氦氖激光對退變顳下頜關(guān)節(jié)BMP-2表達的影響

毛凱平，鄒璟，李解，姜夢雅，高桃珍

顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病(temporomandibular joint osteoarthrosis, TMJOA)是指顳下頜關(guān)節(jié)組織發(fā)生磨損與變形，并在關(guān)節(jié)表面形成新骨的非炎癥性骨關(guān)節(jié)病。由于顳下頜關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)與功能復(fù)雜，加之人的一生中牙合型不斷發(fā)生改變，顳下頜關(guān)節(jié)經(jīng)歷了復(fù)雜的改建過程，以致其發(fā)病率高達30%，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的降解、組織改建是TMJOA最重要的病理改變。文獻證實，基質(zhì)調(diào)節(jié)因子通過影響細胞外基質(zhì)降解及合成導(dǎo)致基質(zhì)成分紊亂及功能改變，在TMJOA發(fā)生與發(fā)展中起著主要作用[2-7]。氦氖激光是臨床治療TMJOA的常用手段之一，但其作用機制尚不完全清楚，本研究通過觀察氦氖激光對退變顳下頜關(guān)節(jié)細胞外基質(zhì)基質(zhì)調(diào)節(jié)因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)表達的影響，以期明確氦氖激光對顳下頜關(guān)節(jié)退變的保護作用與機制，為臨床運用氦氖激光治療顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實驗動物：選用骨骼發(fā)育成熟的健康成年雄性新西蘭大白兔40只，月齡5～6個月，體質(zhì)量2～2.5kg，無牙頜畸形，由武漢大學(xué)實驗動物中心提供(合格證號42000500002225)。②主要試劑： 羊抗兔BMP-2單克隆抗體(武漢博士德生物公司，貨號：BA0585)、鼠抗羊二抗(KPL公司)。③主要材料與儀器：PVDF膜(Millipore 公司)、氦氖激光多功能治療儀(MDC-500)。

1.2 方法 ①分組與處理：在標(biāo)準(zhǔn)條件下(武漢市第一醫(yī)院中心實驗室)適應(yīng)性飼養(yǎng)3周后開始實驗，實驗過程中的程序經(jīng)過了武漢市第一醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批。所有動物進行編號，查隨機數(shù)字表分為4組各10只。正常組，自然飼養(yǎng)，不作任何治療；模型組，模型，不作任何治療；假模型組，同模型組，但不切除關(guān)節(jié)盤，不作任何治療；治療組，于造模后第1d開始氦氖激光治療，連續(xù)治療10d。各組分別在造模后第1天和11天兩個時間點各取5只，將實驗動物以過量注射麻醉藥方法處死，取各組髁突，直接凍存于-80℃冰箱待檢測。②造模：參照常嘉等[8]的造模方法，建立顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病動物模型。于耳緣靜脈注射1mg/kg的2.5g/L的戊巴比妥鈉。無菌條件下自眼外眥外側(cè)5mm處至外耳道方向行2cm長的皮膚切口，分離皮下組織，暴露關(guān)節(jié)囊。水平切開關(guān)節(jié)囊，切開關(guān)節(jié)盤的外側(cè)附著，將下頜升支推向外側(cè)以充分暴露髁突關(guān)節(jié)面與關(guān)節(jié)盤。將關(guān)節(jié)盤前外二分之一部分切除。無菌生理鹽水充分沖洗后將剩余關(guān)節(jié)盤復(fù)位，分層縫合關(guān)節(jié)囊、皮下組織和皮膚。假模型組僅作關(guān)節(jié)囊切開后即縫合組織。術(shù)后不限制動物的下頜運動，飼養(yǎng)顆粒性常規(guī)兔飼料，單籠飼養(yǎng)。連續(xù)肌肉注射青霉素3天，每天4萬單位。于術(shù)后1個月行顳下頜關(guān)節(jié)CT檢查，出現(xiàn)典型的TMJOA改變即進行后續(xù)實驗，未出現(xiàn)TMJOA改變的動物予以剔除。③治療方法：采用氦氖激光多功能治療儀(MDC-500)，輸出氦氖激光波長632.8nm，功率10mw，激光光針光斑直徑2mm。取患側(cè)頰車、上關(guān)、下關(guān)、聽宮、翳風(fēng)，光針緊貼皮膚并與之垂直，每穴照射5min，共治療10d。

1.3 評定標(biāo)準(zhǔn) Western Blot方法進行檢測BMP-2蛋白表達量：按蛋白分子量配制10%的PAGE膠電泳，根據(jù)預(yù)染marker顯示，充分分離目的蛋白，取出凝膠用蒸餾水沖洗，剪與PAGE凝膠相同大小的PVDF膜和濾紙，PVDF膜用甲醇浸泡數(shù)秒后和濾紙一同浸泡于電轉(zhuǎn)緩沖液中。然后用含5%脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜，室溫搖床封閉2h。再加入一抗孵育，TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，用封閉液稀釋相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗——1:40000稀釋，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，顯色曝光。BandScan凝膠圖像分析軟件分析膠片灰度值。

2 結(jié)果

2.1 模型兔顳下頜關(guān)節(jié)CT表現(xiàn) 模型兔于術(shù)后1個月行三維CT檢查，顯示關(guān)節(jié)軟骨逐漸消耗、喪失，出現(xiàn)缺損，關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，光澤度變差，髁突形態(tài)改建、軟骨層增厚明顯，患側(cè)髁突外觀肥大，見圖1A～C。

圖1A～C A和B分別為模型組健側(cè)(左側(cè))、患側(cè)(右側(cè))顳下頜關(guān)節(jié)三維CT表現(xiàn)，圖C為CT平掃，可見患側(cè)髁突形態(tài)明顯改變、軟骨層增厚明顯，髁突肥大。

2.2 氦氖激光治療對BMP-2表達的影響 Western blot檢測顯示，正常組和假模型組各時間點BMP-2蛋白表達均無顯著性變化；造模成功后第1d時間點，模型組與氦氖激光組BMP-2蛋白表達均明顯減少，經(jīng)過氦氖激光治療10d后，BMP-2蛋白表達較第1d及模型組明顯上升(P<0.05)。見圖2，表1。

圖2 各組不同時間點BMP-2蛋白表達

組別1d11d正常組 11.010±0.125假模型組 1.066±0.1910.982±0.096模型組 0.574±0.122a0.532±0.133a氦氖激光組0.506±0.074a0.736±0.081b

與正常組比較，aP<0.05; 與模型組及氦氖激光組第1d比較，bP<0.05

3 討論

盡管顳下頜骨關(guān)節(jié)病的機制尚未完全闡明，但髁突軟骨細胞對基質(zhì)合成與降解代謝調(diào)控的失衡被認為是其主要病理環(huán)節(jié)[9]。文獻證實，髁突軟骨細胞是顳下頜骨關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)成分的惟一來源，顳下頜骨關(guān)節(jié)病的發(fā)生即為髁突軟骨細胞所控制的合成、降解代謝失衡所致，其主要特征為關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)成分的進行性降解，同時伴隨著繼發(fā)性炎癥因子的釋放及其相關(guān)效應(yīng)[9]。

臨床研究表明，氦氖激光對顳下頜骨關(guān)節(jié)病具有良好的治療作用[10]，其作用機制值得進一步深入研究。已有研究顯示，氦氖激光光針釋放出的激光光子能量被病態(tài)的生物分子吸收后，可改變病態(tài)生物分子內(nèi)能，這種改變相當(dāng)于一種刺激源，可直接或間接興奮神經(jīng)、肌肉和腺體，同時，可使鉀離子致解反應(yīng)時間顯著延長，使五羥色胺物質(zhì)明顯降低，激活內(nèi)源性嗎啡樣鎮(zhèn)痛物質(zhì)，延長感覺神經(jīng)潛伏時間，整合中樞神經(jīng)的痛覺信號，從而達到鎮(zhèn)痛效果，并通過促進新生血管的形成改善顳下頜關(guān)節(jié)患者局部血液循環(huán)，通過抑制固有炎癥介質(zhì)PGE的合成及直接抗炎作用，降低炎癥反應(yīng)[11]。

BMP-2作為細胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)因子，同時也是合成代謝酶，可促進細胞外基質(zhì)合成，并能誘導(dǎo)未分化的間質(zhì)細胞不可逆的分化為軟骨細胞和成骨細胞。對骨組織的發(fā)生、損傷和修復(fù)都具有重要作用。其對骨原細胞的分化起著決定性作用，是促進成骨的主要因子，可在骨損傷局部和異位促進細胞增殖，提高其堿性磷酸酶活性，是唯一能夠單獨在異位誘導(dǎo)成骨形成的分子。這使其在骨關(guān)節(jié)病的臨床治療中具有極大的潛在應(yīng)用價值[12-13]。

綜上所述，退變的顳下頜關(guān)節(jié)組織中，BMP-2蛋白表達較正常顳下頜關(guān)節(jié)明顯降低，證實了BMP-2蛋白表達下降所致ECM合成減少是顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病的機制之一。正常組與假模型組之間二者的表達無顯著性差異，說明未切除關(guān)節(jié)盤的顳下頜關(guān)節(jié)模型無明顯的退變。選用氦氖激光照射患側(cè)頰車、上關(guān)、下關(guān)、聽宮、翳風(fēng)穴10d后，顳下頜關(guān)節(jié)組織中BMP-2蛋白表達明顯增加，表明氦氖激光治療可上調(diào)退變顳下頜關(guān)節(jié)細胞外基質(zhì)BMP-2蛋白表達，促進細胞外基質(zhì)合成，從而防治顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病。本研究為臨床運用氦氖激光治療TMJOA提供了一定的理論依據(jù)，但氦氖激光影響相關(guān)蛋白表達的具體機制仍需進一步研究。

[1] 方澤強,馬緒臣.顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病髁突軟骨細胞線粒體DNA突變的實驗研究[J].北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2006,38(3):293-297.

[2] Frederiok J.Matrix metalloproteinases and their inhibitors in connective tissue remodeling[J].FASB J,1991,5(8):2145-2154.

[3] 管劍龍,施桂英,韓星海.骨關(guān)節(jié)炎患者血清和滑液中金屬蛋白酶[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2001,5(2):102-105.

[4] Tchetverikov I,Lohmander LS,Verzijl N,et al.MMP protein and activity levels in synovial fluid from patients with joint injury,inflammatory arthritis and osteoarthris[J].Ann Rheum Dis,2005,64(7):694-698.

[5] Pelletier JP,Lascau Coman V,Jovanocic D,et al.Selective inhibition of inducible nitric oxide synthase in experimental osteoarthritis is associated with reduction in tissue levels of catabolic factors[J].J Rheumatol,1999,26(9):2002-2014.

[6] 閆春哥,景向東,王改玲,等.兔顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病中基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1表達的研究[J].臨床合理用藥,2011,4(7):26-28.

[7] 周藝群,谷志遠.MMPs/TIMPs的表達調(diào)控與顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病的關(guān)系[J].國外醫(yī)學(xué)口腔醫(yī)學(xué)分冊,2004,31(6):424-428.

[8] 常嘉,馬緒臣,武登誠,等.顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病動物模型的建立及組織病理學(xué)觀察[J].現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志,2003,17(6):485-488.

[9] 常嘉,馬緒臣,馬大龍.兔實驗性骨關(guān)節(jié)病髁突軟骨細胞表達軟骨基質(zhì)分子的變化及白細胞介素1β的影響[J].北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2003,35(5):521-524.

[10]涂強.氦-氖激光光針穴位照射治療顳下頜關(guān)節(jié)功能紊亂綜合征37例[J].中國醫(yī)藥指南，2009,7(2):105-106.

[11]虞素芳,劉翠云.氦-氖激光治療顳下頜關(guān)節(jié)紊亂綜合征78例報告[J].激光雜志,1989,10(6):289-290.

[12]秦霞南,龍星,李金榮.顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病的臨床診斷[J].口腔醫(yī)學(xué)研究,2006,22(2):197-199.

[13]秦霞南,龍星,李金榮.顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病臨床病理研究[J].口腔醫(yī)學(xué)研究,2005,21(4):440-442.