非編碼RNA在生殖調(diào)節(jié)中的研究進展

杜琛，徐琰琪，陳秀娟

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·綜述·

非編碼RNA在生殖調(diào)節(jié)中的研究進展

杜琛，徐琰琪，陳秀娟△

非編碼RNA（ncRNAs）在高等生物體內(nèi)大量存在，組成十分復雜的生物調(diào)控網(wǎng)絡，是目前生物醫(yī)學領域的研究熱點。小干擾RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）和PIWI相互作用RNA（piRNA）作為細胞內(nèi)基因調(diào)控網(wǎng)絡的重要成員影響細胞的各種生命活動。近年研究表明，ncRNA通過沉默轉座元件和調(diào)控編碼基因等方式在生殖細胞發(fā)育、分化、凋亡及激素合成的調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，ncRNA的異常表達與多囊卵巢綜合征（PCOS）和卵巢功能早衰（POF）等生殖疾病密切相關。綜述ncRNA在卵泡和胚胎發(fā)育以及精子生成等方面的作用及其研究進展。

RNA，小分子干擾；微RNAs；生殖細胞；卵巢疾??；非編碼RNA；PIWI相互作用RNA

【Abstract】Non-coding RNAs（ncRANs），abounding in higher organisms，form a very complex network of biological regulation，which is the hotspot of biomedicine in recent years.Three kinds of ncRANs，small interfering RNA（siRNA），microRNA（miRNA）and PIWI-interacting RNA（piRNA），are importantmembers of this regulating network.Recent studies showed that ncRNAs play key regulatory roles in the development，differentiation and apoptosis of germ cells during gametogenesis and the steroidogenesis by the machinery silence transposable elements and their regulating effects on the expression of target genes.Ovarian dysfunction such as polycystic ovary syndrome（PCOS）and premature ovarian failure（POF）could be related with the aberrant regulation of ncRNAs.In this paper，we summarized the research progress of ncRNAs in follicular development，spermatogenesis and embryonic development.

【Keywords】RNA，small interfering；MicroRNAs；Germ cells；Ovarian diseases；Non-coding RNA；PIWI-interactingRNA

（JIntReprod Health/Fam Plan，2016，35：344-347）

基金項目：內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學資金（2015BS0802）

作者單位：010050呼和浩特，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科

通信作者：陳秀娟，E-mail：90098687@sina.com

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審校者

生物體內(nèi)的RNA可以分為兩大類：編碼RNA和非編碼RNA（non-coding RNAs，ncRNAs）。ncRNA是指不翻譯成蛋白質(zhì)但能夠調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成的RNA分子片段。大規(guī)模的基因表達和芯片研究發(fā)現(xiàn)，人類基因組中約有50%的DNA轉錄為RNA，而其中只有約2%的RNA翻譯為蛋白質(zhì)，剩余的98%為ncRNAs，其分布廣泛，組成了十分復雜的生物調(diào)控網(wǎng)絡，直接參與mRNA降解、翻譯阻遏和異染色質(zhì)的形成等生命過程，對胚胎發(fā)育、器官形成和組織分化等基本生命活動有重要的調(diào)控作用，并與一些重要疾?。ㄈ绨┌Y、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等）有關［1］。至今共發(fā)現(xiàn)了三類ncRNA：小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）和PIWI相互作用RNA（PIWI-interacting RNA，piRNA）。Argonaute（AGO）蛋白家族編碼PIWI、PAZ和MID區(qū)域，進一步分為Ago 和piwi亞家族［2］。PIWI蛋白主要表達于生殖細胞和與生殖腺相關的體細胞內(nèi)，在動物生殖發(fā)育分化過程中發(fā)揮重要作用。生物信息學研究發(fā)現(xiàn)真核細胞中約有數(shù)千條ncRNAs，這對揭示基因表達調(diào)控規(guī)律、提高人類疾病防治能力及探索生物進化規(guī)律有重要意義［3］。

1　siRNA

siRNA或沉默RNA（silencing RNA），產(chǎn)生于長鏈互補的雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA），5’端和3’端分別被單磷酸和2’-O-甲基化修飾。通過高通量轉錄組分析發(fā)現(xiàn)哺乳動物可以產(chǎn)生內(nèi)源性siRNA（endo-siRNA），且主要表達于卵母細胞內(nèi)，是廣泛存在于各種真核生物中重要的內(nèi)源調(diào)控RNA［4］。2007年Sijen等［5］提出次級siRNA（secondary siRNA）是一種特殊的小RNA群體，序列起始于初級siRNA的下游核苷，在表達錯配單核苷酸初級siRNA的細胞系中并不復制這種錯配，但包含mRNA互補核苷。

Endo-siRNA主要來源于假基因，結合于轉座子位點，在體細胞表達很少，主要在卵母細胞和早期植入的胚胎表達，由于其作用的靶標難以確定，研究還在不斷探索中［6-7］。最近研究發(fā)現(xiàn)在小鼠睪丸生殖細胞中也有siRNA。此外，也可通過多種轉染技術將siRNA導入細胞內(nèi)，對特定基因進行專一性敲除，這使得siRNA成為研究基因功能和藥物靶標的一個重要工具。通過siRNA干擾載體轉染小鼠睪丸支持細胞，進一步驗證尿激酶型纖溶酶原激活因子（uPA）在精子發(fā)生、成熟、運動和受精等一系列過程中具有重要作用。Song等［8］研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠生殖細胞中轉染Rhox3干擾載體，小鼠出現(xiàn)精子發(fā)生缺陷。微陣列分析發(fā)現(xiàn)，造成這種缺陷可不依賴于RHOX3基因的降解，表明轉染到小鼠生殖細胞中的干擾載體同時啟動了miRNA及endo-siRNA信號機制。在卵母細胞減數(shù)分裂的過程中，endo-siRNA與Dicer和Ago2蛋白一樣發(fā)揮重要作用，兩者表達的異常都可造成減數(shù)分裂缺陷［9-10］。在敲除dicer和ago2的突變卵母細胞中發(fā)現(xiàn)由生物信息學預測的endo-siRNA靶基因Ran-GAP和Ppp4rl的表達量上升2～4倍，并出現(xiàn)紡錘體缺陷，表明endo-siRNA在卵母細胞中對維持細胞骨架有一定作用。

2　m iRNA

miRNA是在真核生物中廣泛存在的一類內(nèi)源性具有調(diào)控功能的小分子RNA，根據(jù)生物途徑不同分為典型miRNA和非典型miRNA。首先轉錄為原始miRNA轉錄本（primary transcripts，pri-miRNA）形成分子內(nèi)莖環(huán)結構，之后被DGCR8識別剪切轉運至胞質(zhì)中。miRNA的表達具有時序性和組織特異性，解螺旋后其正義鏈與AGO和GW182蛋白家族結合后作用于靶mRNA 3’非翻譯區(qū)（3’UTR），通過翻譯促進、翻譯抑制和mRNA降解實現(xiàn)對基因的調(diào)控［11］。

2.1m iRNA對卵泡發(fā)育的影響基因表達分析研究發(fā)現(xiàn)miRNA對維持生殖能力和生殖細胞發(fā)育分化過程有重要作用。在小鼠2-細胞期敲除Dicer1后，miRNA和endo-siRNA的表達量也隨之降低，并出現(xiàn)紡錘體和染色體異常，進一步通過Zp3-Cre敲除Dgcr8基因，發(fā)現(xiàn)在卵母細胞中沒有任何miRNA的表達，證明miRNA在卵母細胞發(fā)育的早期具有重要作用［12］。目前，利用高通量測序技術已構建多個哺乳動物卵巢miRNA表達譜，其表達模式存在著一定的差異性和特異性，且呈現(xiàn)動態(tài)變化，有些miRNA在多個物種的卵巢中均有表達，如miR-21、miR-126、miR-143、miR-145及l(fā)et-7家族等，這些miRNA的靶基因在哺乳動物卵巢中主要涉及細胞周期調(diào)控、細胞增殖分化和內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病等信號通路。特定卵巢組織miRNA的研究也陸續(xù)開展，如卵母細胞、顆粒細胞和黃體等組織。Assou等［13］利用高通量測序方法研究發(fā)現(xiàn)，miR-184、miR-100和miR-10A在女性成熟卵母細胞中的表達量最高，而miR-29a、miR-30d、miR-21和miR-93等則特異性地表達于卵丘細胞中。同年，Sang等［14］在人卵泡液中發(fā)現(xiàn)14種高表達的miRNA。對小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，注射黃體生成激素/人絨毛膜促性腺激素（LH/hCG）后顆粒細胞中miR-132和miR-212的表達量顯著升高，表明miRNA是在翻譯后水平發(fā)揮主要調(diào)控功能。卵泡閉鎖受一系列旁分泌因子的調(diào)控，對小鼠卵巢的研究發(fā)現(xiàn)miR-22通過下調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）的表達抑制顆粒細胞的凋亡［15］。miR-93在多囊卵巢綜合征（PCOS）患者中高表達，其靶基因DNKN1促進細胞增殖，胰島素可以促進miR-93的表達，這對PCOS患者顆粒細胞功能障礙的研究提供了新的思路［16］。目前關于miRNA在黃體形成和退化中的研究不多，在小鼠中抑制Dicer1的表達，導致黃體形成受損，不能維持妊娠，miR-17-5P 和let-7b表達下調(diào)。

2.2m iRNA對雄性生育能力的影響利用miRNA基因芯片技術及小RNA深度測序技術，發(fā)現(xiàn)miRNA在參與精原干細胞分化、精母細胞減數(shù)分裂和精子變態(tài)過程中發(fā)揮重要作用。對比男性不育患者與健康男性精液的miRNA發(fā)現(xiàn)，有52個差異miRNA，其中21個miRNA過量高表達，31個miRNA表達水平顯著下降［17］。最近研究發(fā)現(xiàn)，miR-233可能通過抑制過渡蛋白2（TNP2）及精子發(fā)育過程中蛋白質(zhì)的表達導致精子變形［18］。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-92基因簇包含6種不同的成熟miRNA，在小鼠中靶向破壞基因簇可導致睪丸嚴重萎縮，這種表型是由于精原細胞和精原干細胞的數(shù)量減少所致。miR-146的表達影響精原細胞轉錄本的水平，體外研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-146后，細胞往往不能正常分化為精子，并出現(xiàn)細胞凋亡［19］。miRNA作為內(nèi)源基因調(diào)控因子影響蛋白穩(wěn)定性，參與精子DNA的損傷應答機制。

3　piRNA

2006年，在果蠅、小鼠、大鼠和人等物種生殖系細胞中發(fā)現(xiàn)了一類特異地與PIWI家族蛋白質(zhì)相互作用的新型小分子RNA，命名為piRNA。piRNA的5’端有很強的尿嘧啶（U）偏好性，3’端被2’-O-Me修飾，以保護其免受核酸外切酶降解［20-21］。piRNA信號通路是另一特殊的RNA干擾機制，由于其序列和分子作用機制的特異性，piRNA主要存在于胚胎、雌性和雄性生殖系中，在精子形成過程中有沉默逆轉錄轉座子的特定作用［22］。小鼠基因組編碼3種PIWI蛋白：PIWIL1/MIWI、PIWIL2/MILI和PIWIL4/MIWI2。這3種蛋白主要表達于雄性生殖細胞內(nèi)，在精子發(fā)生過程中呈現(xiàn)連續(xù)性和重復性的表達模式。哺乳動物中，piRNA根據(jù)表達時間不同分為3類，通過深度測序分析發(fā)現(xiàn)這3種piRNA在序列結構上有很大的差異，其來源于不同的染色體位點，呈線性不對稱結構。對小鼠、果蠅等物種的研究推測，piRNA分子可能通過“初級加工”和“乒乓循環(huán)”途徑，在擴增產(chǎn)生大量piRNA的同時，切割了大量來源于轉座元件轉錄產(chǎn)物的piRNA，以維持生殖系自身基因組的穩(wěn)定性和完整性［23］。

3.1piRNA對生殖功能的影響PIWI通路主要作用于精母細胞減數(shù)分裂和單倍體精子形成這兩個時期，突變發(fā)生在前者導致精母細胞停滯在雙線期，染色體聯(lián)會出現(xiàn)異常，這是由于逆轉錄轉座子活性升高導致全基因DNA損傷。如果突變發(fā)生于之后的精子形成時期，其表現(xiàn)沒有前者明顯。在精子發(fā)生過程中piRNA序列發(fā)生一系列變化，主要分為前粗線期piRNA，在新出生小鼠的睪丸組織中有較高表達，粗線期piRNA主要表達于精子形成過程中的減數(shù)分裂時期［24］。對果蠅的研究發(fā)現(xiàn)，突變可以導致星狀蛋白（Stellate protein）表達異常，進而影響雄性果蠅的生育能力。敲除su（Ste）后所致的piRNA缺失可以引起星狀蛋白水平升高，且顯著高于其mRNA的水平，說明piRNA對其調(diào)控是通過轉錄后降解途徑發(fā)生的。

3.2piRNA對維持生殖干細胞的影響Piwi蛋白是一個表觀遺傳調(diào)控因子，在生殖細胞發(fā)育、干細胞自我更新和轉座子沉默上具有重要功能。在多細胞生物中，原始生殖細胞是最早分化出來的一群細胞，遷移至生殖嵴后稱之為生殖干細胞［25］。在胚胎期睪丸組織中Piwil2/Mili與Piwil4/Miwi2協(xié)同作用保護原始生殖細胞的穩(wěn)定。在果蠅屬中首次發(fā)現(xiàn)piwi蛋白介導的分子機制不同而出現(xiàn)不同的生物學功能。Tudor結構域蛋白（TSN）有5個結合位點，高表達于胚胎和成體性腺中。小鼠PIWI蛋白突變導致TSN突變，精子發(fā)生過程出現(xiàn)異常，減數(shù)分裂時期胞質(zhì)分裂缺陷，最終導致雄性不育［26］。小RNA分子作為“配體”調(diào)控其結合蛋白泛素化修飾，為蛋白泛素化修飾提供了全新的調(diào)控模式。除了激活干細胞活性相關基因外，piRNA通路能夠保護端粒的完整性，而端粒穩(wěn)定存在是維持干細胞特性的基本條件。

3.3piRNA對卵子發(fā)生的影響在果蠅卵巢，piRNA的基因定位于端粒偏中心位置和端粒位點。piRNA作用途徑中相關的蛋白發(fā)生突變，導致卵子發(fā)育受阻。ziwi和zili基因突變的雄性斑馬魚是正?？捎?，但該突變會影響雌性斑馬魚卵子發(fā)育過程，使卵子停滯在減數(shù)分裂1期，導致不孕。然而小鼠在卵母細胞敲除piwi后未出現(xiàn)明顯表型，這可能是由于卵子發(fā)育在不同物種之間存在差異［27］。在獼猴和牛中發(fā)現(xiàn)piRNA在雌性生殖細胞中的功能與在睪丸中相似。最近通過高通量測序得到人類卵母細胞發(fā)育和胚胎發(fā)生時期PIWIL1、PIWIL2和PIWIL3的動態(tài)表達模式［28］。

4　ncRNA與生殖系統(tǒng)疾病

由于miRNA在生殖系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)控功能，miRNA的缺失或異常表達很可能會導致生殖系統(tǒng)疾病。通過逆轉錄-定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測到miR-505結合在靶基因轉化生長因子（TGF）3’UTR區(qū)，其表達量在子宮內(nèi)膜癌組低于正常組［29］。子宮肌瘤與正常子宮肌層之間miRNA的表達差異明顯，且隨著肌瘤大小的變化，miRNA表達譜也發(fā)生相應的變化。研究發(fā)現(xiàn)miR-132和miR-320 在PCOS患者卵巢內(nèi)的表達量低于正常婦女。miR-93，miR-133，miR-223的靶基因是葡萄糖轉運蛋白4 （GLUT4），在PCOS患者組織中的表達量極高。最近研究發(fā)現(xiàn)，在PCOS患者卵泡液中有7個miRNA的表達量下調(diào)，且參與類固醇的生成，其中miR-132和miR-320參與調(diào)節(jié)雌二醇，miR-24、miR-193b調(diào)控體內(nèi)孕酮水平。有5個miRNA在PCOS患者卵泡液中過表達，其靶基因胰島素受體底物2（IRS-2）降低，在小鼠中該基因的降低會導致排卵障礙及不孕［30］。卵巢功能早衰（premature ovarian failure，POF）是指年輕女性出現(xiàn)卵巢功能衰退、閉經(jīng)，并伴有低雌激素和高促性腺激素狀態(tài)的一類疾病。研究表明在POF患者中有63個miRNA上調(diào)，20個miRNA下調(diào)，其中miR-29a和miR-144的表達下降導致前列腺素合成酶類的表達上升，這可能是誘發(fā)POF的原因之一［31］。研究發(fā)現(xiàn)PIWI蛋白異常高表達與腫瘤惡性程度呈正相關。PIWI蛋白通路在子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、卵巢癌和宮頸癌等疾病中高表達。一方面由于過度的甲基化，使部分抑癌基因受到抑制，從而發(fā)生DNA的錯誤傳遞。另一方面激活了其他信號通路抑制細胞凋亡并提高了腫瘤藥物的耐藥性［32］。ncRNAs在生殖疾病方面的研究已逐步開展，其功能和作用機制也將更加明確，靶向治療結合化療藥物可能是今后腫瘤基因治療的新途徑。

5　結語

ncRNA在生殖細胞發(fā)育的多個過程中起重要作用，參與其信號通路可抑制基因組中移動元件、抵御轉座元件對基因組的侵襲和破壞，同時還參與蛋白編碼基因的表達。ncRNAs的表達異常也與許多疾病有關，包括PCOS和POF等。進一步研究ncRNAs在生殖調(diào)控功能中潛在的生物標志物功能、動態(tài)變化及調(diào)控機制，有助于發(fā)現(xiàn)新的生物指標和靶向治療位點，為疾病的預防、診斷和治療提供思路。

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［本文編輯王琳］

Roles of Non-coding RNAs in the Regulation of Reproduction

DU Chen，XU Yan-qi，CHEN Xiu-juan. Department of Obstetrics and Gynecology，Affiliated Hospital，Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010050，China

CHEN Xiu-juan，E-mail：90098687@sina.com

（2016-04-20）