近紅外光譜法快速測(cè)定女貞子藥材中女貞苷的含量Δ

張迪文，白 雁，謝彩俠，雷敬衛(wèi)，周琳琳，張 苗（河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，鄭州 450046）

近紅外光譜法快速測(cè)定女貞子藥材中女貞苷的含量Δ

張迪文＊，白 雁，謝彩俠#，雷敬衛(wèi)，周琳琳，張 苗（河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，鄭州 450046）

目的：建立快速測(cè)定女貞子藥材中女貞苷含量的方法。方法：采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定藥材中女貞苷的含量（作為參考值）：色譜柱為Diamonsil C18，流動(dòng)相為乙腈-水（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，柱溫為30Ⅱ，進(jìn)樣量為10 μl。采用偏最小二乘法-近紅外光譜法建立預(yù)測(cè)藥材中女貞苷含量的定量校正模型：根據(jù)HPLC法含量測(cè)定結(jié)果，采集校正集樣品72份、驗(yàn)證集樣品24份，以多元散射校正法聯(lián)合一階導(dǎo)數(shù)法預(yù)處理光譜，最佳波段為9 999.89～4 001.01 cm－1，主成分因子數(shù)為9。結(jié)果：女貞苷含量測(cè)定方法學(xué)考察符合要求。女貞苷含量預(yù)測(cè)的定量校正模型內(nèi)部交叉驗(yàn)證決定系數(shù)為0.984 69，校正均方根偏差為0.097，預(yù)測(cè)均方根偏差為0.100，交叉驗(yàn)證均方根偏差為0.240 13，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：該方法快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、無(wú)破壞、無(wú)污染，可用于女貞子藥材中女貞苷含量的快速測(cè)定。

近紅外光譜法；偏最小二乘法；女貞子；女貞苷；含量

女貞子是木犀科植物女貞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果實(shí)，為一味傳統(tǒng)的扶正固本藥物，具有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)之功效[1]，屬于補(bǔ)益類中藥中的上品。我國(guó)女貞子藥材資源豐富，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其中主要含有三萜類、環(huán)烯醚萜類、黃酮類及苯乙醇苷類等成分，具有調(diào)節(jié)免疫、降血糖、降血脂、抗氧化、抗炎抑菌及保肝等藥理作用[2-4]。女貞苷為環(huán)烯醚萜類中含量較高的成分之一，可以作為女貞子藥材專屬指標(biāo)性成分，用于評(píng)價(jià)其質(zhì)量。女貞苷傳統(tǒng)測(cè)定方法為高效液相色譜法（HPLC），雖然測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確，但其前處理煩瑣復(fù)雜，且化學(xué)試劑污染空氣環(huán)境，測(cè)定過(guò)程較長(zhǎng)。

近紅外光譜（NIR）技術(shù)簡(jiǎn)便、快捷，獲得信息多，對(duì)環(huán)境零污染，具有非破壞性[5]。故本研究以96批不同產(chǎn)地的女貞子藥材為樣品，利用NIR儀采集其NIR，根據(jù)HPLC法含量測(cè)定結(jié)果，建立預(yù)測(cè)其中女貞苷含量的定量校正模型。

1 材料

1.1 儀器

Nicolet 6700型傅里葉變換NIR儀（美國(guó)Thermo公司）；2695型HPLC儀，包括2998檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；SZ-93型自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；ME54E型萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；CPA225D型十萬(wàn)分之一電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；TY-500型超聲波清洗儀（北京天佑恒達(dá)科技有限公司，功率：500 W，頻率：40 kHz）。

1.2 試劑

女貞苷對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-14062606，純度＞98%）；甲醇為色譜純，乙腈為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

女貞子藥材采購(gòu)于四川、湖南、浙江、河南4個(gè)產(chǎn)地，共96批樣品，由河南中醫(yī)學(xué)院董誠(chéng)明教授鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 NIR的采集

取樣品適量，粉碎，過(guò)40目篩，取約5 g粉末置于石英杯中，混合均勻，采用積分球漫反射系統(tǒng)，以空氣為參比，扣除背景采集NIR。采集條件：分辨率為8 cm－1，掃描范圍為12 000～4 000 cm－1，掃描累積次數(shù)為64次，每次掃描背景間隔為20 min，溫度為25～28Ⅱ，相對(duì)濕度為18%～20%。96批樣品的近紅外原始光譜疊加圖見圖1。

圖1 96批樣品的近紅外原始光譜疊加圖Fig 1 The near-infrared reflectance spectra of 96 samples

2.2 女貞苷含量的HPLC法測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～30 min，15%→34%A）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；柱溫：30Ⅱ；進(jìn)樣量：10 μl。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以女貞苷峰計(jì)不少于3 000；各成分基線分離良好，分離度＞1.5，詳見圖2。

圖2 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；1.女貞苷Fig 2 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；1.ligustroflavone

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取女貞苷對(duì)照品1.08 mg，置于50 ml量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，即得女貞苷質(zhì)量濃度為0.021 6 mg/ml的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取樣品粉末0.2 g，精密稱定，置于100 ml錐形瓶中，加甲醇25 ml，超聲處理30 min，處理2次，濾過(guò)，合并濾液至100 ml蒸發(fā)皿中，蒸干，殘?jiān)盟芙獠⒍ㄈ葜?0 ml，搖勻，以0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 方法學(xué)考察 按相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行方法學(xué)試驗(yàn)，結(jié)果表明，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)中女貞苷峰面積的RSD均＜3.0%，表明儀器精密度、溶液穩(wěn)定性、方法重復(fù)性均較好。

2.2.5 樣品含量測(cè)定 取96批樣品各適量，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表1。

2.3 NIR定量校正模型建立與驗(yàn)證

2.3.1 校正集與驗(yàn)證集樣品的選擇 根據(jù)“2.2.5”項(xiàng)下女貞苷含量分布情況，從96批樣品中選取72批組成校正集，用于建立模型；其余24批樣品組成驗(yàn)證集，用于驗(yàn)證模型。選擇原則為驗(yàn)證集樣品女貞苷含量分布范圍應(yīng)包含在校正集樣品女貞苷含量分布范圍之內(nèi)，詳見表2。

2.3.2 光譜預(yù)處理方法的選擇 分別以常數(shù)偏移消除法（COE）、多元散射校正法（MSC）、Savitzky-Golay濾波法（SG）、Norris derivative濾波法（ND）、標(biāo)準(zhǔn)歸一化法（SNV）、一階導(dǎo)數(shù)法（First derivative）、二階導(dǎo)數(shù)法（Second derivative）等[6]方法預(yù)處理光譜，得不同校正集內(nèi)部交叉驗(yàn)證決定系數(shù)（R2）、校正均方根偏差（RMSEC）和預(yù)測(cè)均方?jīng)Q定差（RMSEP），詳見表3。

表1 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，%）Tab 1 Results of contents determination of samples（n＝3，%）

表2 校正集與驗(yàn)證集樣品女貞苷含量分布范圍Tab 2 Distribution ranges of calibration and validation for ligustroflavone content

運(yùn)用TQ Analyst 8.0分析軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)合偏最小二乘法建立NIR定量校正模型。選擇R2、RMSEC、RMSEP為評(píng)價(jià)指標(biāo)，綜合評(píng)價(jià)不同模型的準(zhǔn)確性和適用性。其中，R2越接近1，NIR模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值相關(guān)性越好；RMSEC與RMSEP越接近，且RMSEC略小于RMSEP，所建模型適用性越強(qiáng)，預(yù)測(cè)效果越好[7-8]。結(jié)果表明，以MSC+First derivative預(yù)處理光譜效果最好，可以消除多重光譜偏差。對(duì)導(dǎo)數(shù)光譜進(jìn)行微調(diào)處理，經(jīng)最佳光譜預(yù)處理方法處理后的NIR見圖3。2.3.3 建模波段的選擇 建模波段區(qū)間要求包含樣品的大量信息，同時(shí)要避免冗余信息，降低噪聲干擾[9]。交叉驗(yàn)證均方根偏差（RMSECV）越小，所建模型適用性越強(qiáng)，預(yù)測(cè)效果越好。采用MSC+First derivative對(duì)不同的波段進(jìn)行手動(dòng)優(yōu)化比較，通過(guò)TQ Analyst 8.0分析軟件得到最佳波段范圍為9 999.89～4 001.01 cm－1，詳見表4。

表3 不同光譜預(yù)處理方法對(duì)定量校正模型性能的影響Tab 3 Effects of different pretreatment methods on quantitative model performance

圖3 預(yù)處理后的近紅外光譜Fig 3 The near-infrared spectra after pretreatment

表4 不同波段范圍對(duì)R2和RMSECV的影響Tab 4 Effects of different spectral range on R2and RMSECV

2.3.4 主成分?jǐn)?shù)的選擇 在建模過(guò)程中，采用不同的主成分?jǐn)?shù)，模型的預(yù)測(cè)能力不同，若主成分?jǐn)?shù)太少，建模信息不全，預(yù)測(cè)能力太低；反之，主成分?jǐn)?shù)太多，驗(yàn)證過(guò)程會(huì)出現(xiàn)過(guò)擬合現(xiàn)象[10]。采用內(nèi)部交叉驗(yàn)證考察主成分?jǐn)?shù)對(duì)RMSECV的影響，并作曲線，詳見圖4。結(jié)果表明，當(dāng)偏最小二乘法因子數(shù)為9時(shí)，RMSECV最小，即最佳建模主成分?jǐn)?shù)為9。

圖4 主成分?jǐn)?shù)對(duì)RMSECV的影響Fig 4 Effects of principal component numbers on RMSECV

2.3.5 定量校正模型的建立 運(yùn)用TQ Analyst 8.0分析軟件，以72批校正集樣品NIR為準(zhǔn)，對(duì)光譜采用MSC+First derivative預(yù)處理方法，在9 999.89～4 001.01 cm－1波段范圍，選擇9個(gè)主成分?jǐn)?shù)進(jìn)行建模。結(jié)果，用校正集樣品進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證，R2＝0.984 69，RMSEC＝0.097，RMSEP＝0.100，RMSECV＝0.240 13。女貞苷NIR預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的相關(guān)圖和偏差圖見圖5。由圖5可知，NIR預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的相關(guān)性較高，且結(jié)果很接近，所建模型的性能較好，可以用于女貞子藥材中女貞苷的定量分析。

圖5 女貞苷NIR預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的相關(guān)圖和偏差圖A.相關(guān)圖；B.偏差圖Fig 5 Correlation and deviation between NIR predicted value and content reference value of ligustroflavoneA.correlation；B.deviation

2.3.6 定量校正模型的驗(yàn)證 選擇24批驗(yàn)證集樣品進(jìn)行外部驗(yàn)證。將其NIR輸入定量校正模型，預(yù)測(cè)女貞苷含量，再與實(shí)測(cè)值進(jìn)行比較，結(jié)果見表5。由表5可知，驗(yàn)證集樣品的NIR預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的絕對(duì)誤差不超過(guò)0.13%，相對(duì)誤差為0.50%～5.62%，平均相對(duì)誤差為2.77%，說(shuō)明所建模型具有良好的預(yù)測(cè)能力與適應(yīng)性。將驗(yàn)證集樣品含量實(shí)測(cè)值與NIR預(yù)測(cè)值進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，t＝0.107，P＝0.914＞0.05，按0.05的顯著性水平分析，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)結(jié)果可靠，可用于樣品中女貞苷含量的快速測(cè)定。

表5 24批驗(yàn)證集樣品的NIR定量校正模型預(yù)測(cè)結(jié)果（%）Tab 5 NIR predicted values of 24 validation samples（%）

3 討論

NIR定量校正模型的適用范圍取決于校正集樣品指標(biāo)性成分的含量范圍。本試驗(yàn)收集到的女貞子藥材樣品來(lái)自四川、湖南、浙江、河南等多個(gè)產(chǎn)地，涵蓋范圍較廣且分布較為均勻，具有一定的代表性。因此，所建模型適用性較強(qiáng)，可用于女貞子藥材中指標(biāo)性成分女貞苷的含量預(yù)測(cè)。

本試驗(yàn)運(yùn)用NIR法結(jié)合偏最小二乘法建立了一種快速測(cè)定女貞子藥材中女貞苷含量的新方法。本方法簡(jiǎn)便、快捷，成本較低，獲得信息多，具有非破壞性，并且對(duì)環(huán)境零污染，符合現(xiàn)代中醫(yī)藥科學(xué)發(fā)展的理念，也為女貞子藥材及其制劑的臨床應(yīng)用和質(zhì)量檢驗(yàn)提供了一定的參考。

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Rapid Determination of Ligustroflavone in Fructus ligustri by PLS-NIR Spectroscopy

ZHANG Diwen，BAI Yan，XIE Caixia，LEI Jingwei，ZHOU Linlin，ZHANG Miao（College of Pharmacy，Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450046，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the rapid determination of ligustroflavone in Fructus ligustri.METHODS：HPLC was conducted to determine the content of ligustroflavone（as reference value）：the column was Diamonsil C18with mobile phase of acetonitrile-water（gradient elution）at a flow rate of 1 ml/min，the detection wavelength was 230 nm，column temperature was 30Ⅱand the injection volume was 10 μl.Partial least square（PLS）-near infrared spectroscopy（NIRS）were adopted to establish the quantitative calibration model of ligustroflavone content：according to the determination results of ligustroflavone content，72 samples of calibration set and 24 samples of validation set were collected and pretreated spectrum by multivariate scattering correction（MSC）combined with the First Derivative，the optimized wavelength band was 9 999.89-4 001.01 cm－1and principal component factor number was 9.RESULTS：Methodology validation of content determination for ligustroflavone was in line with the requirement.Internal cross-validation coefficient of the quantitative calibration model for ligustroflavone was 0.984 69，corrected root mean square deviation was 0.097，the root mean square error of predication was 0.100，and the root mean square error of cross validation was 0.240 13.There was no significant different between the predicted value and the measured value.CONCLUSIONS：The method is rapid，accurate，simple without destruction and pollution，and can be used for the rapid determination of ligustroflavone in F.ligustri.

Near-infrared spectroscopy；Partial least square；Fructus ligustri；Ligustroflavone；Content

R917

A

1001-0408（2016）36-5140-04

2016-01-07

2016-04-30）

（編輯：張 靜）

河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（No.15A360010）

＊碩士研究生。研究方向：中藥品質(zhì)的分析、評(píng)價(jià)。E-mail：908625387@qq.com

#通信作者：教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中藥品質(zhì)的分析、評(píng)價(jià)。電話：0371-65962967。E-mail：2590464842@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2016.36.32