長鏈非編碼RNA與精子發(fā)生

黃嘉膂，陳珺，張柳成，吳鈞翔，吳毓儉，宋寧

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·綜述·

長鏈非編碼RNA與精子發(fā)生

黃嘉膂，陳珺，張柳成，吳鈞翔，吳毓儉，宋寧△

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一類長度超過200個(gè)核苷酸的不編碼蛋白的RNA分子。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平以及表觀遺傳水平廣泛參與調(diào)控基因表達(dá)以及染色質(zhì)重塑等。簡述lncRNAs的分類與3種主要的作用機(jī)制（誘導(dǎo)、引導(dǎo)和支架），總結(jié)近年來通過二代測序技術(shù)以及基因芯片技術(shù)鑒定到的在精子發(fā)生過程中表達(dá)的lncRNAs，重點(diǎn)介紹Mrhl、Tsx、HongrES2、Dmr、Tbca16、NLC1-C等lncRNAs在生殖細(xì)胞增殖、分化、成熟過程中的功能及作用機(jī)制，并對(duì)lncRNA的功能研究策略作出展望。

長鏈非編碼RNA；精子發(fā)生；生殖細(xì)胞；表觀遺傳學(xué)；遺傳學(xué)

【Abstract】Long non-coding RNAs（lncRNAs）are a group of RNA transcripts with longer than 200 nucleotides and without protein-coding capacity.Recently，itwas revealed that the lncRNAs could be involved in the regulation of gene expression at the transcriptional，post-transcriptional and epigenetic levels，and chromatin remodeling.In this review，we summarized the classification of lncRNAs and three majormechanisms including decoys，guides and scaffolds.More and more lncRNAs related to spermatogenesis have been identificated by the next generation sequencing and microarray.The roles and potentialmechanisms of lncRNAs in the proliferation，differentiation and maturation of germ cells were introduced，including those lncRNAs as Mrhl，Tsx，HongrES2，Dmr，Tbca16 and NLC1-C.Finally，the study strategy of lncRNAswas discussed.

【Keywords】Longnon-codingRNAs；Spermatogenesis；Germ cells；Epigenetics；Genetics

（JIntReprod Health/Fam Plan，2016，35：317-321，326）

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81501307）；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第九期大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（2015013）

作者單位：200025上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院2013級(jí)八年制（黃嘉膂，陳珺，張柳成，吳鈞翔，吳毓儉），解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系，上海市生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（宋寧）

通信作者：宋寧，E-mail：ningsong@shsmu.edu.cn

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審校者

精子發(fā)生（spermatogenesis）是一個(gè)復(fù)雜且受到精確調(diào)控的生殖細(xì)胞增殖、分化過程，涉及多種基因的調(diào)控、染色體重塑及其他多種因素的共同作用［1］。以小鼠為例，在有絲分裂期，一部分精原干細(xì)胞（spermatogonial stem cells，SSCs）分裂形成Apr型（type A-paired）精原細(xì)胞，進(jìn)而形成Aal型（type A-aligned）精原細(xì)胞，后者通過數(shù)次有絲分裂和分化，依次產(chǎn)生A1～A4型精原細(xì)胞、中間型細(xì)胞、B型精原細(xì)胞以及初級(jí)精母細(xì)胞。在減數(shù)分裂期，初級(jí)精母細(xì)胞的染色體完成復(fù)制，并發(fā)生同源染色體聯(lián)會(huì)和交叉互換，經(jīng)第一次減數(shù)分裂形成兩個(gè)次級(jí)精母細(xì)胞，后者不發(fā)生染色體復(fù)制即快速進(jìn)入減數(shù)分裂Ⅱ期，形成4個(gè)單倍體的圓形精子細(xì)胞。而在精子形成期，圓形精子細(xì)胞的染色質(zhì)高度濃縮，高爾基體轉(zhuǎn)變?yōu)轫旙w，同時(shí)伴隨軸絲、鞭毛和線粒體鞘等結(jié)構(gòu)的發(fā)生，經(jīng)歷復(fù)雜的形態(tài)變化后，最終發(fā)育為具有頭、頸、尾完整結(jié)構(gòu)的精子［1］。近年來，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）作為轉(zhuǎn)錄組中的重要成員，在精子發(fā)生以及相關(guān)疾病中的作用被不斷發(fā)現(xiàn)，引起越來越多的關(guān)注。

1　lncRNAs概述

隨著基因組計(jì)劃的完成和第二代測序技術(shù)的應(yīng)用，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)人類基因組中高達(dá)98.5%的轉(zhuǎn)錄物不具有蛋白質(zhì)編碼功能［2］。這些非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）包括熟知的“管家”非編碼RNA［如核糖體RNA（rRNA）］、小非編碼RNA［如微小RNA （miRNA）和Piwi相互作用RNA（piwi interacting RNA，piRNA）］以及長度大于200個(gè)核苷酸（nt）的lncRNA。與信使RNA（mRNA）相似，lncRNA主要由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成，具有5’帽結(jié)構(gòu)，但在人基因組已知的9 640條lncRNA中，僅16.8%具有3’poly A尾結(jié)構(gòu)［3］。lncRNA的進(jìn)化保守性差，分子內(nèi)部常折疊形成復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，且其表達(dá)具有明顯的組織和階段特異性，某些lncRNA還具有特定的亞細(xì)胞定位［4］。根據(jù)lncRNA在基因組中與鄰近蛋白質(zhì)編碼基因的位置和相對(duì)方向，一般可將其分為5類：正義（sense）lncRNA、反義（anti-sense）lncRNA、雙向（bidirectional）lncRNA、內(nèi)含子（intronic）lncRNA和基因間（intergenic）lncRNA［5］。

在目前已知的lncRNA調(diào)控方式中，其作用主要通過轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和表觀遺傳水平呈現(xiàn)［6］。在轉(zhuǎn)錄水平，lncRNA可通過干擾鄰近基因的表達(dá)、與轉(zhuǎn)錄因子或RNA聚合酶Ⅱ相互作用、與DNA堿基互補(bǔ)形成復(fù)合物以及作為內(nèi)源性競爭性RNA （competing endogenous RNA，ceRNA）調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄［7］。在轉(zhuǎn)錄后水平，lncRNA可與miRNA結(jié)合抑制miRNA功能，或調(diào)控mRNA的可變剪接，也可與mRNA互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈RNA，改變其穩(wěn)定性［8］。在表觀遺傳水平，lncRNA可通過DNA甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重構(gòu)等機(jī)制影響基因表達(dá)。其中l(wèi)ncRNA調(diào)控自身基因所在染色體上基因表達(dá)的方式稱為順式調(diào)節(jié)（in cis），如Xist、Air和Kcnq1ot1等；而遠(yuǎn)距離調(diào)控其他染色體上基因表達(dá)的方式稱為反式調(diào)節(jié)（in trans），如HOTAIR等［9］。

lncRNA的作用至少可分為誘導(dǎo)（decoys）、引導(dǎo)（guides）和支架（scaffolds）3種模式。誘導(dǎo)作用主要是通過lncRNA與DNA結(jié)合形成RNA-DNA雜交體，掩蓋DNA上的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，從而阻礙效應(yīng)蛋白與相應(yīng)DNA位點(diǎn)的結(jié)合，如lncRNA PANDA與凋亡前轉(zhuǎn)錄因子NF-YA相互作用從而參與DNA損傷致細(xì)胞凋亡的調(diào)控。引導(dǎo)作用是通過lncRNA與RNA結(jié)合蛋白相結(jié)合，并選擇性引導(dǎo)蛋白復(fù)合體至特定位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，如Xist介導(dǎo)的雌性哺乳動(dòng)物X染色體的失活。支架作用是指lncRNA可通過其分子內(nèi)的不同結(jié)構(gòu)域，以中心支架的形式聚集兩個(gè)或以上蛋白質(zhì)成分形成特定復(fù)合體，如lncRNA HOTAIR使LSD1/CoREST/REST組裝形成二級(jí)復(fù)合體對(duì)染色體修飾進(jìn)行調(diào)控［10］。

lncRNA的研究尚處于起步階段，但其多樣的生物學(xué)功能已引起學(xué)者們的關(guān)注。lncRNA不僅與多種疾?。ㄈ缒[瘤、神經(jīng)退行性疾?。┲g有密切聯(lián)系［11］，還參與調(diào)控生物體內(nèi)許多重要的生命活動(dòng)，例如熱休克反應(yīng)和基因組印跡等。近年來，lncRNA在精子發(fā)生過程中的獨(dú)特作用也逐漸被學(xué)者們所知。

2　lncRNAs參與調(diào)控精子發(fā)生

精子發(fā)生過程中，調(diào)控性非編碼RNA的功能越來越受到重視，包括miRNA、piRNA、小干擾RNA （small interfering RNA，siRNA）和lncRNA［10-11］。前三者為長度小于50 nt的小非編碼RNA，其中miRNA通過與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’untranslated region，3’-UTR）結(jié)合，抑制其翻譯水平或降低其穩(wěn)定性，最終減少蛋白表達(dá)；piRNA能夠與miwi、miwi2和mili等3種piwi蛋白相結(jié)合，主要起沉默反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（retrotransposons）的作用，也可與真核生物的起始因子eIF相結(jié)合，從而抑制蛋白質(zhì)的翻譯，在精原干細(xì)胞的自我更新和精子細(xì)胞發(fā)育中必不可少［12］；siRNA能與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）結(jié)合，繼而識(shí)別并附著于互補(bǔ)的靶mRNA，使其降解，引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象稱為RNA干擾（RNA interference）。

2013年，Sun等［13］利用微陣列技術(shù)（microarray）對(duì)幼年小鼠和成年小鼠的睪丸轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)有3 025種lncRNA存在明顯的表達(dá)差異，其中1 062種下調(diào)，1 963種上調(diào)。Bao等［14］選取雄性小鼠在胚胎及出生后的6個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)（胚胎第12.5天、胚胎第15.5天、新生第7天、新生第14天、新生第21天以及成年），通過分離純化生殖細(xì)胞，得到去甲基化和再甲基化的原始生殖細(xì)胞（primordial germ cell，PGC）、精原細(xì)胞、粗線期精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞以及精子，通過基因芯片技術(shù)對(duì)31 423種lncRNA的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)相鄰兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間約500～3 000 種lncRNA的表達(dá)發(fā)生顯著變化（改變倍數(shù)＞2），且改變超過10倍的lncRNA多位于出生后14天（p14）→p21和p21→成年（AD）兩個(gè)時(shí)期內(nèi)，表明lncRNA的調(diào)節(jié)在精子發(fā)生的減數(shù)分裂晚期和單倍體時(shí)期尤為多樣。此外，從胚胎第12.5天（E12.5）到E15.5，lncRNA的表達(dá)上調(diào)數(shù)（2 593）多于下調(diào)數(shù)（1 125），而從p21到AD，其表達(dá)下調(diào)數(shù)（3 096）多于上調(diào)數(shù)（1 976），該結(jié)果與2個(gè)時(shí)間窗中的總體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)一致，表明lncRNA的轉(zhuǎn)錄受到調(diào)控，或者lncRNA在mRNA的轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮作用。而Liang等［15］的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠睪丸的24 316種lncRNA中，每條染色體上的lncRNA表達(dá)量均在1 000種左右，但Y染色體上僅表達(dá)30種，暗示lncRNA在性別差異中可能的調(diào)節(jié)作用。進(jìn)一步將lncRNA分為正義、反義、雙向和基因間4組，發(fā)現(xiàn)基因間lncRNA占絕大部分，且其表達(dá)量在不同發(fā)育階段的生殖細(xì)胞中變化巨大，因此研究人員推測其由組織特異性基因編碼；而前3種lncRNA數(shù)量少、變化小，被認(rèn)為由管家基因轉(zhuǎn)錄而得，影響整個(gè)精子發(fā)生過程。

3幾個(gè)與精子發(fā)生相關(guān)的重要lncRNAs

3.1M rhl（meiotic recombination hot spot locus）

是一種定位于細(xì)胞核中的長2.4 kb的單外顯子lncRNA，由小鼠8號(hào)染色體上的減數(shù)分裂重組熱點(diǎn)位點(diǎn)編碼而得，其同源基因也見于大鼠的19號(hào)染色體，但在人類基因組中尚未發(fā)現(xiàn)［16］。Ganesan等［17］研究發(fā)現(xiàn)，在Drosha的作用下，Mrhl可被剪接成一個(gè)80 nt大小的中間體RNA，且兩者均分布于GC1精原細(xì)胞系的核仁中，提示2種RNA可能與染色質(zhì)發(fā)生相互作用。Akhade等［18］運(yùn)用ChOP（chromatin oligo affinity precipitation）技術(shù)對(duì)小鼠精原細(xì)胞進(jìn)行染色質(zhì)的全基因組分析，發(fā)現(xiàn)1 370個(gè)與Mrhl相關(guān)的基因位點(diǎn)，其中37個(gè)基因位點(diǎn)的表達(dá)在Mrhl下調(diào)時(shí)發(fā)生顯著改變。

Arun等［19］的進(jìn)一步研究表明，Mrhl能夠通過與Ddx5/p68蛋白的相互作用實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠精原細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控。當(dāng)Mrhl的表達(dá)下調(diào)時(shí)，酪氨酸磷酸化的p68蛋白從核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)中，引發(fā)β-連環(huán)蛋白（β-catenin）向核內(nèi)移位并且活化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子TCF4，形成的β-連環(huán)蛋白-TCF4復(fù)合物能夠與目標(biāo)基因啟動(dòng)子的Wnt反應(yīng)元件（Wnt responsive elements，WRE）相結(jié)合，通過招募共激活因子（coactivators）或共抑制因子（co-repressors）調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)。由于Wnt信號(hào)通路能夠?qū)е录?xì)胞分化，抑制細(xì)胞增殖，因此Mrhl在精原細(xì)胞的分裂和分化調(diào)控中發(fā)揮重要作用［20］。

3.2Tsx（testis-specific X-linked）Tsx基因位于X染色體失活中心（X-inactivation center，Xic），緊鄰Xite上游，其進(jìn)化前體為脊椎動(dòng)物的Fip112基因。人和小鼠的Tsx基因具有高度同源性，尤其是在外顯子1，3，4，5和6區(qū)域［21］。Anguera等［22］的實(shí)驗(yàn)表明，體外克隆Tsx基因并構(gòu)建的表達(dá)載體，無論是在無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)（cell-free translation system）中，還是轉(zhuǎn)染人293T細(xì)胞和小鼠胚胎干細(xì)胞后，均未檢測到蛋白質(zhì)的表達(dá)。Tsx是在生殖細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和腦中高表達(dá)一種lncRNA，在減數(shù)分裂期的生殖細(xì)胞（尤其是粗線期精母細(xì)胞）中表達(dá)最多。但值得注意的是，該時(shí)期的性染色體處于廣泛的失活狀態(tài)，稱為MSCI（meiotic sex chromosome inactivation），僅有少量基因能夠逃避轉(zhuǎn)錄沉默，Tsx基因即為其中之一，也提示Tsx在精子發(fā)生中可能存在重要的調(diào)控作用。Tsx基因的敲除不影響MSCI，也不影響雄性生育，但敲除小鼠表現(xiàn)出一系列的生殖缺陷，包括粗線期細(xì)胞大量凋亡、睪丸體積變小、子代體質(zhì)量減輕等。

3.3HongrES2是一種特異表達(dá)于附睪的lncRNA，長1.6 kb，由來自于大鼠的5號(hào)和9號(hào)染色體的轉(zhuǎn)錄物嵌合形成。其表達(dá)起始于大鼠出生后第30天，即第1輪精子發(fā)生剛剛完成時(shí)，隨后逐漸增高，到第450天時(shí)趨于穩(wěn)定，整個(gè)過程受雄激素的調(diào)控影響。這種表達(dá)的時(shí)空特異性提示其在精子成熟中的可能作用。與mRNA類似，HongrES2也具有5’端帽子和3’端poly A尾結(jié)構(gòu)，且其3’端一段長為216 bp的序列與附睪特異編碼基因羧酸酯酶7 （carboxylesterase 7，CES7）具有高度同源性。HongrES2在細(xì)胞核中能夠被加工成一種23 bp長且類似于miRNA的小RNA，稱為mil-HongrES2，后者能夠抑制CES7的表達(dá)，影響膽固醇酯酶的活性，從而通過降低精子膜中膽固醇/磷脂類的比例，加強(qiáng)膜的流動(dòng)性，有利于精子獲能（capacitation）［23］。有趣的是，細(xì)胞核中mil-HongrES2的含量很少，而其前體HongrES2的含量卻很多，表明核內(nèi)可能存在一種未知的剪切抑制機(jī)制。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，mil-HongrES2的過量表達(dá)也會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)酪氨酸的廣泛磷酸化，而后者是與精子獲能相關(guān)的信號(hào)級(jí)聯(lián)激活的標(biāo)志。因此，HongrES2的內(nèi)源性低表達(dá)是附睪中精子正常成熟所必需的條件之一［24］。

3.4Dm r（Dm rt1-related）是一種高表達(dá)于睪丸的lncRNA，其基因位于小鼠5號(hào)染色體的G2位點(diǎn)和大鼠12號(hào)染色體的p11處。Zhang等［25］研究發(fā)現(xiàn)，Dmr基因能夠與來自小鼠19號(hào)染色體的Dmrt1（Dsx-and Mab3-related transcription factor-1）基因反式剪接，形成新的Dmrt1-Dmr嵌合轉(zhuǎn)錄物。其中Dmr主要作為3’-UTR提供終止密碼子TGA，使翻譯的Dmrt1蛋白長度縮短，羧基末端缺失，僅保留一個(gè)保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域DM。同時(shí)由于反式剪接的形成，Dmr也在一定程度上下調(diào)了Dmrt1蛋白的表達(dá)。

值得注意的是，Dmrt1蛋白除了作為性別決定的關(guān)鍵因子，也已經(jīng)被證實(shí)在精子發(fā)生調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。一方面，該蛋白能夠阻斷維甲酸（retinoic acid，RA）依賴性的STRA8因子表達(dá)，并間接抑制RA的相關(guān)轉(zhuǎn)錄活動(dòng)，從而抑制精原細(xì)胞由有絲分裂期進(jìn)入到減數(shù)分裂期；另一方面，Dmrt1也能

直接激活轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1的表達(dá)，維持支持因子的周期性表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)精原細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)程［26］。Agbor等［27］則通過特異性敲除支持細(xì)胞中的Dmrt1基因發(fā)現(xiàn)，Dmrt1能夠通過影響支持細(xì)胞的成熟而對(duì)精子發(fā)生產(chǎn)生影響。因此，Dmr作為Dmrt1的抑制因子，可能參與調(diào)控精子發(fā)生過程。

3.5Tbca16精子發(fā)生的過程涉及到微管與細(xì)胞骨架的精確重構(gòu)，從而產(chǎn)生復(fù)雜的微管結(jié)構(gòu)，如精子頸部和鞭毛等，而有絲分裂和減數(shù)分裂的順利進(jìn)行也同樣需要微管的參與［28］。在微管的形成過程中，微管蛋白輔助因子A（tubulin cofactor A，TBCA）通過與β亞基結(jié)合，參與微管蛋白異二聚體的形成以及進(jìn)一步的微管組裝。通過RNA干擾技術(shù)抑制其表達(dá)，可導(dǎo)致α和β亞基數(shù)量減少、微管細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變和G1細(xì)胞周期阻滯，甚至引起細(xì)胞死亡［29］。Nolasco等［30］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠基因組中含有2種不同結(jié)構(gòu)的Tbca基因，分別位于13號(hào)和16號(hào)染色體。其中Tbca13基因通過轉(zhuǎn)錄、翻譯產(chǎn)生TBCA蛋白發(fā)揮作用，在小鼠精子發(fā)生過程中其mRNA的表達(dá)水平逐步提高；而Tbca16基因位于腺苷酸環(huán)化酶9 （adenylate cyclase 9，Adcy9）基因的內(nèi)含子3～4之間，其表達(dá)水平逐漸降低，與Tbca13基因相反，因此推測這2種基因之間可能存在某種調(diào)節(jié)機(jī)制。進(jìn)一步研究表明，Tbca16基因不編碼蛋白，而是同時(shí)轉(zhuǎn)錄生成正義和反義RNA，即mRNA和NATs（naturalantisense transcripts），后者為lncRNA Tbca16。兩者能夠互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈RNA，作為前體物質(zhì)被加工生成siRNA。由于Tbca13和Tbca16基因的編碼區(qū)域序列具有高達(dá)98%的相似性，因此形成的siRNA能夠使Tbca13的mRNA發(fā)生降解，誘導(dǎo)基因沉默，通過抑制TBCA蛋白的合成，在轉(zhuǎn)錄后水平影響精子發(fā)生。

3.6NLC1-C精子的成熟阻滯（maturation arrest，MA）是臨床上男性不育的常見原因。Lü等［31］通過微陣列分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)，健康對(duì)照者與MA患者的睪丸lncRNA表達(dá)譜之間存在明顯差異。其中NLC1-C是一種僅表達(dá)于精原細(xì)胞和早期精母細(xì)胞的基因間lncRNA，在正常情況下主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，而在MA患者中，盡管其總體表達(dá)量降低，但在細(xì)胞核中的表達(dá)反而上調(diào)。體外細(xì)胞試驗(yàn)表明，NLC1-C在NT2細(xì)胞質(zhì)中的過表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，而相應(yīng)基因的敲除則抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在正常小鼠的睪丸中，NLC1-C能夠特異性地結(jié)合于核仁素（nucleolin）的RBD結(jié)構(gòu)域，共同抑制miR-320a和miR-383的轉(zhuǎn)錄形成，而當(dāng)被轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)中后，加工成熟的miR-320a和miR-383則能夠直接抑制NLC1-C的作用，從而對(duì)細(xì)胞生存進(jìn)行調(diào)節(jié)。因此，細(xì)胞核內(nèi)NLC1-C的表達(dá)升高，可以加強(qiáng)對(duì)miR-320a和miR-383的轉(zhuǎn)錄抑制，導(dǎo)致精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞的過度增殖以及成熟阻滯，與男性不育的發(fā)生密切相關(guān)。NLC1-C還在睪丸胚胎癌細(xì)胞的胞核中高表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖和凋亡，與不育男性多發(fā)睪丸癌的結(jié)果相一致［32］。

3.7其他相關(guān)的lncRNAs Luk等［33］通過對(duì)SAGE數(shù)據(jù)庫和全基因組嵌合微陣列（whole-genome tiling microarray）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)2種特異表達(dá)于精原細(xì)胞的lncRNA，分別命名為Spga-lncRNA 1和2。兩者在體內(nèi)模型中均表現(xiàn)出顯著的分化抑制作用，表明其在精原細(xì)胞的干性維持（stemness maintenance）中可能發(fā)揮重要作用。

人NEAT1（nuclear enriched abundant transcript 1）是一種轉(zhuǎn)錄自11號(hào)染色體的lncRNA，作為核心組分參與旁斑（paraspeckle）結(jié)構(gòu)的形成，而后者能夠阻滯成熟mRNA的出核和后續(xù)翻譯，參與調(diào)控細(xì)胞的生長和分化［34］。研究人員通過構(gòu)建針對(duì)NEAT1的干擾載體并包裝慢病毒，將其注射到成年小鼠睪丸的曲細(xì)精管中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有精子發(fā)生的曲細(xì)精管比例由97%減少至86%，表明小鼠的精子發(fā)生受到影響，具體機(jī)制尚不明確［35］。

大量證據(jù)顯示線粒體功能與精子質(zhì)量和受精能力密切相關(guān)，精子線粒體活性已成為影響人類精子生理功能的重要標(biāo)志［36］。與核基因組不同，雙鏈環(huán)狀的線粒體DNA只能編碼與電子傳遞鏈相關(guān)的13種蛋白亞基，以及翻譯所需的2種rRNA和22種tRNA［37］。Rackham等［38］的研究發(fā)現(xiàn)線粒體也能表達(dá)3種lncRNA，分別為lncND5、lncND6和lncCytb，三者均由核編碼蛋白（如MRPP1和PTCD1）調(diào)控其加工過程。進(jìn)一步對(duì)18種人體組織進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，線粒體lncRNA在生殖系統(tǒng)組織（如睪丸和卵巢）中的表達(dá)量最高，提示其在精子發(fā)生等生殖活動(dòng)中可能發(fā)揮重要作用。而其作用機(jī)制可能與lncRNA分子內(nèi)部形成的二聚體結(jié)構(gòu)有關(guān)。該結(jié)構(gòu)能夠與其互補(bǔ)配對(duì)的mRNA相結(jié)合，從而增加mRNA的穩(wěn)定性或者調(diào)節(jié)其翻譯水平，通過影響線粒體的功能而影響精子發(fā)生。

4結(jié)語與展望

綜上所述，越來越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)與精子發(fā)生緊密相關(guān)，并參與雄性生殖細(xì)胞增殖、分化的調(diào)控過程。lncRNA通過多種方式在不同水平調(diào)控基因表達(dá)，在精子發(fā)生這一精密調(diào)控的過程中構(gòu)建了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。然而，由于實(shí)驗(yàn)技術(shù)等限制，對(duì)這一領(lǐng)域的研究尚待進(jìn)一步深入。例如，由于lncRNA在轉(zhuǎn)錄組中的表達(dá)量很低，早期研究為了富集盡可能多的RNA以方便測序，往往首先使用poly A尾富集技術(shù)，這一策略人為地將無poly A的lncRNA排除在外。最近的研究顯示，無poly A尾的lncRNA數(shù)量遠(yuǎn)多于有poly A尾的lncRNA。另外，由于已知的lncRNA種類多達(dá)數(shù)十萬種，如何對(duì)其進(jìn)行功能研究是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，在這方面，大數(shù)據(jù)分析、組學(xué)研究、CRISPR-Cas9敲除等新型研究方法的應(yīng)用，應(yīng)能對(duì)開拓研究方向、縮短研究周期起到積極的幫助。同時(shí)，與miRNA不同的是，大部分lncRNA物種間保守性差，這些lncRNA只是“垃圾”RNA亦或存在未知的功能需要進(jìn)一步的探索，一個(gè)可能的解釋是不保守的lncRNA間存在共同的功能域。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展、各種臨床檢測技術(shù)的不斷成熟以及對(duì)不同lncRNA功能的進(jìn)一步理解，lncRNA很有可能在男性生殖系統(tǒng)疾病的診斷治療中成為新的生物標(biāo)記物或治療靶點(diǎn)，為廣大患者帶來福音。

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［本文編輯王昕］

Role of Long Non-coding RNAs in Spermatogenesis

HUANG Jia-lv，CHEN Jun，ZHANG Liu-cheng，WU Jun-xiang，WU Yu-jian，SONG Ning.Departmentof Clinical Medicine，Grade 2013（HUANG Jia-lyu，CHEN Jun，ZHANG Liu-cheng，WU Jun-xiang，WU Yu-jian），Department of Anatomy，Histology and Embryology/Shanghai Key Laboratory of Reproductive Medicine（SONG Ning），School of Medicine，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai200025，China

SONG Ning，E-mail：ningsong@shsmu.edu.cn

·綜述·

（2016-03-01）