糖尿病腎病動(dòng)物模型的研究

馮曉軒　于　梅　包海鵬

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·150036）

糖尿病腎病動(dòng)物模型的研究

馮曉軒于梅包海鵬

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·150036）

目的：討論目前常用的糖尿病腎病的造模方法，總結(jié)其各自特點(diǎn)，方便科研選擇應(yīng)用。方法：簡述幾種糖尿病腎病造模過程及成模表現(xiàn)，總結(jié)歸納各自特點(diǎn)。結(jié)論：通過討論和分析，找出更科學(xué)，成模率更高，可操作性及可重復(fù)性更強(qiáng)，又經(jīng)濟(jì)實(shí)用的DKD造模方法。

糖尿病腎病動(dòng)物模型綜述糖尿病腎臟病（diabetickidneydisease,DKD）,是一種由于糖尿病代謝異常引發(fā)的腎小球硬化癥，也是其全身微血管病的組成部分。[1]近年來，隨著生活水平的提高，飲食習(xí)慣的改變，糖尿病的患病率也正在逐年升高。而DKD目前也已成為繼腎小球疾病后導(dǎo)致終末期腎病的第二位主要病因。

糖尿病腎病病情的復(fù)雜性，多樣性，難治性，都使它成為了近年來腎病科和糖尿病科醫(yī)生關(guān)注研究的熱點(diǎn)。因此，合理科學(xué)的造模方法，不僅能夠節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間和實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)，也可以提高糖尿病腎病動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，為糖尿病腎病的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

幾種常用的造模方法的簡介

1　利用藥物誘導(dǎo)造模

世界上最早的DN模型是由Naccarator等在1964年使用四氧嘧啶誘導(dǎo)建立的[2]。目前該類模型常見的是STZ（鏈脲佐菌素），四氧嘧啶（ATX）作為主要藥物誘導(dǎo)的模型。其原理為通過藥物注射，造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部分胰島功能的破壞。

1.1STZ誘導(dǎo)糖尿病腎病模型

1.1.1STZ合并單側(cè)腎切除的糖尿病腎病模型模型制備過程：李曉輝等[3]選用體重平均220～250g的SD雄性大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分組，以3%戊巴比妥鈉100mg/kg麻醉后，采用背部切口方式行單側(cè)腎臟切除術(shù)。手術(shù)過程中應(yīng)注意無菌操作，以減少動(dòng)物死亡率。術(shù)后逐層縫合傷口。術(shù)后2周，按體重注射2%STZ50mg/kg以誘導(dǎo)。72h后，篩選非空腹血糖達(dá)到16.8mmol/L者即為造模成功。

成模標(biāo)準(zhǔn)：56天后大鼠出現(xiàn)多食多尿消瘦等糖尿病表現(xiàn)，在光鏡及電鏡下均有明顯腎小球，腎小管間質(zhì)的病理形態(tài)學(xué)改變。

優(yōu)點(diǎn)：可以在較短時(shí)間內(nèi)制備完成DN模型，具備顯著腎臟病理學(xué)改變。

缺點(diǎn)：操作過程較為復(fù)雜，對單側(cè)腎切除手術(shù)的要求較高，實(shí)驗(yàn)操作過程中存活率較低，成模率不高。

1.1.2STZ合并高脂高糖飲食的糖尿病腎病模型模型制備過程：邢冬杰[4]等采用平均體重在200～220g的wistar大鼠，給予自然環(huán)境下高脂高糖飼料（10%豬油，20%蔗糖，2.5%膽固醇，1.0%膽酸鹽，66.5%標(biāo)準(zhǔn)飼料）喂養(yǎng)，6周后，禁食12h后按35mg/kg腹腔注射1%STZ（美國sigma公司）溶液后造模成功。

成模標(biāo)準(zhǔn)：21天后血糖穩(wěn)定升高，98天后模型大鼠出現(xiàn)與臨床糖尿病腎病相似的生化、尿液、病理組織學(xué)、免疫組織化學(xué)變化[5]。

優(yōu)點(diǎn)：操作較單側(cè)切除手術(shù)的造模方式要相對簡易，成模率相對較高。

缺點(diǎn)：造模時(shí)間較長，實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)較高

1.1.3STZ合并單側(cè)腎切除與高脂高糖飲食的糖尿病腎病模型的建立模型制備過程：王康[6]等運(yùn)用雄性wistar大鼠模擬出了中晚期糖尿病腎病的模型。實(shí)驗(yàn)過程中，采用平均220～250g體重的wistar雄性大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后行單側(cè)腎切除手術(shù)，術(shù)后喂以高糖高脂飼料12周后注射30mg/ kgSTZ后可出現(xiàn)腎小球以及基底膜等的明顯損傷，模擬人類2型糖尿病腎病中晚期發(fā)病表現(xiàn)。

成模標(biāo)準(zhǔn)：腎小球系膜基質(zhì)呈彌漫性無細(xì)胞增生，腎小球毛細(xì)血管袢成分葉狀，基底膜及系膜基質(zhì)增生，腎小管腎間質(zhì)均有不同程度的損傷。

優(yōu)點(diǎn)：成模時(shí)間短，腎臟損傷程度大，病理效果明顯，成模率相對較高，能夠產(chǎn)生胰島素抵抗，破壞大鼠胰島功能，更好地模擬2型糖尿病發(fā)病機(jī)制，增加實(shí)驗(yàn)的可行性。

缺點(diǎn)：操作復(fù)雜，對單側(cè)腎切除手術(shù)要求較高。

1.1.4一次性大劑量腹腔注射STZ糖尿病腎病模型的建立模型制備過程農(nóng)慧[7]等采用平均體重在150～220g的雄性SpragueDawley大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，禁食17h，按55mg/ kg于腹腹腔內(nèi)一次性注射STZ。

成模標(biāo)準(zhǔn)：血糖值高于16.7mmol/L即造模成功。腎小球明顯增大，充血，腫脹，基底膜增厚。腎小球輕度硬化。

優(yōu)點(diǎn)：操作簡便易行，成模時(shí)間短，可減少實(shí)驗(yàn)化學(xué)試劑的使用量，節(jié)約實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)。

缺點(diǎn)：對胰島細(xì)胞損傷迅速且不可逆，更貼近于人類少發(fā)的1型糖尿病。與臨床證型也不能完全相符。對接下來的藥物實(shí)驗(yàn)不能提供精準(zhǔn)反映。

1.2四氧嘧啶小劑量注射聯(lián)合高糖高脂飲食的糖尿病腎病模型的建立

模型制備過程：陳小明[8]等利用體重在2.0～2.5kg的雄性健康新西蘭兔，以高糖高脂飼料（常規(guī)飼料加5%蔗糖、5%豬油和1%膽固醇）適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后禁水12h，行小劑量ALX耳緣注射50mg/kg，隔天禁水12h后再次耳緣注射100mg/ kg，為防止低血糖，注藥后48h后給予10%葡萄糖自由攝取，同時(shí)應(yīng)密切監(jiān)測血糖，如有低血糖出現(xiàn)則需給予普通胰島素1～2U/kg以防止血糖紊亂。

成模標(biāo)準(zhǔn)：12周后血糖明顯升高(P＜0.05),腎小球，腎小管以及基底膜均有不同程度的腎功能受損，出現(xiàn)蛋白尿等表現(xiàn)。

優(yōu)點(diǎn)：存活率高，模型穩(wěn)定，重復(fù)性好，抗病能力強(qiáng)，方便組織學(xué)觀察。

缺點(diǎn)：此類實(shí)驗(yàn)中兔類模型使用較少，實(shí)驗(yàn)成本較高，不易獲取實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。

2　利用基因突變動(dòng)物造模[9]

目前該模型是利用未經(jīng)過任何下意識的人工處理的動(dòng)物。該品類的動(dòng)物一般在自然環(huán)境中發(fā)生染色體畸形以及基因的突變，實(shí)驗(yàn)對象往往是通過這一方式進(jìn)行定向繁殖培養(yǎng)而成的品類。目前常見的有：

2.11型糖尿病腎病小鼠模型

2.1.1NOD小鼠的糖尿病腎病模型為自發(fā)型胰島素依賴型糖尿病模型，可以隨著胰島β細(xì)胞破壞的加重，出現(xiàn)明顯的腎小球硬化。

2.1.2BB大鼠的糖尿病腎病模型是由Wistar大鼠經(jīng)篩選得到的自身免疫性胰島素依賴性糖尿病模型。腎臟病理改變比較輕微且周期較長。

2.1.3Akita小鼠是一種以C57BL/6染色體發(fā)生改變的一類小鼠。一般3個(gè)月后會出現(xiàn)典型腎臟病理學(xué)改變。

優(yōu)點(diǎn)：可以在不借助外界因素的條件下更形象模擬人類1型糖尿病發(fā)病機(jī)理，起病較快，癥狀更加相似，可以對接下來的藥物實(shí)驗(yàn)提供精準(zhǔn)反映。

缺點(diǎn)：基因突變類小鼠培育困難，造價(jià)高昂，成本過高不利于實(shí)驗(yàn)的廣泛開展。

2.22型糖尿病腎病小鼠模型[10]

目前應(yīng)用較多的有db/db小鼠，KKA小鼠，OLETF大鼠，Zukerfa/fa大鼠以及GK大鼠。

2.2.1db/db小鼠是一種臨床應(yīng)用最廣泛的2型糖尿病基因突變鼠。以4號染色體的瘦素受體基因突變而導(dǎo)致先天性肥胖。

優(yōu)點(diǎn)：與人類2型糖尿病發(fā)病機(jī)制尤為類似，以微血管并發(fā)癥多見，尤其好發(fā)DN[11]。

12～14周即可出現(xiàn)顯著的腎臟病理學(xué)改變。無需藥物配合誘導(dǎo)，更貼近于人類肥胖型2型糖尿病發(fā)病機(jī)理，使藥物實(shí)驗(yàn)更精準(zhǔn)。

2.2.2GK大鼠一般此品類大鼠應(yīng)用于非肥胖型糖尿病腎病的研究。臨床上應(yīng)用較多，會出現(xiàn)高血糖，高胰島素血癥。

2.2.3OLETF大鼠2型糖尿病腎病模型中應(yīng)用較為廣泛的一個(gè)品種，其特征是早期以胰島素抵抗，糖脂肪代謝紊亂為主，晚期出現(xiàn)糖尿病腎病顯著病變并出現(xiàn)腎臟病理學(xué)改變。

優(yōu)點(diǎn)：能更好地在自然狀態(tài)下模擬人類糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制，為藥物實(shí)驗(yàn)提供更精準(zhǔn)模型。

缺點(diǎn)：此類動(dòng)物模型造價(jià)較高，培育困難，數(shù)量較少，并且對飼養(yǎng)和繁殖的環(huán)境要求比一般實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都要高，考慮到經(jīng)費(fèi)問題，目前無法大量應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)中。

3　基因工程糖尿病腎病模型

如：Smad3敲除小鼠[12]，轉(zhuǎn)基因RAGE小鼠，轉(zhuǎn)基因OVE26小鼠等一系列轉(zhuǎn)基因小鼠。

優(yōu)點(diǎn)：此類小鼠的遺傳背景較清晰，更貼近人類發(fā)病方式，造模時(shí)間短，成模效果好，一旦修改基因結(jié)構(gòu)成功后，對飼養(yǎng)的要求很低，可以輕松操作和觀察。

缺點(diǎn)：國內(nèi)此項(xiàng)技術(shù)開展極少，基因工程的研究仍然處于初級階段，造模成本較高，對基因修改技術(shù)要求嚴(yán)格。

4　討論

目前，糖尿病腎病的模型，國外運(yùn)用較多的是Insulin-2 Atika鼠，新西蘭肥胖鼠，KK小鼠等由自身基因突變而得的實(shí)驗(yàn)鼠類。其發(fā)病機(jī)制和病理表現(xiàn)上由于自然形成而更貼合人類2型糖尿病腎病的表現(xiàn)。然而由于此類小鼠成本極高，在一定程度上不利于我們實(shí)驗(yàn)的開展。基因工程造模法不僅面臨著造價(jià)高昂的難題，甚至還面臨著巨大的技術(shù)缺口，目前我國的基因類研究的科研水平仍不能保持平均性和廣泛性，因此，基因工程的研究與進(jìn)展也應(yīng)是我們未來科研發(fā)展的重要領(lǐng)域之一。因此，如何通過現(xiàn)有的科學(xué)技術(shù)，更加經(jīng)濟(jì)節(jié)省地創(chuàng)造出更貼合人類發(fā)病機(jī)制的病理模型就成為了我們不斷追求的目標(biāo)。

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（2016-01-14收稿）