢查難以測(cè)及微小腫瘤病灶。近年來(lái)有學(xué)者提出將外周血CTCs作為診斷食管癌分期以及監(jiān)控轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的血清學(xué)指標(biāo)[8]。在食管癌CTCs檢測(cè)方面，多數(shù)研究者選擇癌胚抗原(CEA)作為CTCs的靶基因，其敏感性和特異性較高。Tanaka等[9]提出，將鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCCA)作為CTCs的檢測(cè)靶點(diǎn)，與CEA比較后發(fā)現(xiàn)兩者敏感性和特異性無(wú)顯著差異。

近年來(lái)，關(guān)于食管癌CTCs臨床應(yīng)用的研究多集中于圍手術(shù)期預(yù)后判斷和監(jiān)控方面。Liu等[10]應(yīng)用CEA特異性RT-PCR技術(shù)，對(duì)53例食管癌患者術(shù)前(B-1)、 術(shù)后即時(shí)(B 0)以及術(shù)后3 d(B+3)的外周血進(jìn)行CTCs檢測(cè)，結(jié)果顯示B-1與B 0以及B+3的CEA陽(yáng)性率均具有顯著差異。該研究還認(rèn)為食管癌根治術(shù)是引起腫瘤細(xì)胞脫落入血以及外周血CTCs數(shù)量升高的重要原因，并可能與食管癌微轉(zhuǎn)移相關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為食管癌CTCs可能是來(lái)源于已發(fā)生轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)或其他遠(yuǎn)處微小轉(zhuǎn)移灶[11]，但尚無(wú)確切證據(jù)支持此推測(cè)，需進(jìn)一步研究證實(shí)。

CTCs檢測(cè)對(duì)食管癌放化療的療效監(jiān)測(cè)亦有一定臨床價(jià)值。Yin等[12]對(duì)72 例食管鱗狀細(xì)胞癌患者放療前后的外周血CTCs進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示放療前后CTCs 陽(yáng)性率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及兩年無(wú)進(jìn)展生存期相關(guān)，且CTCs 陽(yáng)性率可反映患者對(duì)放療的敏感性，為治療方案的選擇提供重要依據(jù)。

二、胃癌

胃癌起病隱匿，多數(shù)患者在確診時(shí)已進(jìn)展至晚期階段。目前胃癌診斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn)、腫瘤標(biāo)記物、影像學(xué)以及組織活檢等手段，早期診斷效果不盡人意。近年有學(xué)者提出將外周血CTCs檢測(cè)作為診斷早期胃癌的輔助方法[13]，但其有效性尚存爭(zhēng)議。Tang等[14]對(duì)國(guó)內(nèi)外20項(xiàng)相關(guān)研究行meta分析后認(rèn)為，盡管CTCs陽(yáng)性在確認(rèn)既存胃癌方面有優(yōu)勢(shì)，但其陰性結(jié)果不能作為排除胃癌診斷的有力指標(biāo)，也不能作為胃癌的篩選檢查指標(biāo)。

RT-PCR是目前檢測(cè)胃癌CTCs最常用的技術(shù)，但關(guān)于CTCs標(biāo)記物的選擇仍存在諸多爭(zhēng)議。近年研究以CK-19、CK-20、CEA和hTERT四種標(biāo)記物居多，這四種標(biāo)記物檢測(cè)的準(zhǔn)確性無(wú)顯著差異，多種標(biāo)記物聯(lián)合檢測(cè)可提高敏感性和特異性[15]。此外，原癌基因c-Met和黏蛋白(MUC)亦可作為CTCs檢測(cè)的標(biāo)記物。Uen等[16]證實(shí)c-Met和MUC1特異性RT-PCR技術(shù)在監(jiān)控胃癌早期微轉(zhuǎn)移方面是一項(xiàng)有潛力的技術(shù)。

胃癌CTCs檢測(cè)對(duì)治療方案的指導(dǎo)意義成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。Miyazono等[17]在胃癌根治術(shù)術(shù)前和術(shù)后對(duì)57例胃癌患者外周血進(jìn)行CTCs跟蹤檢測(cè)，結(jié)果顯示CTCs陽(yáng)性患者即使實(shí)施胃癌根治術(shù)，其復(fù)發(fā)率仍較高。研究者認(rèn)為手術(shù)操作是導(dǎo)致癌細(xì)胞進(jìn)入血循環(huán)的直接原因。該研究建議，在行胃癌根治術(shù)時(shí)，阻斷被腫瘤侵染的胃壁血流，夾閉大血管如胃左右動(dòng)脈，并在術(shù)后積極化療，可有效預(yù)防血源性轉(zhuǎn)移。

三、肝細(xì)胞癌(HCC)

HCC是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，侵襲、轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，早期即可侵犯血管甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。目前常用的HCC早期篩查手段包括甲胎蛋白(AFP)和超聲檢查，但AFP的敏感性和特異性均較低；B超過于依賴操作者的個(gè)人判斷，且對(duì)肥胖或肝硬化患者的診斷效果不佳[18]。有研究將外周血CTCs檢測(cè)作為HCC診斷、分期以及監(jiān)測(cè)預(yù)后的輔助手段，以彌補(bǔ)AFP和超聲診斷的不足。Sun等[19]的研究表明，肝切除術(shù)前CTCs數(shù)量≥2個(gè)/7.5 mL是HCC復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，尤其對(duì)于AFP≤400 ng/mL的患者，CTCs數(shù)量對(duì)預(yù)后更加重要。

近年來(lái)關(guān)于上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)(+)CTCs與HCC的關(guān)系存在爭(zhēng)議。EpCAM(+)CTCs具有干細(xì)胞樣特性，如CD133和ABCG2的表達(dá)、EMT過程、Wnt通路激活、高致癌潛能以及低凋亡傾向。此類CTCs具有更強(qiáng)的侵襲性，可能與HCC微轉(zhuǎn)移有關(guān)，患者預(yù)后往往不佳[19-21]。然而，Yamashita等[22]的研究根據(jù)CTCs是否表達(dá)EpCAM以及患者AFP水平，將CTCs分成四個(gè)亞型，分別為EpCAM(+)AFP(-)(A型)，EpCAM(+)AFP(+)(B型)，EpCAM(-)AFP(+)(C型)，EpCAM(-)AFP(-)(D型)。研究者發(fā)現(xiàn)，就預(yù)后而言，B型和C型較差，D型居中，A型較好。該研究同時(shí)證實(shí)Wnt通路在預(yù)后較差的B組更易被激活。由此可見，EpCAM(+)CTCs在預(yù)后評(píng)估方面的臨床應(yīng)用仍有待研究，但此種聯(lián)合分型系統(tǒng)不失為一種有前景的預(yù)后評(píng)估方法。

盡管目前肝移植技術(shù)發(fā)展日益成熟，但對(duì)HCC患者是否適合接受肝移植仍有分歧，最突出的爭(zhēng)議之一為移植后腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。結(jié)合外周血CTCs檢測(cè)技術(shù)，Toso等[23]提出肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)防五步策略：①選擇外周血CTCs基線水平低的受者；②減少術(shù)中釋放入血的CTCs數(shù)量；③防止CTCs的肝內(nèi)再植；④使用抗腫瘤藥物；⑤調(diào)節(jié)針對(duì)HCC清除的免疫反應(yīng)。該方案具體的臨床效果仍有待進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。

四、胰腺癌

胰腺癌是一種侵襲力強(qiáng)的惡性腫瘤，晚期或轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者的中位生存期不甚理想。目前傳統(tǒng)的血清學(xué)指標(biāo)和影像學(xué)手段在指導(dǎo)治療方案選擇、監(jiān)測(cè)治療效果以及判斷復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等方面存在缺陷。近年來(lái)胰腺癌CTCs的相關(guān)研究為解決上述問題提供了新思路。

Torphy等[24]將胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)患者的癌細(xì)胞移植至NSG/NOD小鼠，形成胰腺癌異種移植(PDX)小鼠模型，并給予一種新型靶向藥物BKM120(磷脂酰肌醇3激酶抑制劑)或賦型劑治療，結(jié)果顯示BKM120組小鼠血液中CTCs數(shù)量較賦型劑組明顯減少，進(jìn)一步對(duì)分離出的CTCs行基因突變測(cè)序，發(fā)現(xiàn)CTCs均有KRAS G12V突變，與原發(fā)腫瘤灶相吻合。由此可見，CTCs突變分析以及對(duì)CTCs數(shù)量持續(xù)監(jiān)測(cè)，可以作為評(píng)估PDAC化療效果的手段。

局部進(jìn)展期胰腺癌(LAPC)患者由于確診時(shí)腫瘤已局部擴(kuò)散至主要?jiǎng)用}(腹主動(dòng)脈和腸系膜上動(dòng)脈)，因此腫瘤無(wú)法徹底切除，但尚無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的征象。目前此類型胰腺癌患者的治療策略頗具爭(zhēng)議，焦點(diǎn)主要集中于全身系統(tǒng)性化療以及局部放療的選擇。Bidard等[25]通過一項(xiàng)多中心隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，對(duì)LAPC患者接受化療前后的血液CTCs進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CTCs陽(yáng)性是LAPC患者總生存率的一項(xiàng)獨(dú)立預(yù)后因素，提示對(duì)于LAPC患者，CTCs檢測(cè)可作為評(píng)估LAPC預(yù)后的指標(biāo)。

五、CRC

CRC是世界第三大常見惡性腫瘤，目前多使用CEA作為CRC腫瘤指標(biāo)，但對(duì)于CRC 轉(zhuǎn)移(mCRC)的患者，CEA的有效性頗具爭(zhēng)議[26-27]。有研究者建議對(duì)于mCRC患者可采用CTCs檢測(cè)取代CEA篩查。Aggarwal等[27]在一項(xiàng)多中心前瞻性研究中，對(duì)217例mCRC患者在接受化療前以及化療20周后的外周血CTCs數(shù)量和CEA水平進(jìn)行持續(xù)性監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示在化療進(jìn)行6~12周時(shí)，相較于CEA，CTCs≥3個(gè)/7.5 mL預(yù)測(cè)患者總生存期的有效性更為穩(wěn)定。

研究[28]顯示，部分mCRC患者對(duì)化療的耐藥性可能與KRAS、BRAF基因突變有關(guān)。該研究對(duì)mCRC患者外周血CTCs測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，CTCs的KRAS和BRAF基因突變率與原發(fā)灶以及轉(zhuǎn)移灶基本符合，提示通過外周血CTCs單細(xì)胞基因測(cè)序可預(yù)測(cè)化療療效，指導(dǎo)個(gè)體化治療。

細(xì)胞角蛋白(cytokeratin, CK)、EpCAM是目前CRC常用的CTCs標(biāo)記物。EMT是CRC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)，但該過程會(huì)導(dǎo)致CK、EpCAM表達(dá)下降，從而影響CTCs的檢測(cè)和捕獲率[29]。Yokobori等[30]的研究發(fā)現(xiàn)，CTCs標(biāo)記物網(wǎng)質(zhì)3(plastin3, PLS3)在mCRC細(xì)胞中的表達(dá)不受EMT過程影響，可有效代替CK和EpCAM用于CTCs的檢測(cè)。Lyberopoulou等[31]的研究顯示，PLS3檢測(cè)有助于新型無(wú)創(chuàng)診斷技術(shù)的發(fā)展，同時(shí)也擴(kuò)大了針對(duì)癌癥患者進(jìn)行個(gè)體化治療的規(guī)模。

六、結(jié)語(yǔ)

CTCs檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)在于安全、無(wú)創(chuàng)，可在疾病進(jìn)展的任意時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行療效監(jiān)測(cè)和病情評(píng)估。根據(jù)現(xiàn)有研究，我們對(duì)CTCs可能的臨床應(yīng)用方向作出以下總結(jié)：①評(píng)估和預(yù)測(cè)患者腫瘤進(jìn)展以及復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移；②患者的分層、分級(jí)管理以及實(shí)時(shí)跟蹤治療效果；③探索治療靶點(diǎn)和抗腫瘤藥物耐受機(jī)制；④明確腫瘤患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移機(jī)制。CTCs作為早期癌癥的篩選指標(biāo)尚缺乏有力證據(jù)，可能與早期癌癥無(wú)轉(zhuǎn)移灶或CTCs入血量少有關(guān)。

此外，對(duì)于消化系統(tǒng)腫瘤CTCs，單細(xì)胞分析技術(shù)已成為一種熱門的研究手段。通過基因測(cè)序有助于探索腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制，甚至有望找到更多有效的治療靶點(diǎn)，耐藥性基因的定位亦能夠有效地指導(dǎo)臨床醫(yī)師進(jìn)行抗腫瘤治療。此外，消化系統(tǒng)腫瘤異質(zhì)性明顯，檢測(cè)CTCs時(shí)需選擇特定的CTCs標(biāo)記物，目前常用的標(biāo)記物尚不能滿足對(duì)檢測(cè)準(zhǔn)確度的要求，因此有待尋找新的標(biāo)記物或聯(lián)合使用多種標(biāo)記物以提高CTCs的檢出率和準(zhǔn)確性。

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(2015-05-02收稿；2015-05-16修回)

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.02.011

*本文通信作者, Email: fengxue6879@163.com